5α-胆甾烷-3β，7-二醇水溶性衍生物的合成及体外抗癌活性
作者：李文姬 容士宏
单位：沈阳药科大学化学制药教研室，沈阳110015
关键词：氧代固醇；抗癌活性；合成
摘 要 为考察胆甾摘 要 为考察胆甾-5-烯-3β，7β-二醇双琥珀酸单酯钠(RS 034)结构中的5，6-双键是否为其产生抗癌活性的必要部位，合成了5α-胆甾烷-3β，7-二醇3-琥珀酸单酯(5)及其水溶性衍生物——乙醇胺盐(6)、哌嗪盐(7)及N-2-羟乙基哌嗪盐(8)，体外抗癌活性试验表明，所合成的化合物均具有一定程度的抗癌活性.
Synthesis of Water-soluble Derivatives of 5α-Cholestane-
3β,7-diol and Their in vitro Anticancer Activities
, 百拇医药
Li Wenji,Rong Shihong
(Department of Chemical Pharmaceuticals ,Shenyang
Pharmaceutical Unive rsity,Shenyang 110015)
Abstract In order to investigate whether the 5,6-double bond of cholest-5-ene-3β，7β-diol 3，7-bishemisuccinate plays an important ro le in its anticancer activity,5α-cholestane-3β,7-diol 3-hemisuccinate and i ts water-soluble derivati ves—its salts of ethanolamine,piperazine and N-2-hydroxylamine were synth esized.Their in vitro tests demonstrated that the target compounds all posse s sed anticancer activities.
, 百拇医药
Key words oxysterols;anticancer activity;synthesis
本世纪70年代中期，郑国平〔1〕从中药僵蚕中提取出7β-羟基胆固醇，体外试验证明，它对小鼠的肝癌细胞具有细胞溶解作用，并有较好的选择性，但体内试验结果不稳定.之后，容士宏〔2〕合成了它的水溶性衍生物7β-羟基胆固醇双琥珀酸单酯钠(RS034)，该化合物对接种了腹水癌细胞的小鼠呈现较强的抗癌活性，在随后进行的构效关系研究〔3〕中发现，一些与RS034结构类似的化合物也具有抗癌活性，为进一步探讨7β-羟基胆固醇中5，6-双键所起的作用，合成了5α-胆甾烷-3β，7-二醇3-琥珀酸单酯(5)及其盐类衍生物——乙醇胺盐(6)、哌嗪盐(7)及N-2-羟乙基哌嗪盐(8)，并对其进行了抗癌活性试验.
1 合成路线
据Wintersteiner等〔4〕报道，由于5α-胆甾烷-3β，7-二醇未能由7-羟基胆固醇直接氢化制得，采用7-氧代胆固醇醋酸酯为起始原料，以氧化铂为催化剂，将双键和羰基同时还原然后水解制得；或在不同的溶剂中先将双键饱和，再将双键还原后水解得目标化合物.此外，Marker等〔5〕报道用异丙醇铝将胆甾烷-3β-醇-7-酮3-醋酸酯还原后水解制备胆甾烷-3β，7-二醇的方法.经比较采用分两步还原的方法：以氧化铂为催化剂，醋酸乙酯为溶剂，常温常压下，先将7-氧代胆固醇醋酸酯的5，6-双键饱和，再改用冰醋酸为溶剂在相同条件下，将羰基还原为羟基，最后将醋酸酯在碱性下水解.其优点是操作简便且收率高.起始原料7-氧代胆固醇醋酸酯，参考Salmond等〔6〕报道的方法制得.5α-胆甾烷-3β，7-二醇的琥珀酰化是以甲苯为反应介质在吡啶存在下进行的，将制得的胆甾烷-3β，7-二醇3-琥珀酸单酯分别与乙醇胺、哌嗪及N-2-羟乙基哌嗪成盐，得到目标化合物(6)，(7)，(8).合成路线见图1.
, 百拇医药
Fig.1 The synthesis route of the aim compounds
2 合成实验
熔点用毛细管法测定，温度未经校正.红外光谱用IFS55傅立叶红外光谱仪测定，KBr压片.1H-NMR谱用ARX-300核磁共振仪测定.元素分析用意大利Carlo-Erba1106型有机元素分析仪测定.质谱用VG7070E型质谱仪测定.
2.1 7-氧代胆固醇醋酸酯(1)的制备
将25g3，5-二甲基吡唑(DMP)加入200mL干燥二氯甲烷中，冷却至-15℃，搅拌全溶后慢慢加入25g三氧化铬，控制温度在-10℃以下，加完后降温至-15℃，慢慢加入10g胆固醇醋酸酯，并在此温度下搅拌5h，然后升温至0～5℃，加入10%盐酸130mL，搅拌1h.将反应液倾入分液漏斗中，分出酸水层(酸水层保存)，二氯甲烷层用5%盐酸洗(100mL×3)，再用水洗(100mL×3，酸水层保存).二氯甲烷溶液减压蒸除大部分二氯甲烷，加入少量无水乙醚，用硅胶柱层析，二氯甲烷-乙醚(v∶v=1∶1)洗脱，洗脱液减压浓缩后以95%乙醇重结晶，得白色针状产物结晶7.0g，收率：69.0%，mp156～158℃(文献〔4〕mp157～158℃).1H-NMR(CDCl3)δ：5.70(1H，s，6-H)，4.70(1H，m，3α-H)，2.19(3H，s，3-COCH3)，1.20(3H，s，19-CH3)，0.64(3H，s，18-CH3)；IR
cm-1：2947，2871(C-H)，1735(C＝O)，1671(C＝O，环酮)，1631(C＝C)，1241(C＝O).
, 百拇医药
将上述酸水层合并，用1mol/L氢氧化钠溶液调至pH11～12，用乙醚提取(100mL×3)，回收乙醚，得白色结晶状化合物3，5-二甲基吡唑12.5g，mp106～108℃.
2.2 5α-胆甾烷-3β-醇-7-酮3-醋酸酯(2)的制备
将5.0g7-氧代胆固醇醋酸酯(1)溶于80mL醋酸乙酯中，吸入新制备的铂催化剂，常温常压下催化氢化，至板层检测无荧光点，滤除铂粉(保留)，母液减压浓缩至干，析出片状结晶4.9g，收率：98.1%，mp148～149℃(文献〔4〕mp148～149℃).1H-NMR(CDCl3)δ：4.70(1H，m，3α-H)，2.30(1H，t，5α-H)，2.20(1H，s，6α-H)，2.10(1H，s，6β-H)，1.20(3H，s，19-CH3)，0.60(3H，s，18-CH3)；IRcm-1：3401(H2O)，2950(C-H)，1731(C＝O，酯)，1706(C＝O，环酮)，1264(C-O).
, 百拇医药
2.3 5α-胆甾烷-3β，7-二醇3-醋酸酯(3)的制备
将2.0g5α-胆甾烷-3β-醇-7-酮3-醋酸酯(2)溶于40mL冰醋酸中，加入新制备的铂催化剂，常温常压振荡下通氢气，至板层显示反应完全，滤除铂粉(保留)，母液浓缩至干，甲醇重结晶得白色片状结晶1.8g，收率：90%，mp104～105℃(文献〔4〕mp106～112℃).1H-NMR(CDCl3)δ：4.70(1H,m，3α-H)，3.80(1H，m,7β-H)，3.40(1H，m，7α-H)；IRcm-1：3560(—OH)，2950(C-C)，1712(C＝O，酯)，1027(C-O).
2.4 5α-胆甾烷-3β，7-二醇(4)制备
, 百拇医药
3.0g5α-胆甾烷-3β，7-二醇3-醋酸酯(3)加入62.5mL5%氢氧化钾-甲醇溶液中，加热使之溶解，并于65℃保温3h，然后用10%盐酸中和至pH6～7，加水稀释，析出白色沉淀，放置，抽滤，得白色粉末2.2g，收率：78.6%，mp149～157℃.1H-NMR(CD3OD)δ：3.85(1H，m，7α-H，7β-H)，3.64(1H，m，3α-H)；IRcm-1：3389(—OH)，2931(C-H)，1035(C-O).
2.5 5α-胆甾烷-3β，7-二醇3-琥珀酸单酯(5)的合成
将2.0g5α-胆甾烷-3β，7-二醇(4)溶于160mL甲苯中，加入6mL吡啶及1.1g琥珀酸酐，加热使之溶解，回流10h.减压蒸除甲苯和吡啶后，趁热加入少量甲苯使成糊状，再加入少量石油醚，放置，冷却，析出结晶，抽滤，干燥，无水乙醇重结晶，得白色粉末2.0g，收率：66.7%，mp177～179℃.元素分析C31H52O5，计算值(%)：C73.77，H10.38；实测值(%)：C73.93，H10.46.1H-NMR(CDCl3)δ：4.75(1H，m，3α-H)，3.85(1H，m，7-H)，2.63(4H，m，-COCH2CH2CO-)，0.95(3H，s，19-CH3)，0.60(3H，s，18-CH3)；IRcm-1：3468(OH)，2941(C-C)，1723(C＝O)；MS(EI)m/e：504(M+)，486(M+-H2O)，386(M+-H2O-C4H4O3)，368(M+-2H2O-C4H4O3).
, 百拇医药
2.6 5α-胆甾烷-3β，7-二醇3-琥珀酸单酯-乙醇胺盐(6)的合成
精密称量1.000g5α-胆甾烷-3β，7-二醇3-琥珀酸单酯(5)及0.122g乙醇胺，并分别溶于10mL，2mL无水乙醇中，震摇下将乙醇胺溶液加入到5α-胆甾烷-3β，7-二醇3-琥珀酸单酯(5)溶液中，静置，减压蒸除少量乙醇，冷却，析出白色沉淀，过滤，得白色粉末0.9g，收率：80.4%，mp179℃(分解).元素分析C33H59NO6，计算值(%)：C70.05，H10.51，N2.48；实测值(%)：C70.10，H10.07，N2.26.IRcm-1：3425(—NH2，—OH 重叠)，1723(C＝O)，1384(C＝N).
, 百拇医药
2.7 5α-胆甾烷-3β，7-二醇3-琥珀酸单酯-哌嗪盐(7)的合成
精密称量1.010g5α-胆甾烷-3β，7-二醇-3-琥珀酸单酯(5)及0.180g无水哌嗪，分别溶于10mL，2mL无水甲醇中，其余操作同(6)的合成，得白色粉末1.0g，收率：84.7%，mp159℃(分解).元素分析C35H62N2O5，计算值(%)：C71.14，H10.57，N4.74；实测值(%)：C69.09，H10.52，N4.64.IRcm-1：3428(—NH，—OH 重叠)，1710(C＝O)，1404(C-N).
2.8 5α-胆甾烷-3β，7-二醇3-琥珀酸单酯-N-2-羟乙基哌嗪盐(8)的合成
, 百拇医药
精密称量1.020g5α-胆甾烷-3β，7-二醇3-琥珀酸单酯(5)及0.280gN-2-羟乙基哌嗪，并分别溶于1.5mL，2mL无水甲醇中，其余操作同(6)的合成，得白色结晶1.1g，收率：85.9%，mp148～150℃(分解).元素分析C37H66N2O6，计算值(%)：C69.99，H10.48，N4.41；实测值(%)：C69.93，H10.38，N4.28.IRcm-1：3500～3233(—NH2，—OH 重叠)，1730，1700(C＝O)，1382(C-N).
3 药理实验
对所合成的化合物(5)～(8)分别进行L1210小鼠白血病细胞体外增殖抑制实验.
, 百拇医药
水溶样品用PBS(-)溶液稀释，DMSO溶解和乙醇溶解样品加PBS(-)稀释(最终浓度均≤0.5%).将各档浓度组的样品加入96孔培养板各孔内，对照组加相应的稀释液，每孔加试液10μL，每样品设六档浓度，每档浓度设双复孔.取对数生长期的L1210细胞用RPMI1640培养液稀释，各孔内加入90μL(1×10-4悬浮细胞)，置37℃二氧化碳培养箱内，48h后加入MTT液，继续培养4h后，加入三联液，于37℃放置.次日用DG3022酶免疫检测仪测各孔A(570nm)值，各加试液孔均值与对照孔均值比较，计算出各浓度组的百分抑制率[IC%=(1-T/C)×100%]和样品的直线回归方程，求出各样品的IC50值.药理试验结果见表1.
Tab.1 In vitro inhibiting effect of compounds
(5)～(8) and RS 034 on L1210 tumor cells
, http://www.100md.com
Compd.
Regression equation
Correlation coefficient(r)
IC50/μg.mL-1
5
Y①=-42.89+90.27lgx②
0.953
10.69
Y=-44.07+105.53lgx
0.99
, http://www.100md.com
7.28
6
Y=-28.01+79.79lgx
0.97
9.49
Y=-38.80+98.86lgx
0.99
7.9
7
Y=-103.9+143.31lgx
0.99
11.86
, 百拇医药
Y=-32.67+84.26lgx
0.97
9.57
8
Y=-34.75+80.12lgx
0.97
11.42
Y=-32.2+84.26lgx
0.97
9.45
RS034
Y=-106.9+106.11lgx
, http://www.100md.com
0.98
6.32
①Y:inhibiting percentage(%) ②x:concentration of compounds(μg/mg)4 讨论
a.化合物5α-胆甾烷-3β，7-二醇(4)的合成中，由于对7-羰基的还原采用的是非立体选择性的还原方法，产物5α-胆甾烷-3β，7-二醇3-醋酸酯(3)及化合物(4)应为α-异构体和β-异构体的混合物；由于7α-H和7β-H受到不同的去屏蔽效应，故在谱图上可看到，7α-H在相对高场(δ3.40，为多重峰)出现，而7β-H在相对低场(δ3.80，为多重峰)出现.从两处峰的积分值看，两异构体的生成比例为2∶1.
b.曾用多种展开系统进行薄层层析，都没有得到分离的两个斑点，考虑到合成化合物的目的是用来将目标化合物的药理结果与7-羟基胆固醇的药理结果相比较，以观察此类化合物中双键的存在对抗癌活性的影响，因此，将所得产物直接进行下步反应，并进行了药理试验，结果表明：5α-胆甾烷-3β，7-二醇3-琥珀酸单酯的各盐类衍生物有较强的抗癌活性.与7-羟基胆固醇-3，7-双琥珀酸单酯盐的药理结果比较表明：双键的存在对抗癌活性的影响并不明显.
, 百拇医药
致谢：元素分析、质谱、核磁共振谱、红外光谱等由中国科学院上海有机化学研究所、中国科学院沈阳应用生态研究所、沈阳药科大学分析测试中心等单位协助测定；上海医药工业研究院药理室代做体外抗癌活性试验，在此一并表示感谢.
李文姬：通讯联系人 现址：第二军医大学基础部药理学教研室，上海200433
容士宏：现通讯处：9110 Lichtenauer Dr.#229,Lenexa,KS 66219,U.S.A
参考文献
1 Cheng KP,Nagano H,Luu B,et al.Chemistry and biochemistry of Chin ese drugs Part 1. Sterol derivatives cytotoxic to hepatoma cells,isolated from t he drugs Bombyx Cum Botryte.J Chem Res(s),1977,9:217(CA 88:68955n)
, 百拇医药
2 Rong SH.Activitive antitive antitumorale de derives hydrosolubles de stroides p olyoxygeness:[Doctoral dissertation].France:Universite L. Pasteur Strasbourg,1 983
3 张新华，闫少羽，李惠琴，等.氧代固醇类化合物的抗癌活性研究4.胆甾烷-3β，5α，6β(6α)-三醇和胆甾-4-烯-3β，6β(6α)-二醇的琥珀酸单酯钠的合成与抗癌活性.中国药物化学杂志，1995，5(2)：101～108
4 Wintersteiner， Moore M.The preparation and properties of the 7-peimeric c holestanediols-3β,7.J Am Chem Soc,1943,65(2):1503～1507
5 Marker ，Rohrmann.Sterols LXXV.Cholesterol derivatives.J Am Chem Soc,1939,61 (3):3022～3024
6 Salmond WG,Barta MA， Havens JL.Allylic oxidation with 3,5-dimethylpyrazole ，chromium trioxide complex.Steroidal Δ5-7-ketones.J Org Chem,1978,43 (10):2057～2059
收稿日期:1999-04-20, http://www.100md.com
单位：沈阳药科大学化学制药教研室，沈阳110015
关键词：氧代固醇；抗癌活性；合成
摘 要 为考察胆甾摘 要 为考察胆甾-5-烯-3β，7β-二醇双琥珀酸单酯钠(RS 034)结构中的5，6-双键是否为其产生抗癌活性的必要部位，合成了5α-胆甾烷-3β，7-二醇3-琥珀酸单酯(5)及其水溶性衍生物——乙醇胺盐(6)、哌嗪盐(7)及N-2-羟乙基哌嗪盐(8)，体外抗癌活性试验表明，所合成的化合物均具有一定程度的抗癌活性.
Synthesis of Water-soluble Derivatives of 5α-Cholestane-
3β,7-diol and Their in vitro Anticancer Activities
, 百拇医药
Li Wenji,Rong Shihong
(Department of Chemical Pharmaceuticals ,Shenyang
Pharmaceutical Unive rsity,Shenyang 110015)
Abstract In order to investigate whether the 5,6-double bond of cholest-5-ene-3β，7β-diol 3，7-bishemisuccinate plays an important ro le in its anticancer activity,5α-cholestane-3β,7-diol 3-hemisuccinate and i ts water-soluble derivati ves—its salts of ethanolamine,piperazine and N-2-hydroxylamine were synth esized.Their in vitro tests demonstrated that the target compounds all posse s sed anticancer activities.
, 百拇医药
Key words oxysterols;anticancer activity;synthesis
本世纪70年代中期，郑国平〔1〕从中药僵蚕中提取出7β-羟基胆固醇，体外试验证明，它对小鼠的肝癌细胞具有细胞溶解作用，并有较好的选择性，但体内试验结果不稳定.之后，容士宏〔2〕合成了它的水溶性衍生物7β-羟基胆固醇双琥珀酸单酯钠(RS034)，该化合物对接种了腹水癌细胞的小鼠呈现较强的抗癌活性，在随后进行的构效关系研究〔3〕中发现，一些与RS034结构类似的化合物也具有抗癌活性，为进一步探讨7β-羟基胆固醇中5，6-双键所起的作用，合成了5α-胆甾烷-3β，7-二醇3-琥珀酸单酯(5)及其盐类衍生物——乙醇胺盐(6)、哌嗪盐(7)及N-2-羟乙基哌嗪盐(8)，并对其进行了抗癌活性试验.
1 合成路线
据Wintersteiner等〔4〕报道，由于5α-胆甾烷-3β，7-二醇未能由7-羟基胆固醇直接氢化制得，采用7-氧代胆固醇醋酸酯为起始原料，以氧化铂为催化剂，将双键和羰基同时还原然后水解制得；或在不同的溶剂中先将双键饱和，再将双键还原后水解得目标化合物.此外，Marker等〔5〕报道用异丙醇铝将胆甾烷-3β-醇-7-酮3-醋酸酯还原后水解制备胆甾烷-3β，7-二醇的方法.经比较采用分两步还原的方法：以氧化铂为催化剂，醋酸乙酯为溶剂，常温常压下，先将7-氧代胆固醇醋酸酯的5，6-双键饱和，再改用冰醋酸为溶剂在相同条件下，将羰基还原为羟基，最后将醋酸酯在碱性下水解.其优点是操作简便且收率高.起始原料7-氧代胆固醇醋酸酯，参考Salmond等〔6〕报道的方法制得.5α-胆甾烷-3β，7-二醇的琥珀酰化是以甲苯为反应介质在吡啶存在下进行的，将制得的胆甾烷-3β，7-二醇3-琥珀酸单酯分别与乙醇胺、哌嗪及N-2-羟乙基哌嗪成盐，得到目标化合物(6)，(7)，(8).合成路线见图1.
, 百拇医药
Fig.1 The synthesis route of the aim compounds
2 合成实验
熔点用毛细管法测定，温度未经校正.红外光谱用IFS55傅立叶红外光谱仪测定，KBr压片.1H-NMR谱用ARX-300核磁共振仪测定.元素分析用意大利Carlo-Erba1106型有机元素分析仪测定.质谱用VG7070E型质谱仪测定.
2.1 7-氧代胆固醇醋酸酯(1)的制备
将25g3，5-二甲基吡唑(DMP)加入200mL干燥二氯甲烷中，冷却至-15℃，搅拌全溶后慢慢加入25g三氧化铬，控制温度在-10℃以下，加完后降温至-15℃，慢慢加入10g胆固醇醋酸酯，并在此温度下搅拌5h，然后升温至0～5℃，加入10%盐酸130mL，搅拌1h.将反应液倾入分液漏斗中，分出酸水层(酸水层保存)，二氯甲烷层用5%盐酸洗(100mL×3)，再用水洗(100mL×3，酸水层保存).二氯甲烷溶液减压蒸除大部分二氯甲烷，加入少量无水乙醚，用硅胶柱层析，二氯甲烷-乙醚(v∶v=1∶1)洗脱，洗脱液减压浓缩后以95%乙醇重结晶，得白色针状产物结晶7.0g，收率：69.0%，mp156～158℃(文献〔4〕mp157～158℃).1H-NMR(CDCl3)δ：5.70(1H，s，6-H)，4.70(1H，m，3α-H)，2.19(3H，s，3-COCH3)，1.20(3H，s，19-CH3)，0.64(3H，s，18-CH3)；IR
cm-1：2947，2871(C-H)，1735(C＝O)，1671(C＝O，环酮)，1631(C＝C)，1241(C＝O)., 百拇医药
将上述酸水层合并，用1mol/L氢氧化钠溶液调至pH11～12，用乙醚提取(100mL×3)，回收乙醚，得白色结晶状化合物3，5-二甲基吡唑12.5g，mp106～108℃.
2.2 5α-胆甾烷-3β-醇-7-酮3-醋酸酯(2)的制备
将5.0g7-氧代胆固醇醋酸酯(1)溶于80mL醋酸乙酯中，吸入新制备的铂催化剂，常温常压下催化氢化，至板层检测无荧光点，滤除铂粉(保留)，母液减压浓缩至干，析出片状结晶4.9g，收率：98.1%，mp148～149℃(文献〔4〕mp148～149℃).1H-NMR(CDCl3)δ：4.70(1H，m，3α-H)，2.30(1H，t，5α-H)，2.20(1H，s，6α-H)，2.10(1H，s，6β-H)，1.20(3H，s，19-CH3)，0.60(3H，s，18-CH3)；IR
cm-1：3401(H2O)，2950(C-H)，1731(C＝O，酯)，1706(C＝O，环酮)，1264(C-O)., 百拇医药
2.3 5α-胆甾烷-3β，7-二醇3-醋酸酯(3)的制备
将2.0g5α-胆甾烷-3β-醇-7-酮3-醋酸酯(2)溶于40mL冰醋酸中，加入新制备的铂催化剂，常温常压振荡下通氢气，至板层显示反应完全，滤除铂粉(保留)，母液浓缩至干，甲醇重结晶得白色片状结晶1.8g，收率：90%，mp104～105℃(文献〔4〕mp106～112℃).1H-NMR(CDCl3)δ：4.70(1H,m，3α-H)，3.80(1H，m,7β-H)，3.40(1H，m，7α-H)；IR
cm-1：3560(—OH)，2950(C-C)，1712(C＝O，酯)，1027(C-O).2.4 5α-胆甾烷-3β，7-二醇(4)制备
, 百拇医药
3.0g5α-胆甾烷-3β，7-二醇3-醋酸酯(3)加入62.5mL5%氢氧化钾-甲醇溶液中，加热使之溶解，并于65℃保温3h，然后用10%盐酸中和至pH6～7，加水稀释，析出白色沉淀，放置，抽滤，得白色粉末2.2g，收率：78.6%，mp149～157℃.1H-NMR(CD3OD)δ：3.85(1H，m，7α-H，7β-H)，3.64(1H，m，3α-H)；IR
cm-1：3389(—OH)，2931(C-H)，1035(C-O).2.5 5α-胆甾烷-3β，7-二醇3-琥珀酸单酯(5)的合成
将2.0g5α-胆甾烷-3β，7-二醇(4)溶于160mL甲苯中，加入6mL吡啶及1.1g琥珀酸酐，加热使之溶解，回流10h.减压蒸除甲苯和吡啶后，趁热加入少量甲苯使成糊状，再加入少量石油醚，放置，冷却，析出结晶，抽滤，干燥，无水乙醇重结晶，得白色粉末2.0g，收率：66.7%，mp177～179℃.元素分析C31H52O5，计算值(%)：C73.77，H10.38；实测值(%)：C73.93，H10.46.1H-NMR(CDCl3)δ：4.75(1H，m，3α-H)，3.85(1H，m，7-H)，2.63(4H，m，-COCH2CH2CO-)，0.95(3H，s，19-CH3)，0.60(3H，s，18-CH3)；IR
cm-1：3468(OH)，2941(C-C)，1723(C＝O)；MS(EI)m/e：504(M+)，486(M+-H2O)，386(M+-H2O-C4H4O3)，368(M+-2H2O-C4H4O3)., 百拇医药
2.6 5α-胆甾烷-3β，7-二醇3-琥珀酸单酯-乙醇胺盐(6)的合成
精密称量1.000g5α-胆甾烷-3β，7-二醇3-琥珀酸单酯(5)及0.122g乙醇胺，并分别溶于10mL，2mL无水乙醇中，震摇下将乙醇胺溶液加入到5α-胆甾烷-3β，7-二醇3-琥珀酸单酯(5)溶液中，静置，减压蒸除少量乙醇，冷却，析出白色沉淀，过滤，得白色粉末0.9g，收率：80.4%，mp179℃(分解).元素分析C33H59NO6，计算值(%)：C70.05，H10.51，N2.48；实测值(%)：C70.10，H10.07，N2.26.IR
cm-1：3425(—NH2，—OH 重叠)，1723(C＝O)，1384(C＝N)., 百拇医药
2.7 5α-胆甾烷-3β，7-二醇3-琥珀酸单酯-哌嗪盐(7)的合成
精密称量1.010g5α-胆甾烷-3β，7-二醇-3-琥珀酸单酯(5)及0.180g无水哌嗪，分别溶于10mL，2mL无水甲醇中，其余操作同(6)的合成，得白色粉末1.0g，收率：84.7%，mp159℃(分解).元素分析C35H62N2O5，计算值(%)：C71.14，H10.57，N4.74；实测值(%)：C69.09，H10.52，N4.64.IR
cm-1：3428(—NH，—OH 重叠)，1710(C＝O)，1404(C-N).2.8 5α-胆甾烷-3β，7-二醇3-琥珀酸单酯-N-2-羟乙基哌嗪盐(8)的合成
, 百拇医药
精密称量1.020g5α-胆甾烷-3β，7-二醇3-琥珀酸单酯(5)及0.280gN-2-羟乙基哌嗪，并分别溶于1.5mL，2mL无水甲醇中，其余操作同(6)的合成，得白色结晶1.1g，收率：85.9%，mp148～150℃(分解).元素分析C37H66N2O6，计算值(%)：C69.99，H10.48，N4.41；实测值(%)：C69.93，H10.38，N4.28.IR
cm-1：3500～3233(—NH2，—OH 重叠)，1730，1700(C＝O)，1382(C-N).3 药理实验
对所合成的化合物(5)～(8)分别进行L1210小鼠白血病细胞体外增殖抑制实验.
, 百拇医药
水溶样品用PBS(-)溶液稀释，DMSO溶解和乙醇溶解样品加PBS(-)稀释(最终浓度均≤0.5%).将各档浓度组的样品加入96孔培养板各孔内，对照组加相应的稀释液，每孔加试液10μL，每样品设六档浓度，每档浓度设双复孔.取对数生长期的L1210细胞用RPMI1640培养液稀释，各孔内加入90μL(1×10-4悬浮细胞)，置37℃二氧化碳培养箱内，48h后加入MTT液，继续培养4h后，加入三联液，于37℃放置.次日用DG3022酶免疫检测仪测各孔A(570nm)值，各加试液孔均值与对照孔均值比较，计算出各浓度组的百分抑制率[IC%=(1-T/C)×100%]和样品的直线回归方程，求出各样品的IC50值.药理试验结果见表1.
Tab.1 In vitro inhibiting effect of compounds
(5)～(8) and RS 034 on L1210 tumor cells
, http://www.100md.com
Compd.
Regression equation
Correlation coefficient(r)
IC50/μg.mL-1
5
Y①=-42.89+90.27lgx②
0.953
10.69
Y=-44.07+105.53lgx
0.99
, http://www.100md.com
7.28
6
Y=-28.01+79.79lgx
0.97
9.49
Y=-38.80+98.86lgx
0.99
7.9
7
Y=-103.9+143.31lgx
0.99
11.86
, 百拇医药
Y=-32.67+84.26lgx
0.97
9.57
8
Y=-34.75+80.12lgx
0.97
11.42
Y=-32.2+84.26lgx
0.97
9.45
RS034
Y=-106.9+106.11lgx
, http://www.100md.com
0.98
6.32
①Y:inhibiting percentage(%) ②x:concentration of compounds(μg/mg)4 讨论
a.化合物5α-胆甾烷-3β，7-二醇(4)的合成中，由于对7-羰基的还原采用的是非立体选择性的还原方法，产物5α-胆甾烷-3β，7-二醇3-醋酸酯(3)及化合物(4)应为α-异构体和β-异构体的混合物；由于7α-H和7β-H受到不同的去屏蔽效应，故在谱图上可看到，7α-H在相对高场(δ3.40，为多重峰)出现，而7β-H在相对低场(δ3.80，为多重峰)出现.从两处峰的积分值看，两异构体的生成比例为2∶1.
b.曾用多种展开系统进行薄层层析，都没有得到分离的两个斑点，考虑到合成化合物的目的是用来将目标化合物的药理结果与7-羟基胆固醇的药理结果相比较，以观察此类化合物中双键的存在对抗癌活性的影响，因此，将所得产物直接进行下步反应，并进行了药理试验，结果表明：5α-胆甾烷-3β，7-二醇3-琥珀酸单酯的各盐类衍生物有较强的抗癌活性.与7-羟基胆固醇-3，7-双琥珀酸单酯盐的药理结果比较表明：双键的存在对抗癌活性的影响并不明显.
, 百拇医药
致谢：元素分析、质谱、核磁共振谱、红外光谱等由中国科学院上海有机化学研究所、中国科学院沈阳应用生态研究所、沈阳药科大学分析测试中心等单位协助测定；上海医药工业研究院药理室代做体外抗癌活性试验，在此一并表示感谢.
李文姬：通讯联系人 现址：第二军医大学基础部药理学教研室，上海200433
容士宏：现通讯处：9110 Lichtenauer Dr.#229,Lenexa,KS 66219,U.S.A
参考文献
1 Cheng KP,Nagano H,Luu B,et al.Chemistry and biochemistry of Chin ese drugs Part 1. Sterol derivatives cytotoxic to hepatoma cells,isolated from t he drugs Bombyx Cum Botryte.J Chem Res(s),1977,9:217(CA 88:68955n)
, 百拇医药
2 Rong SH.Activitive antitive antitumorale de derives hydrosolubles de stroides p olyoxygeness:[Doctoral dissertation].France:Universite L. Pasteur Strasbourg,1 983
3 张新华，闫少羽，李惠琴，等.氧代固醇类化合物的抗癌活性研究4.胆甾烷-3β，5α，6β(6α)-三醇和胆甾-4-烯-3β，6β(6α)-二醇的琥珀酸单酯钠的合成与抗癌活性.中国药物化学杂志，1995，5(2)：101～108
4 Wintersteiner， Moore M.The preparation and properties of the 7-peimeric c holestanediols-3β,7.J Am Chem Soc,1943,65(2):1503～1507
5 Marker ，Rohrmann.Sterols LXXV.Cholesterol derivatives.J Am Chem Soc,1939,61 (3):3022～3024
6 Salmond WG,Barta MA， Havens JL.Allylic oxidation with 3,5-dimethylpyrazole ，chromium trioxide complex.Steroidal Δ5-7-ketones.J Org Chem,1978,43 (10):2057～2059
收稿日期:1999-04-20, http://www.100md.com