几种重组干扰素单独及联用阿霉素对骨肉瘤细胞的毒性研究吕海
作者：马学军 金大地 史占军 景宗森
单位：吕 海 金大地 史占军 景宗森(第一军医大学南方医院骨科，广州，510515)；马学军(中国预防医学科学院病毒学研究所基因工程国家重点实验室，北京，100054)
关键词：骨肉瘤；干扰素；MTT比色法
第一军医大学学报990316 摘要：目的 体外评价几种国产干扰素联合阿霉素的抗骨肉瘤活性及其协同效应。方法 采用MTT比色法，体外对比检测阿霉素及几种国内临床常用重组干扰素(rhIFNa 2a、rhIFNa 1b、rhIFNa 1c、rhIFNb 和rhIFNγ)的抗骨肉瘤细胞增殖活性。分别将几种干扰素与阿霉素联合用药，对比检测其抗骨肉瘤的协同作用。结果 rhIFNa 2a为5×104IU/L、rhIFNa 1b为3.75×105 IU/L 、rhIFNa 1c为1.25×105 IU/L、rhIFNb 为5×105 IU/L 时，细胞生长抑制率均达到50%；rhIFNγ对0S732细胞生长无明显抑制作用；rhIFNa 1c与ADM合用时有明显的协同增强效应。结论 rhIFNa 2a、rhIFNa 1b、rhIFNb 、rhIFNa 1c对骨肉瘤细胞的生长有明显的抑制作用，其中以rhIFNa 2a和rhIFNa 1c作用最为明显；上述4种IFNs与阿霉素合用均呈协同增强效应；rhIFNγ在体外对骨肉瘤细胞无明显抑制作用。
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中图分类号：Q571; Q461
Interferons and its synergistic cytotoxicity with adriamycin against osteosarcoma cells in vitro
Lü Hai1, Ma Xuejun2, Jin Dadi1, Shi Zhanjun1, Jing Zongsen1
1Department of Orthopedics, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou, 510515; 2National Key Laboratory of Molecular Virology and Genetic Engineering Institute of Virology, CAPM, Beijing, 100054Abstract: Objective To evaluate the activity and synergistic cytotoxicity of some interferons in combination with adriamycin to osteosarcoma cells in vitro. Methods The cytotoxicity of some interferons (rhIFNa 2a, rhIFNa 1b, rhIFNa 1c, rhIFNb and rhIFNγ) and adriamycin to osteosarcoma cells was assessed by colorimetric MTT test. Each interferon was used in combination with adriamycin. Results Low concentrations of rhIFNa 2a (5×104 IU/L), rhIFNa 1b (3.75×105 IU/L), rhIFNa 1c (1. 25×105IU/L), or rhIFNb (5×105 IU/L) can gain growth inhibition rate of 50% of OS732 while even a high dose (1×106 IU/L) of rhIFNγdid not affect the growth rate of OS732 cells, and rhIFNa 1c significantly enhanced the cytotoxic efficacy of adriamycin. Conclusion rhIFNa 2a, rhIFNa 1b, rhIFNb , rhIFNa 1c have obvious anti-proliferation effect on OS732 cells, and among them, the effect of rhIFNa 2a and rhIFNa 1c were most distinct; all of these four IFNs could enhance the cytotoxic efficacy of adriamycin.
, 百拇医药
Key words: osteosarcoma; interferon; colorimetric MTT test
干扰素(Interferon，IFN)是目前临床用于治疗肿瘤效果最好的一种细胞因子，尤其是其对骨肉瘤(Osteosarcoma, OS)疗效愈来愈得到人们的认可。近年来，大肠杆菌产生的重组IFN以其高纯度、低成本、易生产的特点，在临床的应用越来越广泛。目前国内常用的几种人重组IFN有：rhIFNa 2a、rhIFNa 1b、rhIFNa 1c、rhIFNb 和rhIFNγ。研究IFN的抗骨肉瘤生物学活性，对于其临床应用有着重要的意义，因此，我们将上述几种IFNs及常用抗OS化疗药阿霉素(adriamycin，ADM)应用于OS732细胞上，系统地比较了它们体外抑制OS细胞生长的活性。
1 材料与方法
1.1 材料 OS732细胞(中国人骨肉瘤细胞株)购于北京积水潭医院骨科实验室。人基因工程干扰素a 2a(rhIFNa 2a)购于长春生物制品研究所；人基因工程干扰素a 1b(rhIFNa 1b)购于深圳科兴生物制品公司；人基因工程γ干扰素(rhIFNγ)购于上海生物制品研究所；人基因工程b 干扰素(rhIFNb )、人基因工程干扰素a 1c/86D(rhIFNa 1c/86D)由中国预防医学科学院病毒学研究所基因工程室马学军博士惠赠。IFN滴度均用中国药品生物制品鉴定所提供的IFNa 标准品校正。ADM、MTT(四氮唑蓝)、DMSO(二甲基亚砜)、EDTA购于天象人生物技术公司；1640培养基、胎牛血清(FCS)、胰蛋白酶、Hepes缓冲剂购于GIBCO-BRL公司。
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1.2 方法
1.2.1 细胞的培养 OS732细胞正常增殖、传代时，用含10% FCS的RPMI 1640全培养液培养；为了消除内源激素的影响，优化MTT检测方法，我们在加入IFNs样品时，即将FCS浓度调整为5%，并有时用活性碳(DCC)预处理。
1.2.2 抑制骨肉瘤细胞增殖实验[1,2] 待OS732细胞在24cm2培养瓶中长满单层后，0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA混合液消化，用含5% FCS的RPMI 1640培养基重悬OS732细胞，调整终浓度为2.5×108个/L，接种于96孔培养板，200ml/孔；37℃ 5%CO2培养6 h，以便细胞及其表面受体恢复；分别加入上述IFNs样品，1/4倍比稀释，2×3孔/浓度/样品；37℃ 5%CO2培养84h(用ADM时只培养48h)，每隔24h换液，并加入相同浓度样品；加入MTT 40mg/孔，37℃ 5%CO2培养4h；去上清，加DMSO 100ml/孔，室温放置30min，酶标仪测OD570nm光吸收值。细胞生长抑制率的百分数用下述公式计算：
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细胞抑制率
；A为正常细胞对照组的OD570值；B为上样细胞实验组的OD570值。
2 结果
2.1不同型别IFNs抗骨肉瘤活性比较 采用MTT比色分析法，对比检测上述干扰素体外抑制OS732细胞的分裂增殖活性。结果见图1。图中可见：当rhIFNa 2a为5×104 IU/L、rhIFNa 1b为3.75×105 IU/L 、rhIFNa 1c为1.25×105 IU/L、rhIFNb 为5×105 IU/L时，其对OS732细胞生长抑制率达到50%；而对于rhIFNγ，即使浓度达到1×106 IU/L 时，也未产生明显的抑制0S732细胞生长的作用。为了排除血清内源激素对实验结果的影响，我们同时用经DCC预处理及未经DCC预处理的FCS进行同样实验，结果未发现有显著差异，说明血清中存在的微量激素对本实验没有明显影响。
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图1 5种IFNs对OS732细胞增殖的影响
Fig.1 Cytotoxicity of 5 IFNs to OS732
2.2 不同型别IFNs与阿霉素联合的抗骨肉瘤活性 联合用药时，我们选择5×104 IU/L 的5种IFNs分别与62.5mg/L的ADM联合使用。可以看出，并非所有的IFNs与ADM合用均有协同抗OS效应。其中rhIFNa 2a、rhIFNa 1b、rhIFNa 1c、rhIFNb 与ADM合用时有协同增强抗OS效应；尤其是当rhIFNa 1c与ADM联合使用时，其细胞抑制率由单独使用ADM时的(53.1±6.3)%提高到(87.5±4.0)%，呈明显的协同增强效应。
表1 ADM及其与不同IFNs的协同细胞毒性
Tab.1 Synergistic cytotoxicity of interferons and adriamycin to osteosarcoma cells
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ADM
rhIFNa 2a
rhIFNa 1b
rhIFNa 1c
rhIFNb
Alone
With ADM
Alone
With ADM
Alone
With ADM
Alone
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With ADM
Cytostatic rate
(%)
53.1± 6.3
51.3± 3.7
63.5± 4.2
24.4± 4.7
69.4± 3.6
37.1± 5.1
87.5± 4.0
18.1± 3.2
58.2± 3.7
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3 讨论
骨肉瘤是最常见的恶性骨肿瘤，大多数患者在明确诊断时即已发生了转移。手术治疗的2年存活率是20%，即使再辅以化疗，存活率也只提高到66%[2]。生物治疗是继手术(截肢或保肢)、化疗、放疗三大治疗手段之后，又一种治疗骨肉瘤的重要手段，而IFNs是骨肉瘤生物治疗中最为常用且疗效肯定的一种细胞因子。大量体内、体外实验表明：IFNs对体外培养或裸鼠体内移植的多种骨肉瘤细胞的分裂、增殖，都有明显的抑制作用；同时也发现[3~5]，不同型或亚型的IFNs对不同骨肉瘤细胞的抑制效果也不尽相同；另外，在临床应用中，现在国内常用的IFNs种类繁多，各种IFNs之间的疗效尚无对比。同时，IFNs应用后的副作用限制了其剂量的提高，从而影响了疗效。
为了提高IFNs的临床应用价值，我们采用多个剂量梯度，对比研究了不同干扰素的抗骨肉瘤活性。结果表明，不同型IFNs的抗OS活性并不相同。其中以rhIFN-a 2a和rhIFNa 1c单独应用时的抗骨肉瘤活性较高；而rhIFNγ即使在很高的浓度下，也不能抑制OS732细胞的增殖。结合临床治疗方案，我们还对不同型IFNs与化疗药物ADM的协同作用进行了对比研究，以提高IFNs的临床应用价值。在联合用药时，也并非所有IFNs与ADM合用都呈协同增强效应，其中以rhIFNa 1c的协同增强作用最为明显。不同IFNs及其与ADM联合使用时所显示的不同结果，反映了OS732细胞对不同IFNs的敏感性的差别，这与文献报道相符[4,5]。临床上对每一实体瘤进行个体药敏评估，也许是解决这一问题的有效方法。另外，有文献报道[3]，rhIFNγ的生物活性主要是免疫调节作用，这可能是rhIFNγ体外直接抑制OS732细胞生长活性较低的原因。目前IFNs剂量的常用参照单位为U(IFN抗病毒活性效价)，这一单位是根据IFNs抗肿瘤活性的大小根据细胞病变抑制法而测定的，其大小与IFNs的质量基本成正比。尤为重要的是，现在临床上都是以这一单位来衡量IFNs的用量多少。因此，本实验中，我们仍以此为IFNs用量大小的参照单位。
, 百拇医药
作者简介：吕海，男，1969年出生，1998年毕业于第一军医大学；医学硕士，医师，助教；电话：85141888-87190
参考文献
1 Song LN. Effects of EB1089, a novel 1,25-dihydroxyvitamin D analogue, on proliferation and differentiation of human osteosarcoma cells. Chin J Physiol Sci,1993,14(4):337
2 Jia SF, Kleinerman ES. Antitumor activity of TNF-alpha, IL-1, and IFN-gamma against three human osteosarcoma cell lines. Lymphokine Cytokine Res, 1991, 10(4): 281
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3 范中善，杜 平，屠 瑞等.干扰素的临床应用.北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1996.1～24
4 Harju VT, Alitalo R, Andersson LC .Divergent in vitro effects of recombinant interferons on human osteosarcoma cells.Bone, 1990, 11(4): 247
5 Brosjo O, Bauer HC, Nilsson OS et al. Effect of human interferon-alpha and interferon-gamma on growth, histology, and DNA content of human osteosarcomas in nude mice. J Interferon Res, 1989, 9(4): 475
(收稿日期：1998-11-02), 百拇医药
单位：吕 海 金大地 史占军 景宗森(第一军医大学南方医院骨科，广州，510515)；马学军(中国预防医学科学院病毒学研究所基因工程国家重点实验室，北京，100054)
关键词：骨肉瘤；干扰素；MTT比色法
第一军医大学学报990316 摘要：目的 体外评价几种国产干扰素联合阿霉素的抗骨肉瘤活性及其协同效应。方法 采用MTT比色法，体外对比检测阿霉素及几种国内临床常用重组干扰素(rhIFNa 2a、rhIFNa 1b、rhIFNa 1c、rhIFNb 和rhIFNγ)的抗骨肉瘤细胞增殖活性。分别将几种干扰素与阿霉素联合用药，对比检测其抗骨肉瘤的协同作用。结果 rhIFNa 2a为5×104IU/L、rhIFNa 1b为3.75×105 IU/L 、rhIFNa 1c为1.25×105 IU/L、rhIFNb 为5×105 IU/L 时，细胞生长抑制率均达到50%；rhIFNγ对0S732细胞生长无明显抑制作用；rhIFNa 1c与ADM合用时有明显的协同增强效应。结论 rhIFNa 2a、rhIFNa 1b、rhIFNb 、rhIFNa 1c对骨肉瘤细胞的生长有明显的抑制作用，其中以rhIFNa 2a和rhIFNa 1c作用最为明显；上述4种IFNs与阿霉素合用均呈协同增强效应；rhIFNγ在体外对骨肉瘤细胞无明显抑制作用。
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中图分类号：Q571; Q461
Interferons and its synergistic cytotoxicity with adriamycin against osteosarcoma cells in vitro
Lü Hai1, Ma Xuejun2, Jin Dadi1, Shi Zhanjun1, Jing Zongsen1
1Department of Orthopedics, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou, 510515; 2National Key Laboratory of Molecular Virology and Genetic Engineering Institute of Virology, CAPM, Beijing, 100054Abstract: Objective To evaluate the activity and synergistic cytotoxicity of some interferons in combination with adriamycin to osteosarcoma cells in vitro. Methods The cytotoxicity of some interferons (rhIFNa 2a, rhIFNa 1b, rhIFNa 1c, rhIFNb and rhIFNγ) and adriamycin to osteosarcoma cells was assessed by colorimetric MTT test. Each interferon was used in combination with adriamycin. Results Low concentrations of rhIFNa 2a (5×104 IU/L), rhIFNa 1b (3.75×105 IU/L), rhIFNa 1c (1. 25×105IU/L), or rhIFNb (5×105 IU/L) can gain growth inhibition rate of 50% of OS732 while even a high dose (1×106 IU/L) of rhIFNγdid not affect the growth rate of OS732 cells, and rhIFNa 1c significantly enhanced the cytotoxic efficacy of adriamycin. Conclusion rhIFNa 2a, rhIFNa 1b, rhIFNb , rhIFNa 1c have obvious anti-proliferation effect on OS732 cells, and among them, the effect of rhIFNa 2a and rhIFNa 1c were most distinct; all of these four IFNs could enhance the cytotoxic efficacy of adriamycin.
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Key words: osteosarcoma; interferon; colorimetric MTT test
干扰素(Interferon，IFN)是目前临床用于治疗肿瘤效果最好的一种细胞因子，尤其是其对骨肉瘤(Osteosarcoma, OS)疗效愈来愈得到人们的认可。近年来，大肠杆菌产生的重组IFN以其高纯度、低成本、易生产的特点，在临床的应用越来越广泛。目前国内常用的几种人重组IFN有：rhIFNa 2a、rhIFNa 1b、rhIFNa 1c、rhIFNb 和rhIFNγ。研究IFN的抗骨肉瘤生物学活性，对于其临床应用有着重要的意义，因此，我们将上述几种IFNs及常用抗OS化疗药阿霉素(adriamycin，ADM)应用于OS732细胞上，系统地比较了它们体外抑制OS细胞生长的活性。
1 材料与方法
1.1 材料 OS732细胞(中国人骨肉瘤细胞株)购于北京积水潭医院骨科实验室。人基因工程干扰素a 2a(rhIFNa 2a)购于长春生物制品研究所；人基因工程干扰素a 1b(rhIFNa 1b)购于深圳科兴生物制品公司；人基因工程γ干扰素(rhIFNγ)购于上海生物制品研究所；人基因工程b 干扰素(rhIFNb )、人基因工程干扰素a 1c/86D(rhIFNa 1c/86D)由中国预防医学科学院病毒学研究所基因工程室马学军博士惠赠。IFN滴度均用中国药品生物制品鉴定所提供的IFNa 标准品校正。ADM、MTT(四氮唑蓝)、DMSO(二甲基亚砜)、EDTA购于天象人生物技术公司；1640培养基、胎牛血清(FCS)、胰蛋白酶、Hepes缓冲剂购于GIBCO-BRL公司。
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1.2 方法
1.2.1 细胞的培养 OS732细胞正常增殖、传代时，用含10% FCS的RPMI 1640全培养液培养；为了消除内源激素的影响，优化MTT检测方法，我们在加入IFNs样品时，即将FCS浓度调整为5%，并有时用活性碳(DCC)预处理。
1.2.2 抑制骨肉瘤细胞增殖实验[1,2] 待OS732细胞在24cm2培养瓶中长满单层后，0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA混合液消化，用含5% FCS的RPMI 1640培养基重悬OS732细胞，调整终浓度为2.5×108个/L，接种于96孔培养板，200ml/孔；37℃ 5%CO2培养6 h，以便细胞及其表面受体恢复；分别加入上述IFNs样品，1/4倍比稀释，2×3孔/浓度/样品；37℃ 5%CO2培养84h(用ADM时只培养48h)，每隔24h换液，并加入相同浓度样品；加入MTT 40mg/孔，37℃ 5%CO2培养4h；去上清，加DMSO 100ml/孔，室温放置30min，酶标仪测OD570nm光吸收值。细胞生长抑制率的百分数用下述公式计算：
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细胞抑制率
；A为正常细胞对照组的OD570值；B为上样细胞实验组的OD570值。2 结果
2.1不同型别IFNs抗骨肉瘤活性比较 采用MTT比色分析法，对比检测上述干扰素体外抑制OS732细胞的分裂增殖活性。结果见图1。图中可见：当rhIFNa 2a为5×104 IU/L、rhIFNa 1b为3.75×105 IU/L 、rhIFNa 1c为1.25×105 IU/L、rhIFNb 为5×105 IU/L时，其对OS732细胞生长抑制率达到50%；而对于rhIFNγ，即使浓度达到1×106 IU/L 时，也未产生明显的抑制0S732细胞生长的作用。为了排除血清内源激素对实验结果的影响，我们同时用经DCC预处理及未经DCC预处理的FCS进行同样实验，结果未发现有显著差异，说明血清中存在的微量激素对本实验没有明显影响。
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图1 5种IFNs对OS732细胞增殖的影响
Fig.1 Cytotoxicity of 5 IFNs to OS732
2.2 不同型别IFNs与阿霉素联合的抗骨肉瘤活性 联合用药时，我们选择5×104 IU/L 的5种IFNs分别与62.5mg/L的ADM联合使用。可以看出，并非所有的IFNs与ADM合用均有协同抗OS效应。其中rhIFNa 2a、rhIFNa 1b、rhIFNa 1c、rhIFNb 与ADM合用时有协同增强抗OS效应；尤其是当rhIFNa 1c与ADM联合使用时，其细胞抑制率由单独使用ADM时的(53.1±6.3)%提高到(87.5±4.0)%，呈明显的协同增强效应。
表1 ADM及其与不同IFNs的协同细胞毒性
Tab.1 Synergistic cytotoxicity of interferons and adriamycin to osteosarcoma cells
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ADM
rhIFNa 2a
rhIFNa 1b
rhIFNa 1c
rhIFNb
Alone
With ADM
Alone
With ADM
Alone
With ADM
Alone
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With ADM
Cytostatic rate
(%)
53.1± 6.3
51.3± 3.7
63.5± 4.2
24.4± 4.7
69.4± 3.6
37.1± 5.1
87.5± 4.0
18.1± 3.2
58.2± 3.7
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骨肉瘤是最常见的恶性骨肿瘤，大多数患者在明确诊断时即已发生了转移。手术治疗的2年存活率是20%，即使再辅以化疗，存活率也只提高到66%[2]。生物治疗是继手术(截肢或保肢)、化疗、放疗三大治疗手段之后，又一种治疗骨肉瘤的重要手段，而IFNs是骨肉瘤生物治疗中最为常用且疗效肯定的一种细胞因子。大量体内、体外实验表明：IFNs对体外培养或裸鼠体内移植的多种骨肉瘤细胞的分裂、增殖，都有明显的抑制作用；同时也发现[3~5]，不同型或亚型的IFNs对不同骨肉瘤细胞的抑制效果也不尽相同；另外，在临床应用中，现在国内常用的IFNs种类繁多，各种IFNs之间的疗效尚无对比。同时，IFNs应用后的副作用限制了其剂量的提高，从而影响了疗效。
为了提高IFNs的临床应用价值，我们采用多个剂量梯度，对比研究了不同干扰素的抗骨肉瘤活性。结果表明，不同型IFNs的抗OS活性并不相同。其中以rhIFN-a 2a和rhIFNa 1c单独应用时的抗骨肉瘤活性较高；而rhIFNγ即使在很高的浓度下，也不能抑制OS732细胞的增殖。结合临床治疗方案，我们还对不同型IFNs与化疗药物ADM的协同作用进行了对比研究，以提高IFNs的临床应用价值。在联合用药时，也并非所有IFNs与ADM合用都呈协同增强效应，其中以rhIFNa 1c的协同增强作用最为明显。不同IFNs及其与ADM联合使用时所显示的不同结果，反映了OS732细胞对不同IFNs的敏感性的差别，这与文献报道相符[4,5]。临床上对每一实体瘤进行个体药敏评估，也许是解决这一问题的有效方法。另外，有文献报道[3]，rhIFNγ的生物活性主要是免疫调节作用，这可能是rhIFNγ体外直接抑制OS732细胞生长活性较低的原因。目前IFNs剂量的常用参照单位为U(IFN抗病毒活性效价)，这一单位是根据IFNs抗肿瘤活性的大小根据细胞病变抑制法而测定的，其大小与IFNs的质量基本成正比。尤为重要的是，现在临床上都是以这一单位来衡量IFNs的用量多少。因此，本实验中，我们仍以此为IFNs用量大小的参照单位。
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作者简介：吕海，男，1969年出生，1998年毕业于第一军医大学；医学硕士，医师，助教；电话：85141888-87190
参考文献
1 Song LN. Effects of EB1089, a novel 1,25-dihydroxyvitamin D analogue, on proliferation and differentiation of human osteosarcoma cells. Chin J Physiol Sci,1993,14(4):337
2 Jia SF, Kleinerman ES. Antitumor activity of TNF-alpha, IL-1, and IFN-gamma against three human osteosarcoma cell lines. Lymphokine Cytokine Res, 1991, 10(4): 281
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3 范中善，杜 平，屠 瑞等.干扰素的临床应用.北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1996.1～24
4 Harju VT, Alitalo R, Andersson LC .Divergent in vitro effects of recombinant interferons on human osteosarcoma cells.Bone, 1990, 11(4): 247
5 Brosjo O, Bauer HC, Nilsson OS et al. Effect of human interferon-alpha and interferon-gamma on growth, histology, and DNA content of human osteosarcomas in nude mice. J Interferon Res, 1989, 9(4): 475
(收稿日期：1998-11-02), 百拇医药