新生大鼠离体延髓面神经后核内侧区微量注射GABA和BIC对呼吸节律的影响*

http://www.100md.com 《第一军医大学学报》 1999年第3期

     作者：高杨 胡德辉 吴中海

    单位：第一军医大学生理教研室，广州，510515

    关键词：Υ-氨基丁酸；面神经后核内侧区；呼吸节律；新生大鼠；微量注射

    新生大鼠离体延髓面神经后核内侧区微量注射GABA和BIC对呼吸节律的影响摘要：目的与方法 本实验采用新生大鼠离体脑干-脊髓标本，以玻璃吸附电极记录颈4或颈5腹根(C4_V或C5_V)的自发节律性呼吸放电(SRRD)，在延髓面神经后核内侧区(mNRF)微量注射Υ-氨基丁酸(GABA)及其受体拮抗剂荷包牡丹碱(BIC)，观察其对C4_V或C5_V的SRRD的影响。结果 (1)双侧微量注射10mmol/L GABA 0.25μl，C4_V或C5_V的SRRD节律不齐，幅度下降，频率逐渐减慢至停止；(2) 在对照区域(疑核尾部)双侧微量注射10mmol/L GABA0.25ml，C4_V或C5_V的SRRD的幅度下降，频率减慢但不停止；(3) 双侧微量注射20mmol/L BIC0.25ml，C4_V或C5_V的SRRD频率加快，幅度略有降低；(4) 预先向mNRF双侧微量注射20mmol/L BIC0.25ml，再注射10mmol/LGABA 0.25ml，SRRD无明显变化。结论 GABA 及GABA_A在mNRF呼吸节律的产生和调控中起重要作用。

    中图分类号：R332

     Effects of microinjection of GABA and bicuc`ulline into the medial area of the nucleus retrofacialis on respiratory rhythm in neonatal rat: An in vitro study

    Gao Yang, Hu Dehui, Wu Zhonghai

    Department of Physiology, First Military Medical University, Guangzhou, 510515

    Abstract: In our previous works, we discovered and pointed out that the medial area of nucleus tetrofacialis (mNRF) is a bicuculline critical site that generates the respiratory rhythm. We have recently studied the effects of microinjection of g -aminobutyrio acid (GABA) and bicuculline (BIC) into the mNRF on the spontanous rhythmical respiratory discharge activity (SRRD) of the ventral roots C4 or C5 (C4_V or C5_V) in brainstem-spinal cord preparation of neonatal SD rats. The results showed that after bilateral microinjection of 10 m mol/L GABA 0.25 m l into mNRF, the amplitude of SRRD fell, and the rhythm of SRRD was irregular, and the frequency of SRRD was gradually reduced till completely ceased; that after bilateral microinjection of 10 m mol/L GABA 0.25 m l into control area (the caudal division of nucleus ambiguous, cNA), the amplitude of SRRD fell, and the frequency of SRRD was reduced but not ceased; that after bilateral microinjection of 20 m mol/L BIC 0.25 m l into mNRF, the amplitude of SRRD fell slightly, and the frequency of SRRD was increased; and that bilateral microinjection of 20 m mol/L BIC 0.25 m l into mNRF first , and then of 10 m mol/L GABA 0.25 m l into the same site, caused no significant changes of the SRRD. It is suggested that GABA and GABA_A receptor play important roles in the genesis and regulation of respiratory rhythm in mNRF.

    Key words: g -aminobutyric acid; nucleus tetrofacialis; respiratory rhythm; neonatal rats; microinjection

    在有关呼吸中枢的研究中，基本呼吸节律产生的机制倍受关注。但其在延髓的具体部位及机制至今仍未有统一的认识。本实验室以往的工作发现并证实面神经后核内侧区(Medial area of nucleus retrofacialis, mNRF)在发生和维持节律性呼吸中起重要作用，并提出mNRF可能是节律性呼吸发生的部位^[1,2,3]。g -氨基丁酸(GABA)是中枢神经系统主要的抑制性递质之一。Yamada^[4]等人经第四脑室注射GABA可产生明显的肺通气功能的抑制效应；傅小文^[5]等在兔延髓腹侧面敷贴GABA可使肺通气受到抑制，这种呼吸抑制作用可被GABA_A受体阻断剂荷包牡丹碱(BIC)所拮抗，提示这种呼吸抑制主要由GABA_A受体介导。近年来，在不同的实验中发现GABA及BIC对呼吸节律的发生和呼吸类型的影响并非一致，因而对GABA到底是参与呼吸节律的发生还是仅仅作为神经介质来发挥调节作用尚有不同的认识。这些可能与对基本呼吸节律发生的具体部位看法不一致及给药途径不同有关。本实验通过对新生大鼠离体脑干-脊髓标本mNRF微量注射GABA及BIC，观察其对呼吸节律产生的影响，进一步探讨GABA及GABA_A受体在mNRF的呼吸节律发生和调控中的作用。

    1 材料和方法

    新生SD大鼠 (0～3d), 雌雄不拘。参照Suzue^[6]的方法制作离体脑干-脊髓标本：乙醚深度麻醉，迅速分离头和脊柱并置于标本制作槽内，其中充满改良的Krebs液 (Modified Krebs solution, MKS.由以mmol/L为单位的下列化合物组成: 124NaCl, 5.0KCl, 1.2KH₂PO₄, 2.4CaCl₂,1.3MgSO₄,26NaHCO₃,30glucose,pH7.2～7.4,95%O₂～5%CO₂平衡)。在延髓脑桥之间横断脑干，脊髓颈胸段之间横断脊髓，除去多余的颅骨和脊椎骨，分离出脑干和脊髓，并尽可能保留脊神经根髓，并将离体脑干-脊髓标本置于3ml恒温灌流槽内，腹面向上固定，用改良的Krebs液持续灌流(4～6ml/min，温度27^oC)。以尖端直径20～30mm的玻璃微管接微量注射器，将玻璃微管固定于电极架上，尖端垂直于脑平面，备脑内微量注射用。玻璃吸附电极从C4_V或C5_V记录其自发节律性放电(SRRD)作为呼吸活动的输出监示指标，放电信号经前置放大器(FZG-1A型，南京六合)输入双线示波器(SBR-1型，汕头)，同时输入磁带记录仪(RMG-5204，Nihon Kohden, Japan)和四导生理记录仪(NihonKohden,Japan)。每次实验结束时，以2%旁胺天蓝标记脑内给药部位，用10%福尔马林固定标本48h后，作冠状面冰冻切片，中性红染色，光镜下观察，根据蓝点位置，对照Paxions and Watson 图谱确定给药部位。

    实验结束后，呼吸性放电信号由磁带记录仪输入SMUP-PC生物信号处理系统进行频率直方图处理并分析。

    2 结果

    2.1 GABA 对C4_V或C5_V的SRRD的影响 正常灌流条件(27^oC, pH 7.2～7.4, MKS灌流)下，C4_V或C5_V的放电活动具有持续而稳定的节律性(图1)。向mNRF(舌下神经根上缘水平，中线旁开1.0～1.1mm，垂直于腹侧脑表面深0.2～0.3mm^[7])双侧微量注射0.25mlMKS，C4_V或C5_V的SRRD无明显变化(n=15)；双侧微量注射10μmol/L GABA 0.25ml，C4_V或C5_V的SRRD节律不齐，幅度下降，频率逐渐减慢至停止(n=15)；在对照区域(疑核尾部 ，cNA：闩后0.1mm，中线旁开0.9～1.0mm，垂直于腹侧脑表面深0.4-0.42mm)双侧微量注射10mmol/L GABA0.25ml，C4_V或C5_V的SRRD的幅度下降，频率减慢但不停止(n=15)，见图2。

    图1 正常灌流条件下C4_V和C5_V的SRRD

    Fig. 1 SRRD of C4_V and C5_V under normal perfusion condition

    A.SRRD of C4_V B. SRRD of C5_V

    图2 面神经后核双侧微量注射10mmol/L GABA0.25ml对C4_V或C5_V SRRD的影响

    Fig. 2 Effect of bilateral microinjection of 10 m mol/L GABA 0.25 m l into the mNRF on SRRD of C4_V or C5_V

    A. Normal control; B. Bilateral microinjection of MKS 0.25 m l into mNRF ;C. Area control: bilateral microinjection of 10 m mol/L GABA 0.25 m l into can;D-F. Bilateral microinjection, of 10 m mol/L GABA 0.25 m l into mNRF(D. 1 min, E. 2.5 min, F. 4 min after microinjection)

    2.2 BIC对C4v或C5v的SRRD的影响 与正常灌流情况相比，单独向双侧mNRF双侧微量注射20mmol/L的BIC 0.25ml后，C4_V或C5_V的SRRD频率加快，幅度略有降低 (n=15)；而双侧微量注射MKS 0.25ml后 ，C4_V或C5_V的SRRD则无明显变化(图3)。预先向双侧mNRF微量注射20mmol/L的BIC 0.25ml，再注射10mmol/L的GABA 0.25ml，SRRD无明显变化(n=15)(图4)。 图3 面神经后核双侧微量注射20mmol/L BIC 0.25ml 对C4_V或C5_V SRRD的影响

    Fig .3 Effect of bilateral microinjection of 20mmol/L BIC 0.25ml into the mNRF on SRRD of C4_V or C5_V

    A. Normal control; B. Bilateral microinjection of MKS 0.25ml into mNRF; C. Bilateral microinjection of 20mmol/L BIC 0.25 m l into mNRF 图4 预先向双侧mNRF微量注射20mmol/L的BIC0.25ml，再注射10mmol/L的 GABA 0.25ml对C4_V或C5_V SRRD的影响

    Fig. 4 Effect of pretreatment with 20mmol/L BIC 0.25ml and then bilateral microinjection of 10mmol/L GABA 0.25ml into mNRF on SRRD of C4_V or C5_V

    A. Normal control ; B. Bilateral microinjection of MKS 0.25ml into mNRF ;C. Bilateral pretreatment with 20mmol/L BIC 0.25ml and then bilateral microinjection of 10mmol/L GABA 0.25ml into mNRF

    2.3 组织学检查 将实验标本进行组织学检查，对照Paxions and Watson图谱，表明闩水平至闩前500 m m的延髓腹侧结构包含面神经后核尾端及其内侧部分，该部分基本与以前报导的成年大鼠 mNRF部位一致。证明本实验微量注射的部位为mNRF。

    3 讨论

    在呼吸中枢抑制性神经递质的研究中，GABA越来越受到重视。Hedner等^[8]在大鼠延髓腹外侧区微量注射GABA或蝇蕈碱可产生呼吸抑制效应。Haji等^[9]微电泳GABA可直接抑制猫延髓腹外侧区呼吸相关神经元的活动。李莉华等^[10]在大鼠旁巨细胞外侧核微电泳GABA对神经元自发放电活动产生抑制效应，BIC可拮抗GABA的抑制效应。以上均提示内源性GABA对呼吸具有调控作用，此作用由GABA_A受体介导。本实验室曾在在体大鼠mNRF微量注射GABA，动物出现明显的呼吸抑制，呼吸频率减慢，膈肌电活动减少。BIC可拮抗或翻转GABA的呼吸抑制效应^[11]。为了进一步阐明mNRF产生呼吸节律的机制和GABA的作用，我们采用离体脑干-脊髓标本的实验方法，以排除上位中枢和外周输入的影响，在mNRF微量注射GABA 和BIC。结果显示：mNRF双侧微量注射10mmol/L GABA 0.25ml，C4_V或C5_V的SRRD出现明显的抑制效应，幅度降低，节律不齐、减慢直至完全停止；mNRF双侧微量注射20mmol/L BIC 0.25ml，C4_V或C5_V的SRRD出现兴奋效应，表现为节律加快，幅度略有降低；预先注射20mmol/L BIC 0.25ml，再注射10mmol/L GABA 0.25ml，C4_V或C5_V的SRRD无明显变化；将GABA注射于疑核尾部区域对C4_V或C5_V的SRRD幅度降低，频率减慢但不会停止。提示在mNRF的呼吸相关神经元上存在GABA_A受体，GABA可能是一种重要的内源性神经递质通过参与GABA_A受体基本呼吸节律的发生。详细机制有待于进一步研究。

    *国家自然科学基金资助项目(39670278)

    高杨，男，1967年出生；1989年毕业于南京大学；讲师

    参考文献

    1 吴中海，张枫桐，李有仁. 家兔面神经后核内侧区在呼吸节律起源中的作用.生理学报，1990,42(1):68

    2 吴中海, 张枫桐, 李有仁. 家兔延髓区域阻滞对呼吸的影响. 生理 学报，1988, 40(3):250

    3 Zhang FT, Wu ZH, Li YR. Effect of blocking medial area of nucleusretro facilis on respiratory rhythm. Respir Physiol, 1991, 85:73

    4 Yamada KA, Hamosh P, Gillis RA. Respiratory depression produced by g -aminobutyric acid (GABA) applied to the Ventral surface of the cat hind brain. Fed Proc, 1981, 40:428

    5 傅小文，陈子彬，钱梓文. g-氨基丁酸敷贴在延髓腹侧面对呼吸的影响. 中国药理学报, 1986, 7(4): 289

    6 Suzue T. Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat. J Physiol, 1984, 354:173

    7 J. C. Smith, H. H. Ellenberger, K. Ballanyi et al. Pre-Botzinger Complex: a brainstem region that may generate respiratory rhythm in mammals. Science, 1991, 254:726

    8 Hedner J, Hedner T. In: Precedings of neurobiology of the control of breathing. 10th. Nobel Conference Stockholm Sweden, 1985

    9 Haji A, Takeda R, Remmers JE. Evidence that glycine and GABA mediate postsynaptic inhibition of bulbar respiratory neurons in the cat.J Appl Physiol , 1992, 73(6):2333

    10 李莉华, 郑 煜, 徐美丽. 谷氨酸,Υ-氨基丁酸及其拮抗剂对大鼠旁巨细胞外侧核神经元自发放电的影响. 华西医科大学学报, 1997, 28(1):31

    11 吴中海，徐小元，张枫桐. 面神经后核内侧区微量注射GABA对节律性呼吸的影响. 第一军医大学学报, 1995, 15(1):21

    (收稿日期：1998-07-16)

    百拇医药网 http://www.100md.com/html/analecta/1999/03/01/15/425.htm