高效液相色谱法监测肾移植患者环孢素A的全血浓度
作者：刘滔滔 钟小斌 唐平
单位：刘滔滔 钟小斌 唐平 广西医科大学第一附属医院药剂科 南宁 530021
关键词：高效液相色谱法；环孢素A；监测
广西医科大学学报990333
摘要 目的：建立高效液相色谱法测定环孢素A的方法。方法：以环孢素D为内标。甲醇∶水(80∶20，V/V)为流动相，检测波长210 nm。结果：本法CsA与CsD分离效果好。在50～1000 μg/L范围线性良好，平均方法回收率为101.78%，日内及日间精密度<8%(n=5)。结论：本法简便、准确，能较好的满足临床血药浓度监测的需要。
中国图书资料分类法分类号 R969.1
RP-HPLC DETERMINATION OF CYCLOSPORINE A IN WHOLE BLOOD
, 百拇医药
Liu Taotao,Zhong Xiaobin，Tang Ping
Department of Pharmacy,the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University,Nanning 530021
Abstract Objective:A rapid,simple HPLC method was established for CsA.Methods:The molie phase consisted of methanol∶water (80∶20).The dectected wave length was 210 nm and flow rate was 1.5 ml.min-1.Internal standard was chlordiazepoxidum.Results:The CsA and CsD separated well.The assay linerit was determined over the range of 50～1000 μg/L.(r=0.9993) The mean recovery was 101.78%.Within-day and between-day variation co-efficients were less than 8%.Conclusion:The method is rapid,simple and have a good concentration，and good for therapeutic drug monitoring.
, 百拇医药
Key words HPLC;CsA;therapeutic durg monitoring
环孢素A(Cyclosporine A,CsA)是一种强有力的免疫抑制剂，目前已广泛应用于器官移植术后的抗排异反应[1]。由于其血药浓度与疗效和毒副作用密切相关，而且个体差异大，因此血药浓度监测对维护病人的最佳免疫抑制水平至关重要[2]。目前测定CsA血药浓度的方法有RIA法、FPIA法和HPLC法等，前两法易受代谢物影响而发生交叉反应[3]。我们用HPLC法对器官移植病人术后CsA的全血浓度进行监测，并对色谱条件、提取方法等进行了研究和改进，使其能较好满足临床的需要。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂：日本岛津系列LC-6A高效液相色谱仪，包括SPD-6AV检测器，SCL-6B系统控制器和C-R4A色谱数据处理仪。环孢素A标准品和环孢素D标准品均由Sandoz公司提供。
, 百拇医药
CsA贮备液：精密称取CsA标准品10 mg,置10 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度。内标溶液：精密称取CsD 1 mg,置10 ml量瓶中，加甲醇至刻度。精密吸取1 ml上述溶液，置10 ml量瓶中，加甲醇至刻度。贮备液与内标液均置冰箱保存。
甲醇、叔丁基甲醚、正己烷等均为分析纯。
1.2 色谱条件：色谱柱为Shim-pack CLC-C8柱(150 mm×6 mm,10 μm)；流动相为甲醇∶水(80∶20，V/V)；流速1.5 ml/min；检测波长210 nm；柱温70℃。
1.3 血样处理和测定方法：取全血0.5 ml，加入内标溶液12μl及0.1 mol/L盐酸溶液2 ml，旋涡混合30 s后加入叔丁基甲醚5 ml混合提取3 min，于3000 r/min离心10 min，吸取上层液于另一试管中，加入0.1 mol/L氢氧化钠溶液2 ml，旋涡振荡30 s，于3000 r/min离心10 min，吸取上层液于60℃以下水浴分两次氮气吹干，提取物用100 μl正己烷和60 μl质量浓度为1%的硫酸铵溶液充分溶解后取下层液20 μl进样。以CsA和内标峰高比R=HA/HD(HA为CsA峰高，HD为内标峰高)为定量计算依据，计算全血中CsA的含量。
, 百拇医药
2 结果
2.1 色谱行为与色谱峰定性：在上述色谱条件下，色谱分离情况见图1、2，环孢素A保留时间为8.8 min，内标环孢素D保留时间为10.3 min。可见血中杂质对CsA的分离无干扰，并且内标与CsA可完全分离。
图1 标准血样色谱图
1 环孢素A 2 内标环孢素D
图2 样品血样色谱图
1 环孢素A 2 内标环孢素D
2.2 线性关系及检测限：取空白血0。5ml，分别加入一定量的CsA贮备液，使浓度分别为50、100、200、320、480、720、10002μg/L，按血样处理和测定方法测定，以峰高比对备药浓度作回归分析，回归议程为Y=6.396
10-3X+0.4032(r=0.9993，n=7)，可见全血CsA浓度在50～1000 μg/L范围内线性关系良好。最低检测浓度为10 μg/L。
, 百拇医药
2.3 方法回收率及精密度：配制CsA浓度分别为100、320、720 μg/L的标准血样，经预处理后进行日内、日间精密度测定，结果见表1。
表1 方法回收率及精密度
加入量
(ρB/μg.L-1)
测得量
(ρB/μg.L-1)
回收率
(%)
RSD
, 百拇医药
(%)
日内
100
109.06±4.967
109.1±4.9
4.6
(n=5)
320
333.18±24.35
104.1±7.6
7.3
720
718.15±56.62
, 百拇医药
99.7±7.9
7.9
日间
100
108.30±6.642
108.36±6.6
6.1
(n=5)
320
300.90±21.08
94.0±6.6
7.0
, 百拇医药 720
687.31±33.18
95.5±4.6
4.8
2.4 干扰实验：在上述色谱条件下，苯巴比妥、卡马西平、丝裂霉素、尼莫地平、尼群地平、硝苯地平、心律平、茶碱、硝西泮、阿普唑仑、氯硝安定、地西泮、艾司唑仑、氯氮卓、安眠酮、 甲氨蝶呤、地尔硫卓18种药物对测定无干扰。3 讨论
3.1 目前国内外测定全血中CsA的方法主要有荧光偏振免疫测定法(FPIA)和HPLC法。虽然FPIA检测灵敏度较高，但其检测特异性及准确性差，实际应用中采用HPLC较多[4]。全血样品的处理方法，一般需经液-液萃取并结合固相富集或经多次萃取，操作繁琐、试剂复杂，本法利用强酸、强碱去除大部分内源性杂质，再经正己烷进一步除去干扰物后进样，简化了操作， 结果准确，回收率高，精密度良好。
, 百拇医药
3.2 文献报道的流动相以三元、四元流动相体系为多[3～5]，且用毒性大的乙腈或对色谱柱有损害的缓冲液。本法仅采用甲醇∶水(80∶20，V/V)为流动相，更为简单经济，毒性小，且取得很好的效果，样品峰与内标峰分离效果好，峰型尖窄对称，保留时间适宜，最低检测浓度优于所有国内文献报道方法。
3.3 检测波长的选择，文献报道不一，我们观察了λ=214，212，210，208，204 nm时对测定的影响，综合分离度、杂质干扰等因素，采用210 nm为检测波长。
参考文献1
1 Cohen DJ，Loertscher R，Rubin MF，et al.Cyclosporine A:a new immunosuppive agent for organ transplantation.Ann Intern Med，1984，101:67
, http://www.100md.com
2 余细勇，林曙光.高效液相色谱法测定环孢素A血药浓度.现代应用药学，1993，10(5):26
3 刘定勇，邹远高，梁茂植，等.改良高效液相色谱法监测肾移植患者环孢素A的全血浓度.华西医科大学学报，1995，26(4):455
4 李克，王平，袁倚盛，等.单步萃取-反相高效液相色谱法测定人全血中环孢素A及药动学参数.中国药学杂志，1997，32(3):157
5 梁玉，吴莱文.高效液相色谱法测定全血环孢素A.中华医学检验杂志，1992，15(4):206
收稿日期：1998-09-06, 百拇医药
单位：刘滔滔 钟小斌 唐平 广西医科大学第一附属医院药剂科 南宁 530021
关键词：高效液相色谱法；环孢素A；监测
广西医科大学学报990333
摘要 目的：建立高效液相色谱法测定环孢素A的方法。方法：以环孢素D为内标。甲醇∶水(80∶20，V/V)为流动相，检测波长210 nm。结果：本法CsA与CsD分离效果好。在50～1000 μg/L范围线性良好，平均方法回收率为101.78%，日内及日间精密度<8%(n=5)。结论：本法简便、准确，能较好的满足临床血药浓度监测的需要。
中国图书资料分类法分类号 R969.1
RP-HPLC DETERMINATION OF CYCLOSPORINE A IN WHOLE BLOOD
, 百拇医药
Liu Taotao,Zhong Xiaobin，Tang Ping
Department of Pharmacy,the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University,Nanning 530021
Abstract Objective:A rapid,simple HPLC method was established for CsA.Methods:The molie phase consisted of methanol∶water (80∶20).The dectected wave length was 210 nm and flow rate was 1.5 ml.min-1.Internal standard was chlordiazepoxidum.Results:The CsA and CsD separated well.The assay linerit was determined over the range of 50～1000 μg/L.(r=0.9993) The mean recovery was 101.78%.Within-day and between-day variation co-efficients were less than 8%.Conclusion:The method is rapid,simple and have a good concentration，and good for therapeutic drug monitoring.
, 百拇医药
Key words HPLC;CsA;therapeutic durg monitoring
环孢素A(Cyclosporine A,CsA)是一种强有力的免疫抑制剂，目前已广泛应用于器官移植术后的抗排异反应[1]。由于其血药浓度与疗效和毒副作用密切相关，而且个体差异大，因此血药浓度监测对维护病人的最佳免疫抑制水平至关重要[2]。目前测定CsA血药浓度的方法有RIA法、FPIA法和HPLC法等，前两法易受代谢物影响而发生交叉反应[3]。我们用HPLC法对器官移植病人术后CsA的全血浓度进行监测，并对色谱条件、提取方法等进行了研究和改进，使其能较好满足临床的需要。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂：日本岛津系列LC-6A高效液相色谱仪，包括SPD-6AV检测器，SCL-6B系统控制器和C-R4A色谱数据处理仪。环孢素A标准品和环孢素D标准品均由Sandoz公司提供。
, 百拇医药
CsA贮备液：精密称取CsA标准品10 mg,置10 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度。内标溶液：精密称取CsD 1 mg,置10 ml量瓶中，加甲醇至刻度。精密吸取1 ml上述溶液，置10 ml量瓶中，加甲醇至刻度。贮备液与内标液均置冰箱保存。
甲醇、叔丁基甲醚、正己烷等均为分析纯。
1.2 色谱条件：色谱柱为Shim-pack CLC-C8柱(150 mm×6 mm,10 μm)；流动相为甲醇∶水(80∶20，V/V)；流速1.5 ml/min；检测波长210 nm；柱温70℃。
1.3 血样处理和测定方法：取全血0.5 ml，加入内标溶液12μl及0.1 mol/L盐酸溶液2 ml，旋涡混合30 s后加入叔丁基甲醚5 ml混合提取3 min，于3000 r/min离心10 min，吸取上层液于另一试管中，加入0.1 mol/L氢氧化钠溶液2 ml，旋涡振荡30 s，于3000 r/min离心10 min，吸取上层液于60℃以下水浴分两次氮气吹干，提取物用100 μl正己烷和60 μl质量浓度为1%的硫酸铵溶液充分溶解后取下层液20 μl进样。以CsA和内标峰高比R=HA/HD(HA为CsA峰高，HD为内标峰高)为定量计算依据，计算全血中CsA的含量。
, 百拇医药
2 结果
2.1 色谱行为与色谱峰定性：在上述色谱条件下，色谱分离情况见图1、2，环孢素A保留时间为8.8 min，内标环孢素D保留时间为10.3 min。可见血中杂质对CsA的分离无干扰，并且内标与CsA可完全分离。
图1 标准血样色谱图
1 环孢素A 2 内标环孢素D
图2 样品血样色谱图
1 环孢素A 2 内标环孢素D
2.2 线性关系及检测限：取空白血0。5ml，分别加入一定量的CsA贮备液，使浓度分别为50、100、200、320、480、720、10002μg/L，按血样处理和测定方法测定，以峰高比对备药浓度作回归分析，回归议程为Y=6.396
10-3X+0.4032(r=0.9993，n=7)，可见全血CsA浓度在50～1000 μg/L范围内线性关系良好。最低检测浓度为10 μg/L。, 百拇医药
2.3 方法回收率及精密度：配制CsA浓度分别为100、320、720 μg/L的标准血样，经预处理后进行日内、日间精密度测定，结果见表1。
表1 方法回收率及精密度
加入量
(ρB/μg.L-1)
测得量
(ρB/μg.L-1)
回收率
(%)
RSD
, 百拇医药
(%)
日内
100
109.06±4.967
109.1±4.9
4.6
(n=5)
320
333.18±24.35
104.1±7.6
7.3
720
718.15±56.62
, 百拇医药
99.7±7.9
7.9
日间
100
108.30±6.642
108.36±6.6
6.1
(n=5)
320
300.90±21.08
94.0±6.6
7.0
, 百拇医药 720
687.31±33.18
95.5±4.6
4.8
2.4 干扰实验：在上述色谱条件下，苯巴比妥、卡马西平、丝裂霉素、尼莫地平、尼群地平、硝苯地平、心律平、茶碱、硝西泮、阿普唑仑、氯硝安定、地西泮、艾司唑仑、氯氮卓、安眠酮、 甲氨蝶呤、地尔硫卓18种药物对测定无干扰。3 讨论
3.1 目前国内外测定全血中CsA的方法主要有荧光偏振免疫测定法(FPIA)和HPLC法。虽然FPIA检测灵敏度较高，但其检测特异性及准确性差，实际应用中采用HPLC较多[4]。全血样品的处理方法，一般需经液-液萃取并结合固相富集或经多次萃取，操作繁琐、试剂复杂，本法利用强酸、强碱去除大部分内源性杂质，再经正己烷进一步除去干扰物后进样，简化了操作， 结果准确，回收率高，精密度良好。
, 百拇医药
3.2 文献报道的流动相以三元、四元流动相体系为多[3～5]，且用毒性大的乙腈或对色谱柱有损害的缓冲液。本法仅采用甲醇∶水(80∶20，V/V)为流动相，更为简单经济，毒性小，且取得很好的效果，样品峰与内标峰分离效果好，峰型尖窄对称，保留时间适宜，最低检测浓度优于所有国内文献报道方法。
3.3 检测波长的选择，文献报道不一，我们观察了λ=214，212，210，208，204 nm时对测定的影响，综合分离度、杂质干扰等因素，采用210 nm为检测波长。
参考文献1
1 Cohen DJ，Loertscher R，Rubin MF，et al.Cyclosporine A:a new immunosuppive agent for organ transplantation.Ann Intern Med，1984，101:67
, http://www.100md.com
2 余细勇，林曙光.高效液相色谱法测定环孢素A血药浓度.现代应用药学，1993，10(5):26
3 刘定勇，邹远高，梁茂植，等.改良高效液相色谱法监测肾移植患者环孢素A的全血浓度.华西医科大学学报，1995，26(4):455
4 李克，王平，袁倚盛，等.单步萃取-反相高效液相色谱法测定人全血中环孢素A及药动学参数.中国药学杂志，1997，32(3):157
5 梁玉，吴莱文.高效液相色谱法测定全血环孢素A.中华医学检验杂志，1992，15(4):206
收稿日期：1998-09-06, 百拇医药