聚合酶链反应检测老年人急性白血病IgH基因重排的意义*
作者：徐 兵 周淑芸 张 剑
单位：第一军医大学南方医院血液科，广州，510515
关键词：急性白血病；基因重排；聚合酶链反应
第一军医大学学报990307 摘要：目的 为进一步了解老年人急性白血病的分子生物学特征。方法 应用聚合酶链反应(PCR)检测28例老年人急性白血病免疫球蛋白重链(IgH)基因重排 结果 66.7% (4/6)老年人急性淋巴细胞白血病(ALL)和40.9% (9/22)急性非淋巴细胞白血病(ANLL)存在IgH基因重排；IgH基因重排阳性老年人ANLL治疗缓解率(22.2%)显著低于IgH基因重排阴性老年人ANLL(66.7%) (P<0.05)。结论 应用PCR技术检测老年人急性白血病基因重排可帮助了解老年人白血病的分子生物学特征和预后,此方面尚需进一步研究。
中图分类号：R733.71
, 百拇医药
The detection of gene rearrangement of acute leukemia in the
elderly and its significance
Xu Bing, Zhou Shuyun, Zhang Jian
Department of Hematology, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou, 510515
Abstract: Objective To get insight of molecular biological characteristics of acute leukemia in the elderly. Methods ploymerase chain reaction (PCR) was used to detect immunolglobulin heavy chain (IgH) gene rearrangement in 28 elderly acute leukemia cases. Results 66.7%(4/6) elderly aucte lymphoblastic leukemia (ALL) cases and 40.9% (9/22) elderly acute nonlymphoblastic leukemia (ANLL) cases were found to have IgH gene rearrangement, the remission rate was higher in the elderly ANLL patient without IgH gene rearrangement (66.7%) than in the elderly ANLL patient with IgH gene rearrangement (22.2%). Conclusions The detection of IgH gene rearrangement by PCR amplification may be helpful in the study of the molecular biological characteristics and prognosis of acute leukemia in elder patient, which needs to be further studied.
, 百拇医药
Key words: acute leukemia; gene rearrangement; ploymerase chain reaction
近年来老年白血病构成比逐年上升，尤其是老年人急性非淋巴细胞白血病(ANLL)约占所有ANLL 病例的40%，老年白血病已成为血液病研究的一个重点。为进一步了解老年人急性白血病的分子生物学特点，采用聚合酶链反应技术检测28例老年人急性白血病免疫球蛋白重链(IgH)基因重排。
1 对象和方法
1.1 病例 28例经形态学、组化和免疫学确诊的急性白血病患者，男性19例，女性9例。 平均年龄64.1岁(60~73岁)。其中急性淋巴细胞白血病(ALL)6例，急性非淋巴细胞白血病(ANLL)22例。6例ALL的免疫学分型为B-ALL 4例、T-ALL 2例；形态学分型为ALL-L2型4例，ALL- L3型2例。22 例ANLL的FAB分型为M2 7例、M3 2例、M4 3例、M5 9例、 M6 1例，其中8例有明确MDS病史。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 寡核苷酸引物选择 根据PCR引物设计原则，设计两条分别针对IgH CDR-Ⅲ区域V区和J区的共同保守序列的引物A和B，引物序列如下：
A: 5'-ACACGGCCGTGTATTACTGT-3'
B: 5'-ACCTGAGGAGACGGTGACC-3'
1.2.2 DNA提取 根据外周血白细胞数目酌情抽取病人骨髓或外周血肝素抗凝标本，用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，裂解缓冲液(0.32mol/L蔗糖，10mmol/L Tris-HCl，5mmol/L MgCl2，1%Triton X-100)破坏残留的红细胞，离心弃上清，PCR缓冲液W/非离子去污剂(50mmol/L KCl，10 mmol/L Tris-HCl，2.5mol/L MgCl2，0.45%NP40，0.1g/L白明胶，0.45%吐温20)重悬细胞沉淀，加入蛋白酶K(约6×106个细胞加入浓度10g/L蛋白酶K 1ml)，55℃保温1h，95℃10min灭活蛋白酶，饱和苯酚及氯仿/异戌醇抽提后抽取上清用无水乙醇沉淀冻存备用。
, http://www.100md.com
1.2.3 PCR循环及产物检测 2mmol/L dNTP 2ml，10×PCR buffer 2ml，A、B引物各 10mmol/L，Taq酶0.5U，总反应体积20ml，94 ℃变性40s，55℃退火30s，72 ℃延伸30s，30 周期后72℃延伸10min，取扩增产物6ml，2.5%琼脂糖凝胶，TBE中电泳，EB染色，紫外灯下观察结果。
2 结果
2.1 ALL病人IgH基因重排检测结果 6例ALL经PCR扩增后，4例在110 bp上下可见特异性扩增带，阳性率为66.7%，其中B-ALL阳性率为75% (3/4)，T-ALL阳性率为50% (1/2)。4例IgH基因重排病人ALL中L2型和L3型各2例。同期检测46例非老年人ALL病人IgH基因重排，阳性率为73.9%。老年组和非老年组ALL病人IgH基因重排阳性率无显著差异(P>0.05)。
2.2 ANLL病人IgH基因重排的检测结果 22例ANLL病经PCR扩增后9例在110 bP 上下可发现阳性扩增带，阳性率为40.9%。9例IgH基因重排阳性病人中M2 3例(42.8%)，M4 1例(33.3%)，M5 5例(55.6%)，各FAB亚型之间阳性率无显著差异。同期检测41例非老年人ANLL病人，IgH基因重排阳性率为17.1%(7/41)，老年人ANLLIgH基因重排阳性率显著高于非老年组ANLL(P<0.05)。
, 百拇医药
2.3 基因重排与临床预后关系 追踪观察21例ANLL经HA方案(三尖杉酯硷联合阿糖胞苷)方案及小剂量阿糖胞苷治疗后转归，结果显示9例IgH基因重排阳性病人化疗后1例获完全缓解(CR)，1例获部分缓解(PR)，CR率为11.1%，总有效率为22.2%(2/9)，而12例IgH基因重排阴性病人治疗后CR4例，PR4例，CR率33.3%，总有效率66.7%。IgH 基因重排阳性病人化疗总有效率显著低于重排基因阴性病人(P<0.05),虽然IgH基因重排阳性病人CR率也明显低于IgH基因重排病人，但统计学处理无显著差异，可能与例数过少有关。
3 讨论
多能造血干细胞向B淋巴系定向分化时可发生IgH特异性基因重排，因此，重排的IgH 基因可作为B淋巴系克隆的基因标志。随Southern杂交及PCR等分子生物学技术在白血病研究中应用， 白血病的分型也由一般形态学和单抗免疫学分型进入基因分型水平，我们应用PCR技术检测老年人ALL病人IgH基因重排，结果显示75% B-ALL存在IgH基因重排,进一步证实该重排为B淋巴系克隆的特异性标志。理论上所有B细胞起源的恶性肿瘤都应具有IgH基因重排,但实际应用PCR技术进行临床检测中仅80%左右病人显阳性结果，即20%左右病人存在假阴性现象。 假阴性产生原因可分技术学和生物学因素。前者主要是引物匹配性差异和各种循环参数的影响;生物学因素包括IgH基因位点发生易位、IgH基因发生不完全重排及重排基因方式发生变化等[1]。 应用目前的检测技术想完全克服假阴性尚不可能，故进行临床分析时应考虑此因素在内。
, 百拇医药
一般认为IgH基因重排为B-淋巴系肿瘤特异性基因标志，因此T-ALL及ANLL 应不具有此基因重排，但近年来国外文献报道[2,3]应用Southern杂交及PCR技术发现部分T-ALL和ANLL病人也存在IgH基因重排。我们研究结果显示40.9%老年人ANLL中发现IgH基因重排， 与国外文献报道一致。目前认为此现象与这部分病人的白血病起源于较早期多能干细胞或“淋髓前体细胞”水平有关，它可同时表达几种细胞序列的标志，随细胞的定向分化，这种重排仍然存在；此外，还可导致在部分ANLL病人中尚存在淋巴系的寡/亚克隆。我们研究结果显示老年人ANLL病人IgH基因重排阳性率显著高于非老年人组(P<0.05)，此现象可能与老年ANLL中有MDS病史比例较高有关。目前大量证据表明MDS是由一个异常造血干细胞衍生的恶性克隆发展而来的克隆性疾病，因此，这部分病人转化为白血病后其白血病起源也为造血干细胞水平，较易发生基因重排。
目前老年人急性白血病的CR率显著低于青壮年(20～40岁)，而老年人白血病死亡率为20/10万，显著高于青壮年白血病的死亡率[4]。老年人急性白血病CR率低，预后差主要原因与年龄大，免疫力差，治疗合并症多,心肺和造血功能差等因素有关。此外，老年人白血病细胞抗药性存在也是导致治疗失败的一个重要因素，而这种原发性耐药有其内在的分子生物学基础。老年人急性白血病常伴5号和7号染色体异常，且老年人ANLL病人合并MDS病史者显著高于青壮年ANLL，而这二种情况是白血病预后不良的重要因素。此外，随分子生物学进展,目前发现白血病细胞克隆的细胞周期时间与年龄存在相关性，老年ANLL 的白血病细胞多处于更不成熟的造血干细胞或造血祖细胞阶段，而青年ANLL白血病细胞处于较晚期祖细胞。我们研究显示老年人ANLL病人IgH基因重排阳性率显著高于非老年组ANLL，也支持上述观点[5]。结果还显示IgH基因重排阳性老年人ANLL治疗有效率明显低于IgH基因重排阴性老年人ANLL，其机制可能也与 IgH 基因重排阳性老年人ANLL的白血病起源较早期造血干细胞水平，治疗较困难有关。但也不能除外IgH基因重排阳性老年人ANLL例数少及随机性因素,尚需扩大病例数进行系统观察。总之，应用分子生物学技术检测老年人急性白血病的基因重排可帮助了解老年人急性白血病的分子生物学特征和预后， 此方面研究尚需进一步深入。
, 百拇医药
*广东省自然科学基金资助项目 (No.960346)
作者简介：徐兵，男，1966年出生；1988年毕业于第一军医大学 ；讲师，硕士； 电话：85147901
参考文献
1 徐 兵，周淑芸. PCR技术检测B-淋巴系肿瘤IgH重排基因的进展.国外医学输血及血液学分册,1995;18(3):159
2 Coorha R, Bunin N, Mino J et al. Provocative pattern of rearrangementsof the genes for the r and b chains of the T cell receptor in human leuke mia.Proc Natl Acad Sci USA, 1987, 84:4547
3 Schmeter HM, Gerhartz HH. Acute myeloid leukemia (AML) can be oli goclonal. Leukemia,1993,7:1965
4 上海市白血病协作组. 上海地区老年急性白血病417例回顾性研究. 中 华血液学杂志,1998,19(1):3
5 艾辉胜，罗荣城，乐晓锋主编. 现代白血病学. 北京：人民军医出版社, 1997. 207～209
(收稿日期：1998-11-18), 百拇医药
单位：第一军医大学南方医院血液科，广州，510515
关键词：急性白血病；基因重排；聚合酶链反应
第一军医大学学报990307 摘要：目的 为进一步了解老年人急性白血病的分子生物学特征。方法 应用聚合酶链反应(PCR)检测28例老年人急性白血病免疫球蛋白重链(IgH)基因重排 结果 66.7% (4/6)老年人急性淋巴细胞白血病(ALL)和40.9% (9/22)急性非淋巴细胞白血病(ANLL)存在IgH基因重排；IgH基因重排阳性老年人ANLL治疗缓解率(22.2%)显著低于IgH基因重排阴性老年人ANLL(66.7%) (P<0.05)。结论 应用PCR技术检测老年人急性白血病基因重排可帮助了解老年人白血病的分子生物学特征和预后,此方面尚需进一步研究。
中图分类号：R733.71
, 百拇医药
The detection of gene rearrangement of acute leukemia in the
elderly and its significance
Xu Bing, Zhou Shuyun, Zhang Jian
Department of Hematology, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou, 510515
Abstract: Objective To get insight of molecular biological characteristics of acute leukemia in the elderly. Methods ploymerase chain reaction (PCR) was used to detect immunolglobulin heavy chain (IgH) gene rearrangement in 28 elderly acute leukemia cases. Results 66.7%(4/6) elderly aucte lymphoblastic leukemia (ALL) cases and 40.9% (9/22) elderly acute nonlymphoblastic leukemia (ANLL) cases were found to have IgH gene rearrangement, the remission rate was higher in the elderly ANLL patient without IgH gene rearrangement (66.7%) than in the elderly ANLL patient with IgH gene rearrangement (22.2%). Conclusions The detection of IgH gene rearrangement by PCR amplification may be helpful in the study of the molecular biological characteristics and prognosis of acute leukemia in elder patient, which needs to be further studied.
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Key words: acute leukemia; gene rearrangement; ploymerase chain reaction
近年来老年白血病构成比逐年上升，尤其是老年人急性非淋巴细胞白血病(ANLL)约占所有ANLL 病例的40%，老年白血病已成为血液病研究的一个重点。为进一步了解老年人急性白血病的分子生物学特点，采用聚合酶链反应技术检测28例老年人急性白血病免疫球蛋白重链(IgH)基因重排。
1 对象和方法
1.1 病例 28例经形态学、组化和免疫学确诊的急性白血病患者，男性19例，女性9例。 平均年龄64.1岁(60~73岁)。其中急性淋巴细胞白血病(ALL)6例，急性非淋巴细胞白血病(ANLL)22例。6例ALL的免疫学分型为B-ALL 4例、T-ALL 2例；形态学分型为ALL-L2型4例，ALL- L3型2例。22 例ANLL的FAB分型为M2 7例、M3 2例、M4 3例、M5 9例、 M6 1例，其中8例有明确MDS病史。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 寡核苷酸引物选择 根据PCR引物设计原则，设计两条分别针对IgH CDR-Ⅲ区域V区和J区的共同保守序列的引物A和B，引物序列如下：
A: 5'-ACACGGCCGTGTATTACTGT-3'
B: 5'-ACCTGAGGAGACGGTGACC-3'
1.2.2 DNA提取 根据外周血白细胞数目酌情抽取病人骨髓或外周血肝素抗凝标本，用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，裂解缓冲液(0.32mol/L蔗糖，10mmol/L Tris-HCl，5mmol/L MgCl2，1%Triton X-100)破坏残留的红细胞，离心弃上清，PCR缓冲液W/非离子去污剂(50mmol/L KCl，10 mmol/L Tris-HCl，2.5mol/L MgCl2，0.45%NP40，0.1g/L白明胶，0.45%吐温20)重悬细胞沉淀，加入蛋白酶K(约6×106个细胞加入浓度10g/L蛋白酶K 1ml)，55℃保温1h，95℃10min灭活蛋白酶，饱和苯酚及氯仿/异戌醇抽提后抽取上清用无水乙醇沉淀冻存备用。
, http://www.100md.com
1.2.3 PCR循环及产物检测 2mmol/L dNTP 2ml，10×PCR buffer 2ml，A、B引物各 10mmol/L，Taq酶0.5U，总反应体积20ml，94 ℃变性40s，55℃退火30s，72 ℃延伸30s，30 周期后72℃延伸10min，取扩增产物6ml，2.5%琼脂糖凝胶，TBE中电泳，EB染色，紫外灯下观察结果。
2 结果
2.1 ALL病人IgH基因重排检测结果 6例ALL经PCR扩增后，4例在110 bp上下可见特异性扩增带，阳性率为66.7%，其中B-ALL阳性率为75% (3/4)，T-ALL阳性率为50% (1/2)。4例IgH基因重排病人ALL中L2型和L3型各2例。同期检测46例非老年人ALL病人IgH基因重排，阳性率为73.9%。老年组和非老年组ALL病人IgH基因重排阳性率无显著差异(P>0.05)。
2.2 ANLL病人IgH基因重排的检测结果 22例ANLL病经PCR扩增后9例在110 bP 上下可发现阳性扩增带，阳性率为40.9%。9例IgH基因重排阳性病人中M2 3例(42.8%)，M4 1例(33.3%)，M5 5例(55.6%)，各FAB亚型之间阳性率无显著差异。同期检测41例非老年人ANLL病人，IgH基因重排阳性率为17.1%(7/41)，老年人ANLLIgH基因重排阳性率显著高于非老年组ANLL(P<0.05)。
, 百拇医药
2.3 基因重排与临床预后关系 追踪观察21例ANLL经HA方案(三尖杉酯硷联合阿糖胞苷)方案及小剂量阿糖胞苷治疗后转归，结果显示9例IgH基因重排阳性病人化疗后1例获完全缓解(CR)，1例获部分缓解(PR)，CR率为11.1%，总有效率为22.2%(2/9)，而12例IgH基因重排阴性病人治疗后CR4例，PR4例，CR率33.3%，总有效率66.7%。IgH 基因重排阳性病人化疗总有效率显著低于重排基因阴性病人(P<0.05),虽然IgH基因重排阳性病人CR率也明显低于IgH基因重排病人，但统计学处理无显著差异，可能与例数过少有关。
3 讨论
多能造血干细胞向B淋巴系定向分化时可发生IgH特异性基因重排，因此，重排的IgH 基因可作为B淋巴系克隆的基因标志。随Southern杂交及PCR等分子生物学技术在白血病研究中应用， 白血病的分型也由一般形态学和单抗免疫学分型进入基因分型水平，我们应用PCR技术检测老年人ALL病人IgH基因重排，结果显示75% B-ALL存在IgH基因重排,进一步证实该重排为B淋巴系克隆的特异性标志。理论上所有B细胞起源的恶性肿瘤都应具有IgH基因重排,但实际应用PCR技术进行临床检测中仅80%左右病人显阳性结果，即20%左右病人存在假阴性现象。 假阴性产生原因可分技术学和生物学因素。前者主要是引物匹配性差异和各种循环参数的影响;生物学因素包括IgH基因位点发生易位、IgH基因发生不完全重排及重排基因方式发生变化等[1]。 应用目前的检测技术想完全克服假阴性尚不可能，故进行临床分析时应考虑此因素在内。
, 百拇医药
一般认为IgH基因重排为B-淋巴系肿瘤特异性基因标志，因此T-ALL及ANLL 应不具有此基因重排，但近年来国外文献报道[2,3]应用Southern杂交及PCR技术发现部分T-ALL和ANLL病人也存在IgH基因重排。我们研究结果显示40.9%老年人ANLL中发现IgH基因重排， 与国外文献报道一致。目前认为此现象与这部分病人的白血病起源于较早期多能干细胞或“淋髓前体细胞”水平有关，它可同时表达几种细胞序列的标志，随细胞的定向分化，这种重排仍然存在；此外，还可导致在部分ANLL病人中尚存在淋巴系的寡/亚克隆。我们研究结果显示老年人ANLL病人IgH基因重排阳性率显著高于非老年人组(P<0.05)，此现象可能与老年ANLL中有MDS病史比例较高有关。目前大量证据表明MDS是由一个异常造血干细胞衍生的恶性克隆发展而来的克隆性疾病，因此，这部分病人转化为白血病后其白血病起源也为造血干细胞水平，较易发生基因重排。
目前老年人急性白血病的CR率显著低于青壮年(20～40岁)，而老年人白血病死亡率为20/10万，显著高于青壮年白血病的死亡率[4]。老年人急性白血病CR率低，预后差主要原因与年龄大，免疫力差，治疗合并症多,心肺和造血功能差等因素有关。此外，老年人白血病细胞抗药性存在也是导致治疗失败的一个重要因素，而这种原发性耐药有其内在的分子生物学基础。老年人急性白血病常伴5号和7号染色体异常，且老年人ANLL病人合并MDS病史者显著高于青壮年ANLL，而这二种情况是白血病预后不良的重要因素。此外，随分子生物学进展,目前发现白血病细胞克隆的细胞周期时间与年龄存在相关性，老年ANLL 的白血病细胞多处于更不成熟的造血干细胞或造血祖细胞阶段，而青年ANLL白血病细胞处于较晚期祖细胞。我们研究显示老年人ANLL病人IgH基因重排阳性率显著高于非老年组ANLL，也支持上述观点[5]。结果还显示IgH基因重排阳性老年人ANLL治疗有效率明显低于IgH基因重排阴性老年人ANLL，其机制可能也与 IgH 基因重排阳性老年人ANLL的白血病起源较早期造血干细胞水平，治疗较困难有关。但也不能除外IgH基因重排阳性老年人ANLL例数少及随机性因素,尚需扩大病例数进行系统观察。总之，应用分子生物学技术检测老年人急性白血病的基因重排可帮助了解老年人急性白血病的分子生物学特征和预后， 此方面研究尚需进一步深入。
, 百拇医药
*广东省自然科学基金资助项目 (No.960346)
作者简介：徐兵，男，1966年出生；1988年毕业于第一军医大学 ；讲师，硕士； 电话：85147901
参考文献
1 徐 兵，周淑芸. PCR技术检测B-淋巴系肿瘤IgH重排基因的进展.国外医学输血及血液学分册,1995;18(3):159
2 Coorha R, Bunin N, Mino J et al. Provocative pattern of rearrangementsof the genes for the r and b chains of the T cell receptor in human leuke mia.Proc Natl Acad Sci USA, 1987, 84:4547
3 Schmeter HM, Gerhartz HH. Acute myeloid leukemia (AML) can be oli goclonal. Leukemia,1993,7:1965
4 上海市白血病协作组. 上海地区老年急性白血病417例回顾性研究. 中 华血液学杂志,1998,19(1):3
5 艾辉胜，罗荣城，乐晓锋主编. 现代白血病学. 北京：人民军医出版社, 1997. 207～209
(收稿日期：1998-11-18), 百拇医药