骨组织工程研究(Ⅰ)：人成骨细胞培养及成骨特性观察杨德鸿
作者：陈建庭 金大地
单位：第一军医大学南方医院脊柱骨病科，广州，510515
关键词：成骨细胞；细胞培养
骨组织工程研究中图分类号：R742.3
1 实验资料
1.1 成骨细胞分离培养 取流产胎儿颅骨，无菌条件下清除骨板内外软组织；将颅骨剪切成3mm×3mm，TE酶消化20min除去残留软组织，加数滴血清终止胰酶；再将其剪切成1mm×1mm大小，0.5%II型胶原酶(Sigma)连续消化5次，每次20min，各次消化完毕即加入D-Hanks液吹打，收集第三、四、五次所得上清，1200r/min离心5min，沉淀加0.83%NH4Cl孵育10min去红细胞，1200r/min离心5min，沉淀用199基础培养基洗涤一次后计数接种，3d换液一次。细胞长满瓶壁后，TE酶消化，1:2传代。
, 百拇医药
1.2 倒置显微镜观察 原代细胞贴壁前呈均匀一致的球形，48～72h后完全贴壁，呈饱满梭形，未见细胞分泌物，传代周期7d。第二代细胞突起增多，由梭形向鳞片状、进而向星形转化，细胞表面出现颗粒状分泌物。第三代细胞贴壁前体积不均一，多数细胞体积与原代细胞相同。贴壁呈梭形、三角形，少数细胞体积增大，贴壁时先呈盘状，后转化成鳞片形、星形，部分突起较长，如海蛇头样；胞浆内有空泡，细胞分泌物增多出现堆积现象，多在细胞簇中间，呈帽状，慢慢出现黑色颗粒状物，形成结节状，向四周扩展，星形细胞分泌物较多，未见增殖。至第六代，星形、海蛇头样细胞约占细胞总量的40%，细胞分泌旺盛，传代间期约五周，1:1传代接种后多数细胞不能贴壁而死亡,细胞量急剧减少,只有梭形、三角形细胞保留并缓慢增殖。
1.3 瑞氏染色 可见细胞呈梭形、三角形、鳞片形，部分细胞浆内有空泡，细胞突起多少、长短不等，形态各异，有的如锯齿，细胞突起接触。核大、偏位，两个核仁，可见核分裂相。
1.4 McGee-Russell核固红染色 细胞簇中央见片状和块状鲜红染色钙盐颗粒。
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1.5 免疫荧光染色 贴壁细胞经1%多聚甲醛固定10min，兔抗人I型胶原抗体免疫荧光染色，荧光倒置显微镜下可见条索状荧光，表明培养的细胞具有产生I型胶原的特性。
1.6 ALP染色 Gomori法显示细胞浆内褐色的ALP阳性颗粒，原代细胞ALP阳性率2%左右；第五代ALP阳性率约10%；第九代阳性率为20%左右。
2 讨论
2.1 细胞的分离及培养 本实验具备四个特点：(1)操作简便。胚胎颅骨为板层骨，软组织易被剔除，易剪切。(2)两次剪切、分步消化有助于提高细胞的纯度。第一次剪成大块，TE酶消化，可进一步去除软组织，然后进行胶原酶消化，使获得细胞纯度增高。本实验获得的细胞具有形态均一、贴壁时间相对一致的特点。(3)将含成纤维细胞的第一、二次消化所得细胞悬液放弃，以提高细胞纯度。(4)酶消化法比组织移行法具有较高的细胞收集率。
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2.2 成骨细胞的成骨特性 观察到原代培养的细胞贴壁呈饱满梭形，增殖力强，第三代以后，出现增殖力很弱、分泌功能强的鳞片形、星形等多突起不规则细胞，经第六至第八代，增殖力弱的不规则形态细胞死亡，而增殖力强的梭形、三角形、圆形等形态规则细胞生存繁衍。细胞形态由规则的梭形、三角形向鳞片形、星形等不规则形态的顺序变化并最终失去增殖能力体现了细胞成熟演变过程，伴随着细胞分泌趋于活跃、成骨活动的功能酶ALP活性增强，在一定程度上演示了体内成骨细胞的转化过程。同时我们获得的细胞还具有沉积钙盐、分泌I型胶原的特性。I型胶原是形成类骨质的主要成分，在骨质形成过程中由成骨细胞所分泌。类骨质的形成和钙盐沉积是骨形成的重要过程，体外培养细胞在一定程度上模拟了体内骨质形成过程，成为研究骨组织代谢的理想模型。同时，从人体分离培养成骨细胞将为骨组织工程提供可靠的种子细胞，而且从细胞在体外培养过程中表现出的成骨能力。可以预见，只要采用适当的培养方法，人们才可在体外“制造”符合需要的骨块，用以修复大范围骨缺损。
作者简介：杨德鸿，男，1968年出生；硕士；E-mail:yangj@fimmu.edu.cn
(收稿日期：1999-04-21), 百拇医药
单位：第一军医大学南方医院脊柱骨病科，广州，510515
关键词：成骨细胞；细胞培养
骨组织工程研究中图分类号：R742.3
1 实验资料
1.1 成骨细胞分离培养 取流产胎儿颅骨，无菌条件下清除骨板内外软组织；将颅骨剪切成3mm×3mm，TE酶消化20min除去残留软组织，加数滴血清终止胰酶；再将其剪切成1mm×1mm大小，0.5%II型胶原酶(Sigma)连续消化5次，每次20min，各次消化完毕即加入D-Hanks液吹打，收集第三、四、五次所得上清，1200r/min离心5min，沉淀加0.83%NH4Cl孵育10min去红细胞，1200r/min离心5min，沉淀用199基础培养基洗涤一次后计数接种，3d换液一次。细胞长满瓶壁后，TE酶消化，1:2传代。
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1.2 倒置显微镜观察 原代细胞贴壁前呈均匀一致的球形，48～72h后完全贴壁，呈饱满梭形，未见细胞分泌物，传代周期7d。第二代细胞突起增多，由梭形向鳞片状、进而向星形转化，细胞表面出现颗粒状分泌物。第三代细胞贴壁前体积不均一，多数细胞体积与原代细胞相同。贴壁呈梭形、三角形，少数细胞体积增大，贴壁时先呈盘状，后转化成鳞片形、星形，部分突起较长，如海蛇头样；胞浆内有空泡，细胞分泌物增多出现堆积现象，多在细胞簇中间，呈帽状，慢慢出现黑色颗粒状物，形成结节状，向四周扩展，星形细胞分泌物较多，未见增殖。至第六代，星形、海蛇头样细胞约占细胞总量的40%，细胞分泌旺盛，传代间期约五周，1:1传代接种后多数细胞不能贴壁而死亡,细胞量急剧减少,只有梭形、三角形细胞保留并缓慢增殖。
1.3 瑞氏染色 可见细胞呈梭形、三角形、鳞片形，部分细胞浆内有空泡，细胞突起多少、长短不等，形态各异，有的如锯齿，细胞突起接触。核大、偏位，两个核仁，可见核分裂相。
1.4 McGee-Russell核固红染色 细胞簇中央见片状和块状鲜红染色钙盐颗粒。
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1.5 免疫荧光染色 贴壁细胞经1%多聚甲醛固定10min，兔抗人I型胶原抗体免疫荧光染色，荧光倒置显微镜下可见条索状荧光，表明培养的细胞具有产生I型胶原的特性。
1.6 ALP染色 Gomori法显示细胞浆内褐色的ALP阳性颗粒，原代细胞ALP阳性率2%左右；第五代ALP阳性率约10%；第九代阳性率为20%左右。
2 讨论
2.1 细胞的分离及培养 本实验具备四个特点：(1)操作简便。胚胎颅骨为板层骨，软组织易被剔除，易剪切。(2)两次剪切、分步消化有助于提高细胞的纯度。第一次剪成大块，TE酶消化，可进一步去除软组织，然后进行胶原酶消化，使获得细胞纯度增高。本实验获得的细胞具有形态均一、贴壁时间相对一致的特点。(3)将含成纤维细胞的第一、二次消化所得细胞悬液放弃，以提高细胞纯度。(4)酶消化法比组织移行法具有较高的细胞收集率。
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2.2 成骨细胞的成骨特性 观察到原代培养的细胞贴壁呈饱满梭形，增殖力强，第三代以后，出现增殖力很弱、分泌功能强的鳞片形、星形等多突起不规则细胞，经第六至第八代，增殖力弱的不规则形态细胞死亡，而增殖力强的梭形、三角形、圆形等形态规则细胞生存繁衍。细胞形态由规则的梭形、三角形向鳞片形、星形等不规则形态的顺序变化并最终失去增殖能力体现了细胞成熟演变过程，伴随着细胞分泌趋于活跃、成骨活动的功能酶ALP活性增强，在一定程度上演示了体内成骨细胞的转化过程。同时我们获得的细胞还具有沉积钙盐、分泌I型胶原的特性。I型胶原是形成类骨质的主要成分，在骨质形成过程中由成骨细胞所分泌。类骨质的形成和钙盐沉积是骨形成的重要过程，体外培养细胞在一定程度上模拟了体内骨质形成过程，成为研究骨组织代谢的理想模型。同时，从人体分离培养成骨细胞将为骨组织工程提供可靠的种子细胞，而且从细胞在体外培养过程中表现出的成骨能力。可以预见，只要采用适当的培养方法，人们才可在体外“制造”符合需要的骨块，用以修复大范围骨缺损。
作者简介：杨德鸿，男，1968年出生；硕士；E-mail:yangj@fimmu.edu.cn
(收稿日期：1999-04-21), 百拇医药