尖锐湿疣患者人乳头瘤病毒的快速检测与分型*
作者：齐凤菊 徐 钤 黄杨中
单位：第一军医大学生物化学教研室，广州，510515
关键词：反向点杂交；人乳头瘤病毒；尖锐湿疣
第一军医大学学报990324 摘要：RDB是将我们设计的HPV6B、11、16、18、31、33、35的7个序列特异性寡核苷酸(SSO)探针分别依次固定在尼龙膜上，再与经PCR扩增的DNA靶序列杂交，即可在同一张膜上分辨7型HPVDNA的任一型。我们检测尖锐湿疣患者62例，对其中20例进行组织活检，阳性检出率为95%(19/20)。阳性检出中，HPV6B型8例(40.0%)、HPV11型9例(45.0%)、HPV6B/11型(混合型)2例(10.0%)；对其中42例进行宫颈抹片检测，阳性检出率为92.9%(39/42)。阳性检出中，HPV6B型15例(35.7%)、HPV11型19例(45.2%)、HPV6B/11型3例(7.1%)、HPV16型2例(4.8%)。结果表明尖锐湿疣患者检出HPV总阳性率为94%，感染HPV型主要为HPV6B及11型。
, http://www.100md.com
中图分类号:R737.7
Rapid detection and typing of human papillomavirus in
patients with condyloma acuminate
Qi Fengju, Xu Qian, Huang Yangzhong
Department of Biochemistry, First Military Medical University, Guangzhou, 510515
Abstract: Objective To establish a method for rapid detection and typing of human papillomavirus (HPV) by reverse dot blot (RDB). Methods Seven sequence-specific oligonucleotides of HPV DNA (types 6B, 11, 16, 18, 31, 33 and 35) were used as specific probes and were fixed separately on a strip of nylon membrane, which can be used to hybridize with the PCR-amplified target DNA-sequence, so that we can detect and identify any one of the 7 types of HPV on the same strip of nylon membrane. Results Tissue biopsy was performed in 20 cases of condyloma acuminate with a positive rate of 95%, of which, 8 cases were positive for HPV6B, making up 40.0%; 9 for HPV11, 45.0%; 2 for HPV6B/11 (mixed type), 10.0%. Cervical swab was taken for 42 patients with a positive rate of 92.9%, of which 15 patients (35.7%) were positive for HPV6B, 19 (45.2%) for HPV11, 3 (7.1%) for HPV6B/11, 2 (4.8%) for HPV16. Conclusions The genotypes of the infecting HPV are mainly HPV 6 and 11. RDB hybridization is a simple, rapid, and accurate technique for the detection and typing of HPV.
, 百拇医药
Keywords: reverse dot blot hybridization; human papillomavirus; condyloma acuminate
到目前为止，人乳头瘤病毒(HPV)已被证实有70多型。尖锐湿疣是由其中某些型HPV感染所致的性传播性疾病(STD)。此病传染性强，发病率高。据报道，美国每年新发生的尖锐湿疣患者超过100万人。近年来，本病的发病率在我国亦呈上升趋势。据报道[1.2]，HPV与人的生殖器官恶性肿瘤密切相关。因此快速、准确地诊断HPV的基因型，对于泌尿生殖道肿瘤的早期发现、预防及愈后监测是十分重要的。目前国内外DNA诊断方法虽然不少，但用其诊断未知样品HPV的基因型仍存在一定困难。因为HPV的异质性很大，每鉴定一次往往要把常见的HPV型都筛选一遍才能最后确定。因此，这种检测方法难以被广大的临床工作者采用。为此我们建立了反向点杂交法(RDB)，使基因诊断的程序大大简化，实现了快速、准确鉴定HPV基因型的目的。RDB法检测HPV基因型国内尚未见报道。我们运用本方法检测尖锐湿疣患者62例，报道如下。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 样本的采集与处理尖锐湿疣患者外阴、阴道、肛门周围活检组织20例，宫颈抹片42例，除2例为男性外其余均为女性，年龄25~47岁，平均年龄33.2岁。样本均取自南方医院门诊病人，均经临床病理确诊为尖锐湿疣病(其中8例为手术后复发者)
1.2 组织DNA的提取将活检组织或抹片细胞经生理盐水洗涤后，加入DNA提取液(购自中山医科大学达安基因诊断中心)，煮沸10min，离心，取上清即可。
1.3 PCR引物的制备我们应用3条引物，即GP3、GP4、GP5。GP5为公用引物，其5'已用生物素标记。用GP5和GP4一对引物可扩增HPV6B和11两型的DNA片段。GP5和GP3可扩增HPV16，18、31、33和35五型的DNA片段，各引物的核苷酸序列及扩增DNA片段的长度，见文献[3]。
我们还合成了分别对应于7型HPVDNA的7个序列特异性寡核苷酸(SSO)探针[3]。
, 百拇医药
1.4 RDB方法将7个探针分别依次固定在尼龙膜上再与经PCR扩增的DNA靶序列杂交。经显色后，即可在同一张膜上分辨7型HPVDNA的任一型。HPV阳性呈紫兰色清晰的斑点。详细操作见文献[3]。
2 结果
我们用RDB法取活检组织检查20例，阳性检出率为95%(19/20)，HPV6B型8例(40.0%)，HPV11型9例(45.0%)，HPV6B/11型(混合型)2例(10.0%)。宫颈抹片42例，阳性检出率为92.9%(39/42)，HPV6B型15例(35.7%)，HPV11型19例(45.2%)，HPV6B/11型3例(7.1%)，HPV16型2例(4.8%)结果表明尖锐湿疣患者感染主要为HPV6B型和HPV11型两型，见表1。
表1 尖锐湿疣患者HPV感染的RDB法检测结果
Tab.1 Detection of HPV DNA in patients with condyloma acuminate by RDB technique Sample
, http://www.100md.com
n
NO.Ofpositivecases(%)
Negative cases
HPV6B
HPV11
HPV6B/11*
HPV16
Total
Biopsytissue
20
8(40.0%)
9(45.0%)
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2(10.0%)
19(95.0%)
1
Cervicalswab
42
15(35.7%)
19(45.2%)
3(7.1%)
2(4.8%)
39(92.9%)
3
*mixedtype
, 百拇医药
3 讨论
HPV是DNA病毒，属于乳多空泡病毒科，到目前已发现有70多型。其中20余型和人的皮肤，粘膜病损相关。HPV6、11、16、18、31、33、35型均与生殖道病损相关。1992年11月在广州召开的尖锐湿疣专题坐谈会上有不少学者报告尖锐湿疣以HPV6B、HPV11型感染为主，阳性率高达90%以上。我们用RDB法检测尖锐湿疣样本62例，总阳性率为94.0%。
许多组织学及分子生物学研究证实HPV6B、11型引起生殖器疣，发病率高、传染性强，在性传播疾病中最常见。有报道[4]夫妇双方交互感染的机会占60%左右，[5]在配偶中病毒类型一致的占87%。但尖锐湿疣疾病很少转变为癌，故属低危型；而HPV16、18型则与宫颈癌和癌前病变密切相关，称为高危型；HPV31、33、35型也与癌形成有关，但发病率低，为中危型[6]。因此，HPV的分型，对于性感染的流行病学研究和防治以及对宫颈癌的预防早期发现及愈后监测具有重要意义。
, http://www.100md.com
我们建立的RDB法检测HPV基因型有以下优点：(1)RDB法的特点是将多种探针固定在一条膜上，同时参与检测的样品DNA又互不干扰，故能一次性筛查多种不同的序列，而不是象传统的杂交法一次只能检测一种未知序列。RDB法既简便又省时间、省试剂，送检样本当日即可报告结果。(2)我们设计的7个探针分别对应于该7型HPVDNA中被扩增片段的一部分，互相不能交叉杂交，不易发生假阳性和假阴性反应，特异性好。(3)采用非同位素标记，应用安全可靠，工作人员亦免受同位素损伤。(4)RDB法是一种简单、快速、敏感、特异的检测方法，适合于临床医务工作者的应用及推广。
*广东省自然科学基金资助项目(940294)
作者简介：齐凤菊，女，1942年出生；高级实验师；电话：85148356
参考文献
1 徐钤，齐凤菊.人乳头瘤病毒E6E7蛋白在子宫颈癌细胞内的定位.生物化学与生物物理进展，1993,20(2):108
, http://www.100md.com
2 Smotkin D. Human Papillomavirus deoxyribonucleic acid in adeno carcinoma and adenosquamous carcinoma of the uterine cervix. Obstet Gynecol, 1986, 63:241
3 齐凤菊，徐钤，黄扬中等.等反向点杂交法快速检测HPV基因型的临床应用.生物化学生物物理进展，1998,25(1)：75
4 Leivine RU. Carvical papillomavirus infection and intraepithelial ncoplasia:a study of male sexual partners.Obstet Gynecol, 1984,64:16.
5 Schncider A. Subclinical human papillomavirus infections in male sexual partners of female carriers .J Urol, 1988m140:1431
6 Robert JK, MarKH S, Wayne DL. Analysis of individual HPV types in cervical neoplasia:A possible role for type18 in rapid progression. Am J Obstet Gynecol, 1985, 159:293.
(收稿日期：1998-07-16), 百拇医药
单位：第一军医大学生物化学教研室，广州，510515
关键词：反向点杂交；人乳头瘤病毒；尖锐湿疣
第一军医大学学报990324 摘要：RDB是将我们设计的HPV6B、11、16、18、31、33、35的7个序列特异性寡核苷酸(SSO)探针分别依次固定在尼龙膜上，再与经PCR扩增的DNA靶序列杂交，即可在同一张膜上分辨7型HPVDNA的任一型。我们检测尖锐湿疣患者62例，对其中20例进行组织活检，阳性检出率为95%(19/20)。阳性检出中，HPV6B型8例(40.0%)、HPV11型9例(45.0%)、HPV6B/11型(混合型)2例(10.0%)；对其中42例进行宫颈抹片检测，阳性检出率为92.9%(39/42)。阳性检出中，HPV6B型15例(35.7%)、HPV11型19例(45.2%)、HPV6B/11型3例(7.1%)、HPV16型2例(4.8%)。结果表明尖锐湿疣患者检出HPV总阳性率为94%，感染HPV型主要为HPV6B及11型。
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中图分类号:R737.7
Rapid detection and typing of human papillomavirus in
patients with condyloma acuminate
Qi Fengju, Xu Qian, Huang Yangzhong
Department of Biochemistry, First Military Medical University, Guangzhou, 510515
Abstract: Objective To establish a method for rapid detection and typing of human papillomavirus (HPV) by reverse dot blot (RDB). Methods Seven sequence-specific oligonucleotides of HPV DNA (types 6B, 11, 16, 18, 31, 33 and 35) were used as specific probes and were fixed separately on a strip of nylon membrane, which can be used to hybridize with the PCR-amplified target DNA-sequence, so that we can detect and identify any one of the 7 types of HPV on the same strip of nylon membrane. Results Tissue biopsy was performed in 20 cases of condyloma acuminate with a positive rate of 95%, of which, 8 cases were positive for HPV6B, making up 40.0%; 9 for HPV11, 45.0%; 2 for HPV6B/11 (mixed type), 10.0%. Cervical swab was taken for 42 patients with a positive rate of 92.9%, of which 15 patients (35.7%) were positive for HPV6B, 19 (45.2%) for HPV11, 3 (7.1%) for HPV6B/11, 2 (4.8%) for HPV16. Conclusions The genotypes of the infecting HPV are mainly HPV 6 and 11. RDB hybridization is a simple, rapid, and accurate technique for the detection and typing of HPV.
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Keywords: reverse dot blot hybridization; human papillomavirus; condyloma acuminate
到目前为止，人乳头瘤病毒(HPV)已被证实有70多型。尖锐湿疣是由其中某些型HPV感染所致的性传播性疾病(STD)。此病传染性强，发病率高。据报道，美国每年新发生的尖锐湿疣患者超过100万人。近年来，本病的发病率在我国亦呈上升趋势。据报道[1.2]，HPV与人的生殖器官恶性肿瘤密切相关。因此快速、准确地诊断HPV的基因型，对于泌尿生殖道肿瘤的早期发现、预防及愈后监测是十分重要的。目前国内外DNA诊断方法虽然不少，但用其诊断未知样品HPV的基因型仍存在一定困难。因为HPV的异质性很大，每鉴定一次往往要把常见的HPV型都筛选一遍才能最后确定。因此，这种检测方法难以被广大的临床工作者采用。为此我们建立了反向点杂交法(RDB)，使基因诊断的程序大大简化，实现了快速、准确鉴定HPV基因型的目的。RDB法检测HPV基因型国内尚未见报道。我们运用本方法检测尖锐湿疣患者62例，报道如下。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 样本的采集与处理尖锐湿疣患者外阴、阴道、肛门周围活检组织20例，宫颈抹片42例，除2例为男性外其余均为女性，年龄25~47岁，平均年龄33.2岁。样本均取自南方医院门诊病人，均经临床病理确诊为尖锐湿疣病(其中8例为手术后复发者)
1.2 组织DNA的提取将活检组织或抹片细胞经生理盐水洗涤后，加入DNA提取液(购自中山医科大学达安基因诊断中心)，煮沸10min，离心，取上清即可。
1.3 PCR引物的制备我们应用3条引物，即GP3、GP4、GP5。GP5为公用引物，其5'已用生物素标记。用GP5和GP4一对引物可扩增HPV6B和11两型的DNA片段。GP5和GP3可扩增HPV16，18、31、33和35五型的DNA片段，各引物的核苷酸序列及扩增DNA片段的长度，见文献[3]。
我们还合成了分别对应于7型HPVDNA的7个序列特异性寡核苷酸(SSO)探针[3]。
, 百拇医药
1.4 RDB方法将7个探针分别依次固定在尼龙膜上再与经PCR扩增的DNA靶序列杂交。经显色后，即可在同一张膜上分辨7型HPVDNA的任一型。HPV阳性呈紫兰色清晰的斑点。详细操作见文献[3]。
2 结果
我们用RDB法取活检组织检查20例，阳性检出率为95%(19/20)，HPV6B型8例(40.0%)，HPV11型9例(45.0%)，HPV6B/11型(混合型)2例(10.0%)。宫颈抹片42例，阳性检出率为92.9%(39/42)，HPV6B型15例(35.7%)，HPV11型19例(45.2%)，HPV6B/11型3例(7.1%)，HPV16型2例(4.8%)结果表明尖锐湿疣患者感染主要为HPV6B型和HPV11型两型，见表1。
表1 尖锐湿疣患者HPV感染的RDB法检测结果
Tab.1 Detection of HPV DNA in patients with condyloma acuminate by RDB technique Sample
, http://www.100md.com
n
NO.Ofpositivecases(%)
Negative cases
HPV6B
HPV11
HPV6B/11*
HPV16
Total
Biopsytissue
20
8(40.0%)
9(45.0%)
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2(10.0%)
19(95.0%)
1
Cervicalswab
42
15(35.7%)
19(45.2%)
3(7.1%)
2(4.8%)
39(92.9%)
3
*mixedtype
, 百拇医药
3 讨论
HPV是DNA病毒，属于乳多空泡病毒科，到目前已发现有70多型。其中20余型和人的皮肤，粘膜病损相关。HPV6、11、16、18、31、33、35型均与生殖道病损相关。1992年11月在广州召开的尖锐湿疣专题坐谈会上有不少学者报告尖锐湿疣以HPV6B、HPV11型感染为主，阳性率高达90%以上。我们用RDB法检测尖锐湿疣样本62例，总阳性率为94.0%。
许多组织学及分子生物学研究证实HPV6B、11型引起生殖器疣，发病率高、传染性强，在性传播疾病中最常见。有报道[4]夫妇双方交互感染的机会占60%左右，[5]在配偶中病毒类型一致的占87%。但尖锐湿疣疾病很少转变为癌，故属低危型；而HPV16、18型则与宫颈癌和癌前病变密切相关，称为高危型；HPV31、33、35型也与癌形成有关，但发病率低，为中危型[6]。因此，HPV的分型，对于性感染的流行病学研究和防治以及对宫颈癌的预防早期发现及愈后监测具有重要意义。
, http://www.100md.com
我们建立的RDB法检测HPV基因型有以下优点：(1)RDB法的特点是将多种探针固定在一条膜上，同时参与检测的样品DNA又互不干扰，故能一次性筛查多种不同的序列，而不是象传统的杂交法一次只能检测一种未知序列。RDB法既简便又省时间、省试剂，送检样本当日即可报告结果。(2)我们设计的7个探针分别对应于该7型HPVDNA中被扩增片段的一部分，互相不能交叉杂交，不易发生假阳性和假阴性反应，特异性好。(3)采用非同位素标记，应用安全可靠，工作人员亦免受同位素损伤。(4)RDB法是一种简单、快速、敏感、特异的检测方法，适合于临床医务工作者的应用及推广。
*广东省自然科学基金资助项目(940294)
作者简介：齐凤菊，女，1942年出生；高级实验师；电话：85148356
参考文献
1 徐钤，齐凤菊.人乳头瘤病毒E6E7蛋白在子宫颈癌细胞内的定位.生物化学与生物物理进展，1993,20(2):108
, http://www.100md.com
2 Smotkin D. Human Papillomavirus deoxyribonucleic acid in adeno carcinoma and adenosquamous carcinoma of the uterine cervix. Obstet Gynecol, 1986, 63:241
3 齐凤菊，徐钤，黄扬中等.等反向点杂交法快速检测HPV基因型的临床应用.生物化学生物物理进展，1998,25(1)：75
4 Leivine RU. Carvical papillomavirus infection and intraepithelial ncoplasia:a study of male sexual partners.Obstet Gynecol, 1984,64:16.
5 Schncider A. Subclinical human papillomavirus infections in male sexual partners of female carriers .J Urol, 1988m140:1431
6 Robert JK, MarKH S, Wayne DL. Analysis of individual HPV types in cervical neoplasia:A possible role for type18 in rapid progression. Am J Obstet Gynecol, 1985, 159:293.
(收稿日期：1998-07-16), 百拇医药