河北汉族人群D17S30位点扩增片段长度多态性

http://www.100md.com 《河北医科大学学报》 1999年第3期

     作者：彭郁葱 丛 斌 姚玉霞 尤红煜 王俊霞 杨承珠 左 敏^** 谷振勇^**

    单位：河北医科大学基础医学院分子生物学研究室(石家庄050017)；* 中医学院生物教研室；** 基础医学院法医学教研室

    关键词：基因频率/遗传学；基因扩增/遗传学；聚合酶链反应/方法学

    河北医科大学学报990301 摘 要 目的 探讨河北省汉族人群D17S30位点的基因频率分布,为法医的基因认定提供依据。方法 用聚合酶链式反应(PCR)对河北汉族人群201名无关个体D17S30位点进行扩增，扩增产物采用聚丙烯酰胺凝胶电泳及溴化乙锭染色，依据扩增片段长度确定各等位基因，分别使用POMS软件和自编软件，进行统计学分析和遗传多态性分析,并对10个家系资料进行了分析。结果 共检出12种等位基因，45种基因型，基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(χ²=10.687 2, P=0.710 4, df=14)。观测杂合度h_o为75.12 %，DP、EPP和PIC值分别为0.961 1、0.728 0和0.849 3。该位点呈共显性遗传。结论 D17S30位点在河北汉族人群中的基因频率分布具有良好的多态性，适用于该人群的个人识别和亲子鉴定。

    中图号 R371.2

    AMPLIFIED FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM ANALYSIS OF

    D17S30 LOCUS IN HEBEI HAN POPULATION

    Peng Yucong Cong Bin Yao Yuxia You Hongyu Wang Junxia

    Yang Chengzhu Zuo Min Gu Zhenyong

    Molecular Biology Laboratory,the School of Basic Medical Sciences,Hebei Medical University

    (Shijiazhuang 050017)

    ABSTRACT Objective To explore D17S30 locus distribution in Han population of Hebei province and provide clues of gene discrimination for forensic analysis.Methods Polymerase chain reaction (PCR) was performed followed by polyacrylamide gel electrophoresis and ethidium bromide staining to determine each allele according to the length. Then,POMS software and another software programmed by ourselves were used separately to make the χ² test and genetic polymorphism analysis. Besides, 10 families were analyzed. Results 45 phenotypes and 12 alleles ranging from 168-938 bp were observed among the 201 unrelated individuals. Alleles 4, 1 and 5 were the most common alleles in Hebei Han population. No deviation from Hardy-Weinberg equilibrium was found (χ²=10.687 2, P=0.710 4, df=14). The observed heterozygosity (h_o), discrimination power (DP), excluding probability of paternity (EPP) and polymorphism information content (PIC) were 75.12%,0.961 1, 0.728 0 and 0.849 3 respectively. Family analyses showed this locus was in good agreement with codominant inheritance. Conclusion The better polymorphism of the D17S30 locus makes it suitable for individual identification and paternity diagnosis in Han population of Hebei province.

    MeSH gene frequency/genet; gene amplification/genet; polymerase chain reaction/methods

    D17S30可变数目串联重复(variable number of tandem repeat, VNTR)位点是位于人类基因组17p13.3的一小卫星区域，可用探针pYNZ22检测,其重复单位长70 bp 。继Horn等^[1]采用PCR技术对该位点进行Amp-FLP分析成功后，该法普遍被用于人群的多态性分布调查。目前共发现15种等位基因，片段长度大多分布于168～1 148 bp之间。由于该位点多态性丰富，而成为以法医学个人识别和亲子鉴定为目的的有价值的遗传标记之一。应用PCR技术和聚丙烯酰胺凝胶电泳方法对河北汉族人群该位点的扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism,Amp-FLP)进行了调查，用自编软件对结果进行了全面分析，并与国内外其它地区的人群资料进行了比较，同时对10个家系资料进行了分析。

    1 材料与方法

    1.1 样本：201名无关个体血液样本取自河北汉族人群，枸橼酸钠抗凝或不抗凝，4 ℃保存2周至半年。10个家系，30人的血样由河北省人民医院儿科提供。

    1.2 引物:5'-AAA CTG CAG AGA GAA AGG TCG AAG AGT GAA GTG-3'；5'-AAA GGA TCC CCC ACA TCC GCT CCC CAA GTT-3'^[2]由中国科学院微生物研究所合成。

    1.3 DNA样品提取:取抗凝血500 μl,加500 μl裂解液(蔗糖640 mmol/L；Tris-HCl 20 mmol/L，pH 7.6；MgCl₂ 10 mmol/L；2 %的TritonX-100)，振荡至透明。10 000 r/min离心15 min，弃上清。加500 μl预冷的双蒸水，10 000 r/min离心15 min，弃上清。加500 μl提取液(NaCl 75 mmol/L，EDTA 24 mmol/L)，弹动离心管壁使沉淀飘起后，加10 %十二烷基硫酸钠50 μl及蛋白酶K(10 mg/ml)10 μl，60 ℃水浴1 h。以下按酚-氯仿法提取基因组DNA。对于不加抗凝剂的血液样本，取0.5 ml 凝血块加少量裂解液在冰水浴中用玻璃研磨器研碎后，把液体物质转移至1.5 ml离心管中，留下不易研碎的纤维蛋白成分，再用裂解液冲洗研磨器3次，移入离心管中，共用裂解液0.5 ml，余下处理步骤同抗凝血样本。

    1.4 D17S30位点扩增：按Buscemi^[3]所述方法略加改进。采用25 μl反应体系，其中含Tris-HCl 10 mmol/L，pH9.0；KCl 50 mmol/L；0.01 %；TritonX-100MgCl₂ 1.5 mmol/L；dNTP 200 μmol/L；TaqDNA聚合酶1 u；0.5μmol/L引物；模板DNA 10～100 ng。加25 μl液体石蜡覆盖后，用Perkin-Elmer 480型扩增仪扩增；94 ℃预变性5 min，循环参数为94、63、72 ℃各1 min，循环27次后，72 ℃保持10 min，扩增产物4 ℃保存。

    1.5 扩增产物检测：上述扩增产物用6 %聚丙烯酰胺凝胶(49:1)分型，凝胶板厚0.8 mm，长16 cm，电泳缓冲液为1×TBE，电压125 V，泳动2 h。电泳完毕后将凝胶放入含0.5μg/ml溴化乙锭的预冷1×TBE中染色15～30 min，置于紫外透射仪上观察并拍照。

    1.6 数据处理：用POMS软件对所检出基因型的观测值和理论值进行χ² 检验，以判断调查结果是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。与其他人群资料的比较也采用χ² 检验。理论杂合度(theoretical heterozygosity，h_t)^[3]，个人识别力(discrimination power，DP)^[3]，非父排除率(chance of exclusion， EPP)^[4]及多态性信息含量(polymorphism information content， PIC)^[4]，分别按文献所给公式用自编软件进行计算。

    2 结 果

    2.1 河北汉族人群D17S30位点遗传多态性:对河北汉族人群201名无关个体D17S30位点的扩增片段长度多态性进行分析，发现12种等位基因，片段长度分布在168～938 bp之间，按重复单位重复次数分别命名为等位基因1～12(图1)，基因频率为0.005 0～0.223 9，其中最常见为等位基因4，其次为1和5，等位基因11最少见,见表1)。78种可能的基因型中发现45种，频率在0.005 0～0.069 7之间，最常见为1/5和4/5,其次为1/1和14,见表2)。由于某些基因型例数过小，按统计学要求对其合并后行χ²检验，表明基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(χ²=10.6872，P=0.710 4，df=14),见表3)。

    表1 河北汉族人群201名无关个体D17S30位点等位基因频率分布

    Table 1 Allele frequency distribution of D17S30 locus

    in 201 unrelated Hebei Han population Allele(Copies of

    repeat units)

    Size(bp)

    Haplotype number

    Frequency(%)

    1

    168

    72

    17.91

    2

    238

    37

    9.20

    3

    308

    37

    9.20

    4

    378

    90

    22.39

    5

    448

    55

    13.68

    6

    518

    38

    9.45

    7

    588

    32

    7.96

    8

    658

    19

    4.73

    9

    728

    5

    1.24

    10

    868

    7

    1.74

    11

    938

    2

    0.50

    12

    1008

    8

    1.95

    Total

    402

    100

    表2 河北汉族人群201名无关个体D17S30位点基因型分布

    Table 2 Genotype frequencies of D17S30 locusin

    201 unrelated Hebei Han Population Genotype

    Observed

    Expected

    Number/Frequency

    Number/Frequency

    1/1

    12/0.0597

    6.45/0.0321

    1/2

    4/0.0199

    6.63/0.0330

    1/3

    7/0.0348

    6.63/0.0330

    1/4

    12/0.0597

    16.12/0.0802

    1/5

    14/0.0697

    9.25/0.0490

    1/6

    6/0.0299

    6.79/0.0338

    1/7

    3/0.0149

    5.73/0.0285

    1/12

    2/0.0100

    1.41/0.0070

    2/2

    5/0.0249

    1.71/0.0085

    2/3

    4/0.0199

    3.40/0.0169

    2/4

    6/0.0299

    8.28/0.0412

    2/6

    8/0.0398

    3.50/0.0174

    2/7

    3/0.0149

    3.00/0.0146

    2/9

    2/0.0010

    0.46/0.0023

    3/3

    3/0.0149

    1.71/0.0085

    3/4

    8/0.0398

    8.28/0.0412

    3/5

    4/0.0199

    5.07/0.0252

    3/6

    2/0.0100

    3.50/0.0174

    3/7

    2/0.0100

    2.93/0.0146

    3/8

    2/0.0100

    1.75/0.0087

    3/10

    1/0.0050

    0.64/0.0032

    3/11

    1/0.0050

    0.18/0.0009

    4/4

    11/0.0547

    10.07/0.0501

    4/5

    14/0.0697

    12.32/0.0613

    4/6

    11/0.0547

    8.50/0.0423

    4/7

    10/0.0500

    7.16/0.0356

    4/8

    4/0.0199

    4.24/0.0211

    4/10

    1/0.0050

    1.57/0.0078

    4/12

    2/0.0100

    0.44/0.0022

    5/5

    9/0.0448

    3.76/0.0187

    5/6

    1/0.0050

    0.52/0.0026

    5/10

    2/0.0100

    0.96/0.0048

    5/12

    2/0.0100

    1.07/0.0053

    6/6

    3/0.0149

    1.79/0.0089

    6/7

    1/0.0050

    3.02/0.0150

    6/8

    2/0.0100

    1.79/0.0089

    6/12

    1/0.0050

    0.74/0.0037

    7/7

    3/0.0149

    1.27/0.0063

    7/8

    6/0.0299

    1.51/0.0075

    7/10

    1/0.0050

    0.56/0.0028

    8/8

    2/0.0100

    0.44/0.0022

    8/12

    1/0.0050

    0.36/0.0018

    9/9

    1/0.0050

    0.04/0.0002

    9/11

    1/0.0050

    0.02/0.0001

    10/10

    1/0.0050

    0.06/0.0003

    表3 分组后D17S30位点基因型分布

    Table 3 Genotype frequencies of D17S30

    locus after binding some alleles together Group

    Observed

    Expected

    Ⅰ-Ⅰ

    12

    6.45

    Ⅰ-Ⅱ

    11

    13.26

    Ⅰ-Ⅲ

    12

    16.12

    Ⅰ-Ⅳ

    14

    9.25

    Ⅰ-Ⅴ

    11

    13.93

    Ⅱ-Ⅱ

    12

    6.82

    Ⅱ-Ⅲ

    14

    16.56

    Ⅱ-Ⅳ

    4

    5.07

    Ⅱ-Ⅴ

    21

    15.96

    Ⅲ-Ⅲ

    11

    10.07

    Ⅲ-Ⅳ

    14

    12.32

    Ⅲ-Ⅴ

    28

    22.35

    Ⅳ-Ⅳ

    9

    3.76

    Ⅳ-Ⅴ

    5

    2.85

    Ⅴ-Ⅴ

    23

    11.06

    χ² =10.687 2，P=0.710 4，df=14

    Ⅰ:allele 1,Ⅱ:alleles 2 and 3,Ⅲ:allele 4,Ⅳ:allele 5,Ⅴ:alleles 6～12

    图1 D17S30位点等位基因分型

    Figure 1 Types of D17S30 system alleles

    A:5/10, B:5/5, C:3/4, D:6/8, G:8/12, H:φX174/HaeⅢ,I:PEGM-7Zf(+)/HaeⅢ, J:3/3, K:3/7, M:4/4, N:3/3

    理论杂合度h_o为81 %，观测杂合度h_t为75.12%；DP、EPP及PIC分别为0.961 1、0.728 0及0.849 3。

    2.2 家系分析：家系分析表明D17S30位点符合Mendel遗传定律，呈共显性遗传(图2)。

    图2 D17S30位点家系分析

    Figure 2 Family analysis of D17S30 locus

    A:PEGM-7Zf(+)/HaeⅢ.B:φX174/HaeⅢ,C,D.E:Father,child and mother of family 1.F,G,H: Father, child and mother of family 2

    2.3 人群比较：河北汉族人群D17S30位点等位基因频率与云南汉族人群^[5]分布无显著差别(P=0.2074)，而与成都汉族人群^[6]、中国畲族人群^[7]，以及西班牙^[8,9]、意大利人群^[3]均有显著差别,表4)。

    表4 D17S30位点等位基因频率在各人群中的分布比较(%)

    Table 4 Comparison of allele frequencies of D17S30

    in different populations(%) Allele

    Hebei^a

    (201)^b

    Chengdu^[6]

    (122)

    She ethic group^[8]

    (270)

    Yunna^[5]

    (105)

    Spanish^[10]

    (311)

    Spanish^[9]

    (137)

    Italian^[3]

    (202)

    1

    17.91

    17.21

    20.93

    15.71

    3.65

    7.2

    6.2

    2

    9.20

    22.95

    32.59

    10.00

    19.34

    22.5

    20.8

    3

    9.20

    8.61

    21.85

    5.24

    19.34

    12.7

    15.3

    4

    22.39

    25.82

    7.41

    21.90

    25.18

    24.7

    25.7

    5

    13.68

    11.89

    4.44

    10.48

    4.38

    3.8

    5.2

    6

    9.45

    5.33

    5.19

    13.81

    5.11

    3.8

    3.2

    7

    7.96

    3.69

    1.30

    9.05

    1.46

    1.9

    1.0

    8

    4.73

    2.46

    1.67

    6.67

    2.55

    4.6

    2.0

    9

    1.24

    0.82

    0.56

    0.95

    10.58

    10.3

    8.4

    10

    1.74

    1.23

    1.11

    4.76

    6.20

    5.1

    7.7

    11

    0.50

    -

    2.04

    0.95

    1.82

    1.4

    1.4

    12

    1.95

    -

    0.93

    -

    0.36

    1.1

    2.0

    13

    -

    -

    -

    -

    -

    0.3

    1.0

    14

    -

    -

    -

    0.48

    -

    -

    -

    15

    -

    -

    -

    -

    -

    0.2

    -

    df

    10

    11

    10

    11

    11

    12

    χ²

    37.3989

    185.9053

    13.2992

    97.3593

    155.7371

    142.5015

    P

    <0.0001

    <0.0001

    =0.2074

    <0.0001

    <0.0001

    <0.0001

    a:Result of this study,b:Numbers of each population

    3 讨 论

    资晓林等^[10]曾报道了从血凝块中提取DNA的方法，所提DNA产量和纯度与传统的从抗凝血中提取DNA的方法类似，可用于限制性片段长度多态性分析(RFLP)及PCR。但该方法需先将血凝块切成1 mm³的小块。再加Hank液及NaCl处理，较繁琐。本研究直接用玻璃研磨器将血凝块研碎，简便易行，并且可以去除不易研碎的纤维蛋白成分，DNA的产量及纯度符合实验要求。

    目前扩增D17S30位点的引物有2对^[1,2]，都有用于人群等位基因频率调查的报道。Justine等^[11]以Horn设计的引物扩增该位点时，发现这对引物在人群中的保守性不是很好,因而本研究采用了Rand设计的引物。不同实验室对该位点等位基因在各人群中分布情况的调查表明：各人群等位基因数目为11～14个，h为73.00 %～84.27 %，DP为94.53 %～96.47 %，EPP为67.00 %～70.00 %。美国、德国^[12]、意大利^[3]、葡萄牙^[4]及西班牙^[8,9]均以等位基因4最为常见，频率为24.70 %～30.00 %，其次为2、3、9或3、2、9。而中国由于地域广阔，不同地区、不同民族的人群调查结果有所不同，成都汉族^[6]和云南汉族^[5]均以等位基因4最为常见，其次分别为2、1、5或5、6、2；而中国畲族人群^[7]则以等位基因2为最常见，其次为3及1。在上述西方人群中出现频率较高的等位基因9(0.084～0.11)在中国人群中出现频率较低(0.008 2～0.021)。本次调查显示，河北汉族人群等位基因4最常见，其次为1和5，等位基因11最少见，次少见为等位基因9(0.012 4)，与云南汉族人群等位基因频率分布无显著差别(P=0.207 4)，而与成都汉族人群、中国畲族人群，以及西班牙、葡萄牙和意大利人群均有显著差别。说明地理隔离和民族差异对多态性位点的基因频率分布有一定影响。因此,在进行个人识别及亲子鉴定时，应以本地区人群的基因频率分布情况为依据。

    评价一个VNTR位点多态性的指标有h、DP、EPP及PIC等，用手工计算较繁琐，用时长，易出错，作者用C语言编写了软件，只要分别输入各等位基因例数和基因型例数就可计算上述各项指标，应用方便，准确性好，适用于各种机型，并且数据输入采用数据文件的方式，即便于检查输入错误，又可存档以备日后对照比较，从而为广泛应用VNTR位点的多态性进行个人识别、亲子鉴定及遗传连锁分析提供了有力的工具。

    参考文献

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    8.Gené M, Huguet E, Sánchez-García C, et al. Suitability of the YNZ22 (D17S5) VNTR polymorphism for legal medicine investigations in the population of Catalonia (Spain). Int J Leg Med, 1995,107:222

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    12. Pinhero MF, Pontes ML, Huguet E. Study of three AMPFLPs (D1S80, 3'ApoB and YNZ22) in the population of the North of Portugal. Forensic Sci Int, 1996,79(1):23

    (1999-3-03 收稿)(彭郁葱 丛 斌 姚玉霞 尤红煜 王俊霞 杨承珠 左 敏** 谷振勇**)

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