粒细胞集落刺激因子及其受体

http://www.100md.com 《临床血液学杂志》 1999年第3期

     作者：樊娟 徐功立

    单位：山东省立医院血液科*

    关键词：粒细胞集落刺激因子；受体；凋亡

    临床血液学杂志990317 粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是一种多肽链的细胞生长因子，可特异地调节粒系细胞的增殖与分化，并能增强成熟粒细胞的功能，对机体应激防御系统有重要意义。近年来发现G-CSF与白血病细胞的凋亡有一定关系。G-CSF功能的发挥有赖于与效应细胞表面的特异性受体的结合。随着基因克隆技术的发展，G-CSF重组产品已广泛用于临床，为血液病及其他疾病的治疗提供了有力的手段。

    1 G-CSF的生物学作用

    人类G-CSF由单个基因编码，其基因位于17号染色体的q21-22区，长约2.5 kb，有5个外显子和4个内含子；其蛋白质由174氨基酸组成。天然的G-CSF含有糖基，糖基化位点位于Thr 133，无N-糖基位点，糖基对G-CSF的生物学活性没有贡献，在E.coli中表达的G-CSF无糖基，但其功能与天然G-CSF无明显差别^〔1〕。

    1.1 G-CSF能特异性的诱导粒系祖细胞的增殖与分化 G-CSF作用的主要对象是粒系细胞，不仅可促进粒系祖细胞的增殖，并诱导其向终末分化。体外实验证实G-CSF明显的促进小鼠髓细胞系32 D₁₃和L-G细胞及转染了野生型(WT)G-CSF受体的L-GM细胞的增殖，并诱导其向中性粒细胞方向的终末分化^〔2〕。G-CSF对CD⁺₃₄/CD^-₃₃的骨髓祖细胞作用较弱，而对骨髓粒系定向细胞(CD⁺₃₄/CD⁺₃₃)有明显的促进集落形成作用；G-CSF刺激造血祖细胞的动力学研究表明：G-CSF可诱导较成熟祖细胞(早幼粒细胞)的细胞分裂，但不能促进早期祖细胞进入细胞增殖周期。CD⁺₃₄的骨髓祖细胞的体外培养发现，G-CSF独自不能维持原始造血祖细胞的自我更新，因此G-CSF在造血中的作用时相为造血细胞分化晚期。G-CSF与其他细胞因子(IL-3，IL-12，IL-1B，IL-6)共同作用对造血祖细胞的生长有协助作用，同时G-CSF还能调节一些造血调控因子，如GM-CSF、IL-3对原始及多能祖细胞的反应。在体内，G-CSF能促进粒系祖细胞的增殖、分化及成熟，并促进骨髓中中性粒细胞和干祖细胞释放于外周血中^〔3〕。单剂量的G-CSF皮下注射，2 h后，可见外周血中性粒细胞数量增加，这一作用12 h达高峰，持续36 h后逐渐恢复原有水平；骨髓中同时伴有髓祖细胞的增加，祖细胞集落形成及骨髓S期细胞比例增加，但对单核细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、血小板、网织红细胞及血红蛋白均无明显影响。G-CSF能增强成熟粒细胞趋化性，吞噬作用及杀菌能力，促进其生存。G-CSF可促进中性粒细胞释放花生四稀酸和白细胞碱性磷酸酶及髓过氧化物酶，并介导中性粒细胞超氧阴离子的产生及抗体依赖的细胞杀伤活性(ADCC)作用^〔4，5〕。

    1.2 对其他血细胞的作用 ¹²⁵I标记G-CSF，通过r计数仪测定淋巴细胞表面无G-CSF特异性受体存在。Morikawa等^〔6〕用生物素标记G-CSF在流式细胞仪上的测定结果显示，B-淋巴细胞表面有G-CSF特异性受体存在。体外培养发现：G-CSF可促进B-淋巴细胞的增殖，但其促进B-淋巴细胞分泌免疫球蛋白的作用更为显著，且发现高浓度的G-CSF，才能引起B-淋巴细胞对其产生反应，但G-CSF刺激髓系细胞则无需如此高的浓度。推测：在细菌感染情况下，机体可释放有活性的G-CSF，使体内G-CSF的血液浓度明显升高，各种细胞包括粒细胞、单核细胞及淋巴细胞均参与炎症的反应，且分泌各种有活性的包括G-CSF在内的可溶性因子，因此在炎症局部G-CSF的浓度相当高，有可能达到促进B-淋巴细胞增殖及分泌免疫球蛋白的作用。Shimoda^〔7〕首次报道血小板上有G-CSF特异性受体存在，且有较高的亲合力(解离常数Kd：300±150 pm)。结合位点412±158/细胞，且发现低浓度的G-CSF(0.1 ng/ml)即可改变ADP对血小板的诱聚反应，也有大剂量G-CSF在体内引起血小板数量增加的报告。

    1.3 G-CSF对非造血细胞的作用 G-CSF不仅对造血系统细胞有明显作用，对某些非造血细胞也有一定作用。体外培养发现G-CSF可刺激血管内皮细胞的增生及迁移，刺激H-69，H-128，小细胞肺癌细胞系的增殖，对某些大肠癌细胞系也有促进生长的作用。G-CSF与转染G-CSF受体的肝癌细胞系(Hep3B)细胞共同孵育，可促使其细胞产生急性期反应蛋白^〔8〕。胎盘滋养层细胞上有G-CSF受体存在，G-CSF对胎盘细胞的生长及生存也有重要作用。

    1.4 G-CSF对白血病细胞的作用 体外培养中，G-CSF能显著增加急性髓细胞性白血病(AML)细胞的集落形成，AML细胞的DNA合成率也明显增加。能促进白血病细胞进入细胞增殖周期，对G-CSF依赖的细胞系(如NFS-60细胞系)等也有同样作用。这些作用均与细胞表面表达特异性G-CSF受体有关，其促进增殖的信息传导过程尚不十分明确^〔9〕。G-CSF不仅促进髓系细胞的增生，也能促进其分化。FuKunage等^〔10〕在转染G-CSF受体的小鼠髓祖细胞FDC-P1细胞系中发现。G-CSF能促进MPD及LE的mRNA的表达。体外培养发现G-CSF使FDC-P1细胞向早幼粒细胞分化。Santini等^〔11〕在AML细胞的无血清培养基中加入适量的G-CSF，培养14 d发现，成熟中性粒细胞的比例明显增加，并指出这种分化作用通常是不完全的；但有实验显示在体外G-CSF不能使AML细胞向粒细胞终末分化，在体内G-CSF能否诱使白血病向正常细胞的分化，尚待进一步验证。近年来研究发现，G-CSF不仅对骨髓细胞性白血病有作用，对急淋细胞也有作用。CD⁺₇CD^₃的ALL，CD⁺₁₀的B-细胞ALL，T-原始淋巴细胞性淋巴瘤等细胞表面也有G-CSF受体存在；体外培养显示G-CSF也能促进其细胞的增殖^{〔12，13〕}。提示人们要注意观察G-CSF在治疗ALL及淋巴瘤的过程中的作用。

    1.5 G-CSF与凋亡 有学者认为G-CSF可抑制细胞的凋亡(apoptosis)从而提高依赖G-CSF生长的细胞的增殖及生存能力^〔14〕。体外培养也表明：造血祖细胞在去除G-CSF后，细胞则发生凋亡现象，化疗药物不仅直接引起白血病细胞的坏死，合适浓度也可诱导细胞凋亡。G-CSF与多种细胞毒性药物同时加入白血病细胞悬液中，共同孵育一定时间后，发现凋亡细胞的比例较单用细胞毒性药物明显减低，提示G-CSF有抑制细胞凋亡的作用^〔15〕。然而，DongF^〔16〕在分析G-CSF受体功能区段的实验中发现：转染G-CSF受体基因后的32D细胞系，在含有G-CSF的培养基中培养时，细胞未出现分化现象，却出现了典型的细胞凋亡现象。进一步的研究发现转染野生型G-CSF受体的32 D细胞系及大鼠白血病细胞系(LT 12)细胞在G-CSF作用下，失去了进一步的分化能力，而从凋亡的形式发生了死亡。Bessho等^〔17〕在表达内源性G-CSF受体的小鼠髓性细胞系也证实了G-CSF诱导细胞凋亡产生的现象，说明无论内源性表达G-CSF受体的细胞或转染G-CSF受体的细胞，G-CSF均有诱导其发生凋亡的作用。且发现凋亡的发生与G-CSF受体胞内区有密切关系^〔2〕。凋亡发生的分子生物学机理，以及与细胞分化的相互关系目前尚不清楚。

    2 G-CSF受体(G-CSFR)

    G-CSF的生物学作用是通过与效应细胞表面特异性受体(G-CSF receptor)结合而产生的。在髓祖细胞，髓性白血病细胞、成熟中性粒细胞、血小板、单细胞及某些T，B淋巴细胞均有不同密度的受体存在^{〔18～21〕}。某些非造血细胞(如血管内皮细胞、胎盘细胞、小细胞、肺癌细胞系及滋养层细胞等)也有G-CSFR存在粒系祖细胞G-CSFR的数量随着细胞的成熟而增加，人类成熟粒细胞表面有200～1 000 R/细胞，有一单一的高亲力位点，其解离常数(Kd)值约为200～500 pmol/L，交联试验表明G-CSFR蛋白分子量约为130 000～150 000道尔顿，仅需少量G-CSFR结合即可诱发最大G-CSF生物效应。

    G-CSF的cDNA克隆是1990年报告的，G-CSFR cDNA的分子克隆对阐明G-CSF的作用机理有极其重要的价值。人类G-CSFR是由813氨基酸组成的单一胯膜区的多肽链分子组成的，与小鼠(编码812氨基酸)G-CSFR在核酸水平有72.5%同源性，在氨基酸水平有62.5%的同源性，与multi-CSF及GM-CSF受体之间的同源性相对小的多。G-CSF由1个胞外区、胯膜区及胞浆内区组成，结构分析表明，G-CSFR是细胞因子受体超级家族成员之一，如IL-2-7、IL-9，IL-11，IL-12，GM-CSF，EPO，TPO，GH，PRL，CNTF，gp130信息传导蛋白等，其特点是胞外区有4个保守的半胱氨酸残基和一个WSXWS(Sor-Trp-X-Ser-Trp)主题序列^〔8〕。

    G-CSFR的胞外区N-端是一个由96氨基酸组成的免疫球蛋白样结构(Ig样结构)，是配体与受体结合的部位；紧接其后是CRH区(97-30 aa)，在CRH区的N端有一个富含cys序列，其C端有WSXWS主题序列，G-CSFR cDNA的缺失分析表明CRH区是配体与受体结合所必需的结构，若无此区配体结合后不能形成寡聚结构，因此Ig样结构及CRH区是G-CSF与受体结合所必不可少的区域。CRH区与胯膜区之间(310-602 aa)由3个重复的Ⅲ型纤维蛋白结构(FNⅢ区)组成。

    G-CSFR的胞内区由183 aa组成，G-CSFR各种突变化的研究表明：近膜区的55 aa，是增殖及生存信号转导所必须的，该区域内有两个功能亚区，称为“box1”及“ box2”。box1和box2在GM-CSFR CEpoR，IL-2RB亚基，IL-3R，IL-5R共同的信号传导蛋白B亚基中有很强的保守性，且都参与细胞增殖及生存信号的转导。之后的30 aa(56-85 aa)，有显著扩大受体介导的有丝分裂信号的作用，提示该区内可能存在另外的功能亚区。G-CSFR胞内C-末端的98 aa是转导细胞成熟信号必需的区域。近年来发现，该区域也是G-CSFR介导的细胞凋亡所必不可少的区域，在髓系细胞中能抑制增殖信号的转导。这一区域内有一保守序列称为“box3”。box3同样存在于IL-6信号传导蛋白gp130中，IL-6也能诱导正常小鼠骨髓粒细胞集落的形成，并能诱导M1白血病细胞向成熟细胞分化，说明box3亚区可能通过与之相关的特异的细胞底物直接参与了调控细胞成熟的过程^〔1〕。

    迄今为止，已发现5种不同类型的G-CSFR的异构体(WTG-CSFR、PHG2、PHG11、D7及SD)，主要是由于G-CSFR RNA不同的剪接方式造成的，各种变构体的生物学作用及其表达的调控目前尚不十分明确。DongF^〔22〕发现1例AML患者G-CSFR基因上有1个G-to-A的突变，而使AML细胞SD变异体的表达明显增加，而变化了的G-CSFR不能转导细胞成熟的信号，只能传导增殖信号。推测白血病的发生与G-CSFR的突变有一定关系。先天性粒细胞缺乏的患者也发现类似G-CSFR异常的情况，因此对各种G-CSFR在不同细胞表达情况的研究对揭示粒细胞性疾病的发病机理有重要的意义。

    *邮政编码：济南市，250021

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    1998-10-30 收稿

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