头尾串联双拷贝HBV DNA重组体的构建
作者：刘定燮 骆抗先
单位：第一军医大学南方医院感染内科，广州, 510515
关键词：基因重组；乙型肝炎病毒
第一军医大学学报990327 摘要: 为构建含筛选基因并能在转染细胞内建立HBV复制状态的真核表达载体，利用Bam H与Bgl 粘端互补的特点，将经Bam H线性化的HBV DNA(adr亚型)克隆于表达新霉素基因的载体pcDNA3的Bam H 与Bgl 位点间，获得含头尾串联双拷贝HBV基因组的重组质粒。
中图分类号: R394
Construction of recombinant containing two HBV genes in head-to-tail connection
, 百拇医药
Liu Dingxie, Luo Kangxian
Department of Infectious Disease, Nangfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou, 510515
Abstract: Here we report the process of constructing the eukaryotic expression vector which contains screening gene and can establish HBV replication status. The vector pcDNA3 which can express neomycin gene in transfected cells was used in this experiment. HBV DNA (adr subtype) linearized by Bam HI from pADR-1 was inserted between the Bam H and Bgl sites of pcDNA3, and the recombinant plasmid PADR-1 containing one copy of HBV genome was obtained firstly. After PADR-1 was linearized by Bam HI and ligase with another HBV DNA molecule, we got a recombinant containing two copies of HBV genome. Restriction analysis showed that the two HBV DNA molecules in this recombinant are linked in head-to-tail fashion. This recombinant was named PADR-2.
, 百拇医药
Key words: gene recombinant; hepatitis B virus
至今尚无理想的乙型肝炎病毒 (HBV)体外感染的动物及细胞模型，目前多通过HBV DNA的转染细胞模型来研究HBV的增殖、致病机理及筛选抗HBV的药物。由于HBV基因组呈双链闭合环状，且其开放读框分布于全长DNA，因此需含头-尾串联HBV DNA的载体才有可能在转染细胞内建立HBV的复制状态[1]。本文报告了HBV在中国的主要流行株(adr亚型)双拷贝基因组头尾串联于含筛选标志(新霉素基因)质粒载体的克隆流程。
1 材料与方法
1.1 材料 含单拷贝HBV DNA(adr亚型)的质粒pADR-1由上海生化所惠赠。载体pcDNA3为Invitrogen公司构建。DNA连接酶、小牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)购自Promega公司，Taq酶购自Biostar公司，限制性内切酶均为华美公司产品。
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1.2 HBV 基因片段的分离纯化 pADR-1 Bam H酶切完全后，参照文献[2]经V型电泳槽电泳洗脱纯化3.2 kb的HBV全基因组片段。
1.3 pcDNA-3经Bgl 及BamH 双酶切后，参照文献[3]用CIAP对经酶切的载体5'端作去磷酸化，经此处理的产物以1:2的摩尔比与HBV DNA进行连接。质粒pcADR1(Fig.1)经Bam H酶切完全后，也经同样的处理后再与HBV DNA连接。DNA的连接及质粒的转化参照文献[3]。克隆流程如Fig.1所示。
PCR扩增条件参照文献[2]，pcADR1(0.2g/L)
稀释100万倍后以引物C3、C1r扩增。引物序列为：C3：CTGGGAGGAGTTGGGGGAGGAGATT；C1R：GGCGAGGGAGTTCTTCTTCTAGGGG，扩增片段为HBV的核心基因区，扩增产物长658 bp。
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2 结果与讨论
本实验利用Bam H与Bgl 粘端互补的特点，pADR-1中的HBV DNA经Bam H线性化后，再插入到pcDNA-3载体的Bgl 与Bam H位点之间，获得含单拷贝HBV基因的重组体pcADR1 (Fig.1)。由于Bam H与Bgl 粘端补平后将消除此两酶切位点，因此pcADR1中仅有一个Bam H位点，此时再往其内插入Bam H线性化的HBV DNA时可免除对pcADR1作部分酶切的繁琐。pcADR1的酶切及PCR分析结果 (Fig.2)显示，pcADR1被Bam H线性化为7.8kb的片段，另外，Xbal 将pcADR1切成5.6kb及2.1 kb的片段，这均与Dnasis软件分析预测的结果相符。 含头尾串联双拷贝HBV DNA的pcADR2 (Fig.1)应被Bam H 或Hind 线性化为11 kb的片段，Xbal 应将其切为5.6、3.2、2.1 kb的片段，而Bgl 应将其切成7.3、2.8kb的片段，Fig.3所显示的对pcADR2的酶切分析结果与此一致，表明双拷贝的HBV DNA已以头尾串联的方式被克隆至pcDNA3中。
, 百拇医药
图1 质粒pcADR2的构建流程图
Fig.1 Construction of recombinant plasmid of pcADR2
图2 重组质粒pcADR1的限制性酶切及 PCR分析
Fig.2 Restriction and PCR analysis of recombinant Plasmid pcADR1
1:λDNA/Eco R+Hind;2:pcADR2;3:pcADR2/Bam H;4:pcADR1/Xbal;5:以C1r和C3为引物的pcADRI的扩增产物
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图3 重组质粒pcADR2的限制性酶切分析
引物的pcADR1的扩增产物
Fig.3 Restriction analysis of recombinant plasmid pcADR2
1:λDNA/Eco R+Hind ; 2: pcADR1; 3: pcADR1/Bam H ; 4: pcADR2/Hind ; 5: pcADR2/Xbal ; 6: pcADR2/Bgl
作者简介：刘定燮，男，1972年出生；1997年毕业于第一军医大学；硕士，助教；电话：85141944
参考文献
1 骆抗先. 乙型肝炎- 基础与临床. 北京：人民卫生出版社，1997
2 卢圣栋. 现代分子生物学实验技术. 北京:高等教育出版社，1993
3 Sambrook J,Fristch EF,Maniatis T.Molecular Cloning,A Laboratory Manual.2nd ed. Cold Spring Harbor, New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989,332
(收稿日期：1998-09-08), http://www.100md.com
单位：第一军医大学南方医院感染内科，广州, 510515
关键词：基因重组；乙型肝炎病毒
第一军医大学学报990327 摘要: 为构建含筛选基因并能在转染细胞内建立HBV复制状态的真核表达载体，利用Bam H与Bgl 粘端互补的特点，将经Bam H线性化的HBV DNA(adr亚型)克隆于表达新霉素基因的载体pcDNA3的Bam H 与Bgl 位点间，获得含头尾串联双拷贝HBV基因组的重组质粒。
中图分类号: R394
Construction of recombinant containing two HBV genes in head-to-tail connection
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Liu Dingxie, Luo Kangxian
Department of Infectious Disease, Nangfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou, 510515
Abstract: Here we report the process of constructing the eukaryotic expression vector which contains screening gene and can establish HBV replication status. The vector pcDNA3 which can express neomycin gene in transfected cells was used in this experiment. HBV DNA (adr subtype) linearized by Bam HI from pADR-1 was inserted between the Bam H and Bgl sites of pcDNA3, and the recombinant plasmid PADR-1 containing one copy of HBV genome was obtained firstly. After PADR-1 was linearized by Bam HI and ligase with another HBV DNA molecule, we got a recombinant containing two copies of HBV genome. Restriction analysis showed that the two HBV DNA molecules in this recombinant are linked in head-to-tail fashion. This recombinant was named PADR-2.
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Key words: gene recombinant; hepatitis B virus
至今尚无理想的乙型肝炎病毒 (HBV)体外感染的动物及细胞模型，目前多通过HBV DNA的转染细胞模型来研究HBV的增殖、致病机理及筛选抗HBV的药物。由于HBV基因组呈双链闭合环状，且其开放读框分布于全长DNA，因此需含头-尾串联HBV DNA的载体才有可能在转染细胞内建立HBV的复制状态[1]。本文报告了HBV在中国的主要流行株(adr亚型)双拷贝基因组头尾串联于含筛选标志(新霉素基因)质粒载体的克隆流程。
1 材料与方法
1.1 材料 含单拷贝HBV DNA(adr亚型)的质粒pADR-1由上海生化所惠赠。载体pcDNA3为Invitrogen公司构建。DNA连接酶、小牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)购自Promega公司，Taq酶购自Biostar公司，限制性内切酶均为华美公司产品。
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1.2 HBV 基因片段的分离纯化 pADR-1 Bam H酶切完全后，参照文献[2]经V型电泳槽电泳洗脱纯化3.2 kb的HBV全基因组片段。
1.3 pcDNA-3经Bgl 及BamH 双酶切后，参照文献[3]用CIAP对经酶切的载体5'端作去磷酸化，经此处理的产物以1:2的摩尔比与HBV DNA进行连接。质粒pcADR1(Fig.1)经Bam H酶切完全后，也经同样的处理后再与HBV DNA连接。DNA的连接及质粒的转化参照文献[3]。克隆流程如Fig.1所示。
PCR扩增条件参照文献[2]，pcADR1(0.2g/L)
稀释100万倍后以引物C3、C1r扩增。引物序列为：C3：CTGGGAGGAGTTGGGGGAGGAGATT；C1R：GGCGAGGGAGTTCTTCTTCTAGGGG，扩增片段为HBV的核心基因区，扩增产物长658 bp。
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2 结果与讨论
本实验利用Bam H与Bgl 粘端互补的特点，pADR-1中的HBV DNA经Bam H线性化后，再插入到pcDNA-3载体的Bgl 与Bam H位点之间，获得含单拷贝HBV基因的重组体pcADR1 (Fig.1)。由于Bam H与Bgl 粘端补平后将消除此两酶切位点，因此pcADR1中仅有一个Bam H位点，此时再往其内插入Bam H线性化的HBV DNA时可免除对pcADR1作部分酶切的繁琐。pcADR1的酶切及PCR分析结果 (Fig.2)显示，pcADR1被Bam H线性化为7.8kb的片段，另外，Xbal 将pcADR1切成5.6kb及2.1 kb的片段，这均与Dnasis软件分析预测的结果相符。 含头尾串联双拷贝HBV DNA的pcADR2 (Fig.1)应被Bam H 或Hind 线性化为11 kb的片段，Xbal 应将其切为5.6、3.2、2.1 kb的片段，而Bgl 应将其切成7.3、2.8kb的片段，Fig.3所显示的对pcADR2的酶切分析结果与此一致，表明双拷贝的HBV DNA已以头尾串联的方式被克隆至pcDNA3中。
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图1 质粒pcADR2的构建流程图
Fig.1 Construction of recombinant plasmid of pcADR2
图2 重组质粒pcADR1的限制性酶切及 PCR分析
Fig.2 Restriction and PCR analysis of recombinant Plasmid pcADR1
1:λDNA/Eco R+Hind;2:pcADR2;3:pcADR2/Bam H;4:pcADR1/Xbal;5:以C1r和C3为引物的pcADRI的扩增产物
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图3 重组质粒pcADR2的限制性酶切分析
引物的pcADR1的扩增产物
Fig.3 Restriction analysis of recombinant plasmid pcADR2
1:λDNA/Eco R+Hind ; 2: pcADR1; 3: pcADR1/Bam H ; 4: pcADR2/Hind ; 5: pcADR2/Xbal ; 6: pcADR2/Bgl
作者简介：刘定燮，男，1972年出生；1997年毕业于第一军医大学；硕士，助教；电话：85141944
参考文献
1 骆抗先. 乙型肝炎- 基础与临床. 北京：人民卫生出版社，1997
2 卢圣栋. 现代分子生物学实验技术. 北京:高等教育出版社，1993
3 Sambrook J,Fristch EF,Maniatis T.Molecular Cloning,A Laboratory Manual.2nd ed. Cold Spring Harbor, New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989,332
(收稿日期：1998-09-08), http://www.100md.com