竞争性定量PCR检测TCRVγI-Jγ基因重排方法的建立及应用*
作者：徐兵 李亚洁 周淑芸 杨艺 孙竞 田红
单位：徐兵 周淑芸 杨 艺 孙 竞 田 红 孟凡义(第一军医大学南方医院 血液科，广州，510515)；李亚洁(第一军医大学南方医院 护理部，广州，510515)
关键词：定量PCR；白血病；淋巴细胞性；基因重排
竞争性定量PCR检测TCRVγI摘要：目的 为提高急性淋巴细胞白血病(ALL)微小残留检测的临床意义。方法 建立竞争性定量聚合酶链反应(PCR)检测TCRVγI-Jγ基因重排技术并定量分析16例ALL病人残留白血病细胞。结果 建立定量PCR方法的灵敏度为10-5水平。16例ALL缓解期残留白血病细胞为(427±364)×10-5病人。3例病人可检测出寡/亚克隆重排，白血病细胞定量为117×10-5、196×10-5及211×10-5水平，其中1例寡/亚克隆水平在病程中不断增加并导致3月后复发伴克隆演化。结论 所建立定量PCR技术简便、快速、灵敏；定量检测ALL缓解期残留白血病有利于预后预测并可应用于寡/亚克隆的定量检测。
, 百拇医药
中图分类号：R733.71
Construction of a quantitative-PCR for detection of TCRVγI-Jγ gene rearrangement and its clinical application
Xu Bing1, Li Yajie2, Zhou Shuyun1 , Yang Yi1, Sun Jing1,Tian Hong1, Meng Fanyi1
1Department of Hematology, 2Nursing Department, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou, 510515 Abstract: Objective To improve the clinical significance of detecting minimal residual disease (MRD) in acute lymphoblastic leukemia (ALL). Methods A competitive PCR method was constructed for quantitative clonal rearrangement of TCRVγI-Jγ gene in 16 ALL cases. Result The sensitivity of the established quantitative-PCR was at 10-5 level. In remission, the leukemic cells in 16 ALL cases were (427±364)×10-5. The recurrence rate was higher in patients with leukemic cells >520×109/L than in those with leukemic cells <520×109/L. Oligoclonal/subclonal rearrangement can be detected in 3 cases whose leukemic cells were 117×10-5, 196×10-5 and 211×10-5, respectively,in one of whom increasing of oligoclonal subclonal in the course of disease led to relapse 3 months later clonal evolution. Conclusion The established quantitative PCR assay is simple, repaid and sensitive. The quantitative evaluation of ALL cases during the remission period may help for prediction of prognosis and also can be used for quantitative assay of the oligoclones /subclones.
, 百拇医药
Key words: quantitative-polymerase chain reaction; leukemia; lymphoblastic; gene rearrangement
尽管急性白血病初治缓解率已达到80%左右，但大部分病人最终死于难治和复发，目前认为微小残留病(MRD)是导致白血病复发的主要原因，聚合酶链反应(PCR)技术以其高灵敏度使MRD检测成为可能，但临床应用中发现有些病人MRD的存在可能导致复发，而在另一些病人中却不然。这反映了MRD存在质和量的差异[1]。因此单纯检测到MRD的存在对预测复发的价值有限，现行定性分析方法已无法满足临床的需要。为进一步提高MRD检测的临床意义，我们建立竞争性定量PCR技术检测T细胞受体(TCR)VγI-Jγ基因重排，并检测16例急性淋巴细胞白血病(ALL)病人残留白血病细胞水平。
1 对象和方法
, 百拇医药 1.1 研究对象 16例经形态、组织化学和免疫学检查确诊的ALL患者完全缓解期骨髓抗凝标本，缓解时间为1～14月，诊断标准参照FAB和1986年全国白血病研讨会[2]制定标准。年龄2～61岁，中位年龄26.1岁。男10例，女6例。免疫分型中B细胞型10例，T细胞型3例，T、B双表型1例，无标记型2例。此16例病人初治时定性PCR方法[3]检测TCRVγI-Jγ基因重排为阳性。
1.2 竞争性内参物构建 采用跨越PCR方法构建350bp内参模板。将PCR扩增 TCRVγI-Jγ基因重排阳性病人PCR产物应用ABI-PRIM-310自动测序仪进行序列分析后，根据序列分析结果设计两条内参引物，片段长度各为40bp，上游内参引物5’端和下游内参引物3’端为原扩增TCRVγ-Jγ引物序列，上游内参引物3’端和下游内参引物的5’则根据序列分析结果针对310bp范围互补序列，经内参引物和原引物二次PCR扩增后即可得到350bp的扩增产物。应用PCR产物纯化试剂盒(广州倍泰公司)纯化后根据试剂盒(Promega公司)说明将纯化产物导入T载体质粒中长期保存。经序列分析显示，仅较原序列减少46 bp，而两侧引物结合区完全相同，片段长度为350bp。
, 百拇医药
1.3 竞争性定量PCR扩增 经摸索优化的扩增体系为4mmol/L dNTP及10×PCR Buffer各2ml,引物各为5pmol，待测标本DNA 1mg与10-5稀释内参照物等量混合，95℃预变性5min后加入Taq酶1.5U，93℃50 s-54℃ 1min-72℃ 1min×5循环后改为94℃50s -40s-72℃ 40s×25循环，72℃10min。
1.4 图像分析 将5mlPCR产物加入GeneGel预制胶上Genephor高效电泳仪上480V半干电泳1h，1mg/L EB染色30min后GDS-7500图像分析系统扫描各泳道光密度值。
2 结果
2.1 定量PCR灵敏度 将内参固定与对数稀释TCRVγI-Jγ阳性病人DNA标本(原始细胞占97%)分别扩增，将模板DNA稀释到10-5水平仍可发现400bp较弱的阳性扩增带，显示本方法检测残留白血病细胞敏感度为10-5水平。
, 百拇医药
2.2 线性关系 以10-5水平内参物与1mg起始对数稀释病人DNA(原始细胞为97%)进行分别PCR扩增，随阳性标本DNA量加入对数增加，350bp吸光值逐渐下降，而400bp吸光度逐渐上升，呈良好竞争线性关系(P<0.001)。
2.3 临床应用 检测16例缓解期ALL(缓解时间1～14月)，白血病细胞定量结果为(427±364)×10-5水平，白血病细胞>520×10-5 7例病人中有5例出现临床复发，余9例病人中仅2例复发。1例异基因骨髓移植术后3月残留白血病细胞为762×10-5，该患者于移植后4月出现复发。
2.4 寡/亚克隆的定量 16例病人中有3例可检测出寡/亚克隆重排，白血病细胞定量为117×10-5、196×10-5及211×10-5水平。追踪观察发现有1例病人寡/亚克隆定量不断增加，该病人3月后复发伴克隆演化，流式细胞仪单抗检查显示由初治时B细胞型演化为T、B双表型。免疫球蛋白重链(IgH)基因重排由初治时阴性转为阳性。
, 百拇医药
3 讨论
抗原受体(IgH或TCR)基因重排可作为淋巴系克隆基因标志，其中TCRVγI-Jγ基因重排在T、B淋巴系肿瘤均有较高阳性率，更适于作为基因标志进行临床MRD的研究。目前报道定量PCR检测抗原受体基因方法有噬菌体法、极限稀释法，内参竞争法及荧光定量法[4,5,6]。前2种方法由于操作繁琐，且准确性欠佳，只能进行半定量；而荧光定量法虽然比较精确，但设备要求及成本均较高，不适于临床检测需要，且不能分别定量主克隆和寡/亚克隆。我们构建竞争性定量PCR方法其内参对照与目的基因具有相同序列和二级结构，且片段长度仅相差46 bp，二者扩增效率差异极小，准确性明显提高。同时配合高电压半干电泳技术，可分辨为双等位基因重排和寡/亚克隆重排，不仅克服以往竞争定量PCR方法不足,且还可根据寡/亚克隆量变进行克隆演化的研究。此外我们创新地采用跳跃PCR技术构建内参模板，与目前报道酶切断端连接等方法比较，不仅操作简便、快捷、提高工作效益，且大大降低费用，更适合临床实际需要。我们检测16例缓解期ALL病人，残留白血病细胞定量为(427±364)×10-5水平，显示即使是在缓解期，仍存在较高的白血病负荷，应进一步进行巩固强化及骨髓移植等治疗。我们的研究还发现白血病细胞负荷>520×10-5水平病人复发率显著高于对照组(P<0.05)，显示该技术可早期预测复发，判定治疗效果，指导临床个体化治疗方案的选择。
, 百拇医药
随分子生物学和遗传学研究进展，目前发现许多肿瘤在发展过程中可表现生物学行为的改变，其特征表现为侵袭性和恶性行为有加剧的趋势，目前称之为肿瘤克隆演化，肿瘤克隆演化是导致某些病人难治、复发及治疗失败的根本原因。对肿瘤演化的机制目前认为是化疗等内外因素导致耐药寡/亚克隆增殖导致不同阶段的优势克隆选择所致[7]。目前对克隆演化现象只能进行回顾性分析，我们建立定量PCR方法可以对寡/亚克隆进行定量检测，并发现1例病人寡/亚克隆在病程中不断增殖而导致克隆演化现象，显示利用该技术可以早期预测克隆演化的趋势，及时指导临床更改治疗方案，提高治疗效果。
*广东省自然科学基金资助项目(960346)
作者简介：徐兵，男，1966年出生；1988年毕业于第一军医大学；硕士，讲师；电话：85147901
参考文献
, 百拇医药
1 Buttunini A, Cale RP. Detecting minimal residual disease. Cancer Genet Cytognt, 1991,52 (1):19
2 扬天楹. 急性淋巴细胞白血病. 见：张之南主编. 血液病诊断和疗效标准. 第2版：北京：科学出版社，1998.184～194
3 张 剑,徐 兵. 髓系白血病患者T细胞受体基因重排的检测及意义.实用肿瘤学杂志，1999,14:9
4 Yamada M, Wasscman R, Langc B et al. Minimal residual disease in childhood B-lineage lymphoblastic leukemia persistence of leukemic cells during the first 18 months of treatment. N Engl J Med, 1990, 323:448
, 百拇医药
5 Brisco MJ,Condon J, Sykes PJ et al. Detection and quantitation of neoplastic cells in acute lymphoblastic leukaemia, by use of the polymerase chain reaction. Br J Haematol, 1991,79:211
6 Thompson JD, Brodsky I, Yunis J. Molecular quantification of residual disease in chronic myelogenous leukemia after bone marrow transplantation. Blood, 1992,79:1629
7 Wasserman R, Yamada M, Ito Y et al. VH gene rearrangement events can modify the immunoglobulin heavy chain during progression of B-lineage acute lymphoblastic leukemia. Blood, 1992,79:223
(收稿日期：1998-12-01), http://www.100md.com
单位：徐兵 周淑芸 杨 艺 孙 竞 田 红 孟凡义(第一军医大学南方医院 血液科，广州，510515)；李亚洁(第一军医大学南方医院 护理部，广州，510515)
关键词：定量PCR；白血病；淋巴细胞性；基因重排
竞争性定量PCR检测TCRVγI摘要：目的 为提高急性淋巴细胞白血病(ALL)微小残留检测的临床意义。方法 建立竞争性定量聚合酶链反应(PCR)检测TCRVγI-Jγ基因重排技术并定量分析16例ALL病人残留白血病细胞。结果 建立定量PCR方法的灵敏度为10-5水平。16例ALL缓解期残留白血病细胞为(427±364)×10-5病人。3例病人可检测出寡/亚克隆重排，白血病细胞定量为117×10-5、196×10-5及211×10-5水平，其中1例寡/亚克隆水平在病程中不断增加并导致3月后复发伴克隆演化。结论 所建立定量PCR技术简便、快速、灵敏；定量检测ALL缓解期残留白血病有利于预后预测并可应用于寡/亚克隆的定量检测。
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中图分类号：R733.71
Construction of a quantitative-PCR for detection of TCRVγI-Jγ gene rearrangement and its clinical application
Xu Bing1, Li Yajie2, Zhou Shuyun1 , Yang Yi1, Sun Jing1,Tian Hong1, Meng Fanyi1
1Department of Hematology, 2Nursing Department, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou, 510515 Abstract: Objective To improve the clinical significance of detecting minimal residual disease (MRD) in acute lymphoblastic leukemia (ALL). Methods A competitive PCR method was constructed for quantitative clonal rearrangement of TCRVγI-Jγ gene in 16 ALL cases. Result The sensitivity of the established quantitative-PCR was at 10-5 level. In remission, the leukemic cells in 16 ALL cases were (427±364)×10-5. The recurrence rate was higher in patients with leukemic cells >520×109/L than in those with leukemic cells <520×109/L. Oligoclonal/subclonal rearrangement can be detected in 3 cases whose leukemic cells were 117×10-5, 196×10-5 and 211×10-5, respectively,in one of whom increasing of oligoclonal subclonal in the course of disease led to relapse 3 months later clonal evolution. Conclusion The established quantitative PCR assay is simple, repaid and sensitive. The quantitative evaluation of ALL cases during the remission period may help for prediction of prognosis and also can be used for quantitative assay of the oligoclones /subclones.
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Key words: quantitative-polymerase chain reaction; leukemia; lymphoblastic; gene rearrangement
尽管急性白血病初治缓解率已达到80%左右，但大部分病人最终死于难治和复发，目前认为微小残留病(MRD)是导致白血病复发的主要原因，聚合酶链反应(PCR)技术以其高灵敏度使MRD检测成为可能，但临床应用中发现有些病人MRD的存在可能导致复发，而在另一些病人中却不然。这反映了MRD存在质和量的差异[1]。因此单纯检测到MRD的存在对预测复发的价值有限，现行定性分析方法已无法满足临床的需要。为进一步提高MRD检测的临床意义，我们建立竞争性定量PCR技术检测T细胞受体(TCR)VγI-Jγ基因重排，并检测16例急性淋巴细胞白血病(ALL)病人残留白血病细胞水平。
1 对象和方法
, 百拇医药 1.1 研究对象 16例经形态、组织化学和免疫学检查确诊的ALL患者完全缓解期骨髓抗凝标本，缓解时间为1～14月，诊断标准参照FAB和1986年全国白血病研讨会[2]制定标准。年龄2～61岁，中位年龄26.1岁。男10例，女6例。免疫分型中B细胞型10例，T细胞型3例，T、B双表型1例，无标记型2例。此16例病人初治时定性PCR方法[3]检测TCRVγI-Jγ基因重排为阳性。
1.2 竞争性内参物构建 采用跨越PCR方法构建350bp内参模板。将PCR扩增 TCRVγI-Jγ基因重排阳性病人PCR产物应用ABI-PRIM-310自动测序仪进行序列分析后，根据序列分析结果设计两条内参引物，片段长度各为40bp，上游内参引物5’端和下游内参引物3’端为原扩增TCRVγ-Jγ引物序列，上游内参引物3’端和下游内参引物的5’则根据序列分析结果针对310bp范围互补序列，经内参引物和原引物二次PCR扩增后即可得到350bp的扩增产物。应用PCR产物纯化试剂盒(广州倍泰公司)纯化后根据试剂盒(Promega公司)说明将纯化产物导入T载体质粒中长期保存。经序列分析显示，仅较原序列减少46 bp，而两侧引物结合区完全相同，片段长度为350bp。
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1.3 竞争性定量PCR扩增 经摸索优化的扩增体系为4mmol/L dNTP及10×PCR Buffer各2ml,引物各为5pmol，待测标本DNA 1mg与10-5稀释内参照物等量混合，95℃预变性5min后加入Taq酶1.5U，93℃50 s-54℃ 1min-72℃ 1min×5循环后改为94℃50s -40s-72℃ 40s×25循环，72℃10min。
1.4 图像分析 将5mlPCR产物加入GeneGel预制胶上Genephor高效电泳仪上480V半干电泳1h，1mg/L EB染色30min后GDS-7500图像分析系统扫描各泳道光密度值。
2 结果
2.1 定量PCR灵敏度 将内参固定与对数稀释TCRVγI-Jγ阳性病人DNA标本(原始细胞占97%)分别扩增，将模板DNA稀释到10-5水平仍可发现400bp较弱的阳性扩增带，显示本方法检测残留白血病细胞敏感度为10-5水平。
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2.2 线性关系 以10-5水平内参物与1mg起始对数稀释病人DNA(原始细胞为97%)进行分别PCR扩增，随阳性标本DNA量加入对数增加，350bp吸光值逐渐下降，而400bp吸光度逐渐上升，呈良好竞争线性关系(P<0.001)。
2.3 临床应用 检测16例缓解期ALL(缓解时间1～14月)，白血病细胞定量结果为(427±364)×10-5水平，白血病细胞>520×10-5 7例病人中有5例出现临床复发，余9例病人中仅2例复发。1例异基因骨髓移植术后3月残留白血病细胞为762×10-5，该患者于移植后4月出现复发。
2.4 寡/亚克隆的定量 16例病人中有3例可检测出寡/亚克隆重排，白血病细胞定量为117×10-5、196×10-5及211×10-5水平。追踪观察发现有1例病人寡/亚克隆定量不断增加，该病人3月后复发伴克隆演化，流式细胞仪单抗检查显示由初治时B细胞型演化为T、B双表型。免疫球蛋白重链(IgH)基因重排由初治时阴性转为阳性。
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3 讨论
抗原受体(IgH或TCR)基因重排可作为淋巴系克隆基因标志，其中TCRVγI-Jγ基因重排在T、B淋巴系肿瘤均有较高阳性率，更适于作为基因标志进行临床MRD的研究。目前报道定量PCR检测抗原受体基因方法有噬菌体法、极限稀释法，内参竞争法及荧光定量法[4,5,6]。前2种方法由于操作繁琐，且准确性欠佳，只能进行半定量；而荧光定量法虽然比较精确，但设备要求及成本均较高，不适于临床检测需要，且不能分别定量主克隆和寡/亚克隆。我们构建竞争性定量PCR方法其内参对照与目的基因具有相同序列和二级结构，且片段长度仅相差46 bp，二者扩增效率差异极小，准确性明显提高。同时配合高电压半干电泳技术，可分辨为双等位基因重排和寡/亚克隆重排，不仅克服以往竞争定量PCR方法不足,且还可根据寡/亚克隆量变进行克隆演化的研究。此外我们创新地采用跳跃PCR技术构建内参模板，与目前报道酶切断端连接等方法比较，不仅操作简便、快捷、提高工作效益，且大大降低费用，更适合临床实际需要。我们检测16例缓解期ALL病人，残留白血病细胞定量为(427±364)×10-5水平，显示即使是在缓解期，仍存在较高的白血病负荷，应进一步进行巩固强化及骨髓移植等治疗。我们的研究还发现白血病细胞负荷>520×10-5水平病人复发率显著高于对照组(P<0.05)，显示该技术可早期预测复发，判定治疗效果，指导临床个体化治疗方案的选择。
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随分子生物学和遗传学研究进展，目前发现许多肿瘤在发展过程中可表现生物学行为的改变，其特征表现为侵袭性和恶性行为有加剧的趋势，目前称之为肿瘤克隆演化，肿瘤克隆演化是导致某些病人难治、复发及治疗失败的根本原因。对肿瘤演化的机制目前认为是化疗等内外因素导致耐药寡/亚克隆增殖导致不同阶段的优势克隆选择所致[7]。目前对克隆演化现象只能进行回顾性分析，我们建立定量PCR方法可以对寡/亚克隆进行定量检测，并发现1例病人寡/亚克隆在病程中不断增殖而导致克隆演化现象，显示利用该技术可以早期预测克隆演化的趋势，及时指导临床更改治疗方案，提高治疗效果。
*广东省自然科学基金资助项目(960346)
作者简介：徐兵，男，1966年出生；1988年毕业于第一军医大学；硕士，讲师；电话：85147901
参考文献
, 百拇医药
1 Buttunini A, Cale RP. Detecting minimal residual disease. Cancer Genet Cytognt, 1991,52 (1):19
2 扬天楹. 急性淋巴细胞白血病. 见：张之南主编. 血液病诊断和疗效标准. 第2版：北京：科学出版社，1998.184～194
3 张 剑,徐 兵. 髓系白血病患者T细胞受体基因重排的检测及意义.实用肿瘤学杂志，1999,14:9
4 Yamada M, Wasscman R, Langc B et al. Minimal residual disease in childhood B-lineage lymphoblastic leukemia persistence of leukemic cells during the first 18 months of treatment. N Engl J Med, 1990, 323:448
, 百拇医药
5 Brisco MJ,Condon J, Sykes PJ et al. Detection and quantitation of neoplastic cells in acute lymphoblastic leukaemia, by use of the polymerase chain reaction. Br J Haematol, 1991,79:211
6 Thompson JD, Brodsky I, Yunis J. Molecular quantification of residual disease in chronic myelogenous leukemia after bone marrow transplantation. Blood, 1992,79:1629
7 Wasserman R, Yamada M, Ito Y et al. VH gene rearrangement events can modify the immunoglobulin heavy chain during progression of B-lineage acute lymphoblastic leukemia. Blood, 1992,79:223
(收稿日期：1998-12-01), http://www.100md.com