RT-PCR法测定脂肪组织解偶联蛋白mRNA表达水平的探讨
作者：刘永明 Hannes Oberkofler Wolfgang Patsch
单位：刘永明 广西桂林医学院生物化学教研室 桂林 541001；Hannes Oberkofler，Wolfgang Patsch Department of Laboratory Medicine，Landerkrankenanstalten Salzburg，Austria
关键词：解偶联蛋白；mRNA；RT-PCR
广西医科大学学报990302 摘要 目的:建立解偶联蛋白(UCP) mRNA表达水平的竞争性RT-PCR测定法；并应用该方法测定UCP mRNA在成人腹膜内与腹膜外脂肪组织的表达水平。方法：应用剪接重叠延伸PCR (SOE-PCR)合成中央缺失型UCP竞争者RNA。UCP mRNA 与作为内设标准的UCP竞争者RNA用相同的引物在同一反应体系中进行逆转录反应和PCR扩增。通过比较UCP mRNA产物和UCP竞争者RNA产物的放射性信号强度求取UCP mRNA表达水平。结果：腹膜内与腹膜外脂肪组织样品中均检测到UCP mRNA；UCP mRNA表达水平腹膜内脂肪组织为(6.853±4.207)amol/fmol β-actin，腹膜外脂肪组织为(0.521±0.497)amol/fmol β-actin(
±s)(P<0.001)。结论:本竞争性RT-PCR方法测定脂肪组织UCP mRNA表达水平灵敏、准确；UCP mRNA在成人腹膜内与腹膜外脂肪组织均有表达，并且表达水平腹膜内脂肪组织高于腹膜外脂肪组织。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 Q753
QUANTIFICATION OF UNCOUPLING PROTEIN mRNA EXPRESSION LEVEL IN ADIPOSE TISSUE BY RT-PCR ASSAY
Liu Yongming
Department of Biochemistry,Guilin Medical College,Guilin 541001
Hannes Oberkofler,Wolfgang Patsch
Department of Laboratory Medicine,Landerkrankenanstalten Salzburg，Austria
, 百拇医药
Abstract Objective:To establish a competitive reverse transcription-PCR(cRT-PCR) assay for quantification of uncoupling protein (UCP) mRNA and determine UCP mRNA expression levels in intra-and extraperitoneal adipose tissues of adult humans.Methods:Splice overlap extension-PCR (SOE-PCR) was used for synthesis of a competitor fragment that contained a deletion at its center.UCP mRNA and UCP competitor RNA which was used as an internal standard were reverse transcribed and coamplified in one reaction in which the same primers were used.The signal intensities of UCP mRNA products were compared with the signal intensities of UCP competitor RNA products to quanlify UCP mRNA abundance.Results:UCP mRNA was detected in all intra-and extraperitoneal adipose tissue samples studied; UCP mRNA expression levels in intra- and extraperitoneal adipose tissues were (6.853±4.207) amol/fmol β-actin and (0.521±0.497) amol/fmol β-actin respectively (P<0.001).Conclusion:The cRT-PCR assay is a sensitive and accurate method for quantification of UCP mRNA expression level in adipose tissue;UCP mRNA expresses in both of intra-and extraperitoneal adipose tissues and UCP mRNA abundance is higher in intraperitoneal than in the extraperitoneal tissue.
, http://www.100md.com
Key words uncoupling protein; mRNA; RT-PCR
产热调节是机体能量消耗与体质量平衡的重要环节。在啮齿类动物,机体产热调节的主要部位是褐色脂肪组织(Brown adipose tissue,BAT),其中的解偶联蛋白(Uncoupling protein,UCP)在产热调节中起关键作用。UCP是一种在BAT特异表达的线粒体内膜蛋白质，分子质量为32×103u[1]。UCP的作用是使呼吸链的氧化与ADP磷酸化解偶联而成为产热过程[2]。在人类，UCP在机体产热调节中的作用还不明确。以往的观点认为，BAT在成年人已经消失。然而，近年的一些研究指出，户外工人和长期饮酒人群的颈动脉周围和心包有BAT分布[3，4]。此外，成人一些部位的脂肪组织被检测到UCP及其mRNA[5，6]。这些报道提示成人的产热调节仍有UCP的参与。为了进一步探讨UCP在成人总体能量消耗调节和体质量平衡中的作用，本文建立了UCP mRNA 的竞争性逆转录-PCR(Competitive reverse transcription-PCR,cRT-PCR)定量检测法，并对成人的腹膜内与腹膜外脂肪组织UCP mRNA表达水平进行了测定。现将结果报道如下。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品来源：脂肪组织来自进行胃箍术、胆囊切开术或疝气修补术等外科手术的患者，患者间无亲缘关系。其中取自腹部皮下的脂肪组织称腹膜外脂肪，取自腹腔内网膜的脂肪称腹膜内脂肪。脂肪组织取样后浸泡于预冷生理盐水运至实验室，经分装贮存于-70℃低温冰箱。
1.1.2 试剂：Tag DNA聚合酶和耐热逆转录酶Tth DNA聚合酶购自Perking-Elmer-Applied Biosy-
stems公司；Pfu DNA聚合酶购自Stratagene公司；质粒pGEM-3Zf购自Promega公司。其余试剂均为上述公司以及Sigma公司产品。
1.1.3 引物：UCP sense:5'-ACCTCGCTACACGGGG-AC-3'(+450,+467),UCP antisense:5'-GCACAGTTGGG-CACACTTTTGT-3'(+761,+740);SOE P1:5'-CCTCGAATAAGCTTTGAAATTGATGATGACACTTCT-3'(+562,+542),SOE P2:5'-TCAAAGCTTATTCTCGAGGCA-CTTGGTGTCGGCTCTT-3'(+655,+638)。
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1.2 方法
1.2.1 脂肪组织总RNA制备：取2 g脂肪组织参照 Chomczynski和Sacchi法[7]制备总RNA。RNA完整性通过观察rRNA 的含甲醛琼脂糖凝胶电泳图谱确定。RNA浓度用吸光度法于260nm波长测定。
1.2.2 UCP mRNA的测定
1.2.2.1 UCP竞争者(Δ UCP) RNA的合成： 用SOE-PCR法合成ΔUCP RNA。具体步骤为：①分别用UCP sense、SOE P1和UCP antisense、SOE P2两对引物于61℃(循环1～5)，57℃(循环6～10)和53℃(循环11～35)退火温度扩增 UCP cDNA模板，扩增产物用凝胶电泳纯化后得到 UCP 上游和下游cDNA片段，两片段经退火重叠连接，两端单链于72℃用Pfu DNA 聚合酶延伸10 min补成双链，并用作下一轮PCR的模板。PCR扩增用UCP sense和UCP antisense引物按上述退火温度循环35次。产物经凝胶电泳纯化得到中部有75 bp缺失，另插入19 bp外源性序列的UCP 256 bp cDNA 片段；②将该cDNA片段克隆于SmaⅠ消化的pGEM-3Zf；重组质粒以Hind Ⅲ消化呈线性化后用作体外转录模板，反应体系中加入[5-3H]UTP 进行体外转录；④凝胶电泳纯化3H标记RNA；⑤液体闪烁计算测RNA含量。
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1.2.2.2 cRT-PCR扩增野生型UCP mRNA(wt UCP mRNA)与△ UCP RNA：首先用0.6 μg脂肪组织总RNA与△ UCP RNA进行逆转录反应。反应分三管进行，△ UCP RNA用 量从管1至管3呈倍数递增。反应体积20 μl, 含2 U Tth DNA聚合酶,2.5 μmol UCP antisense引物,10 mmol Tris-HCl,pH 8.3,90 mmol KCl,10 mmol MgCl2和dNTP各2 mmol,于70℃反应30 min。然后从各管中取5 μl逆转录反应液进行PCR 扩增。反应体积100 μl,含 UCP sense和antisense引物各0.2 μmol,dNTP各200 μmol,10 mmol Tris-HCl,pH 8.3,50 mmol KCl,2.5 mmol MgCl2,2 mCi[α-32P] dCTP和2 U Taq酶。反应体系用石蜡油覆盖。反应开始于95 ℃变性5 min，然后于61℃(循环1～3)，57℃(循环4～6)和53℃(循环7～28)退火，72℃延伸以及95℃变性各1 min，循环28次，最后72 ℃延伸10 min。
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1.2.2.3 PCR产物的定量：PCR产物用4%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。凝胶经干燥后进行放射自显影，然后扫描测定各管UCP mRNA和UCP竞争者RNA区带的放射自显影强度。
1.2.2.4 UCP mRNA 表达水平表示法的标准化:用RNA酶保护检测法(Ribonuclease protection assay,RPA)测定总RNA样品的β-肌动蛋白(β-actin) mRNA表达水平，并以之为参照对UCP mRNA表达水平的表示法作标准化处理。标准化后的UCP mRNA表达水平表示单位为： amol/fmol β-actin mRNA。
1.3 统计学处理：所有数据以均数±标准差(
±s)表示,资料比较采用t检验。
2 结果
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wt UCP mRNA与△UCP RNA的cRT-PCR产物经凝胶电泳分离后的放射自显影图谱见图1。图中wtUCP mRNA与△UCP RNA片段分别为312bp和256bp,1、2和3的△UCP RNA用量分别为0.14，0.28和0.56 amol，区带的放射性信号强度也相应增强。本方法的重现性检测和回收实验结果见表1，成人脂肪组织UCP mRNA表达水平的测定结果见表2。
图1 腹膜内与腹膜外脂肪组织的cRT-PCR放射自显影图谱
I:腹膜内脂肪组织 II:腹膜外脂肪组织
表1 UCP[3H]RNA 在脂肪组织总RNA中的回收试验 样品
未加UCP[3H]RNA
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加入UCP[3H]RNA
(0.2amol/检测)
回收率
(%)
样品 A
0.070±0.008
0.250±0.032
90
样品 B
0.256±0.021
0.467±0.031
103
, 百拇医药
表2 成人腹膜内与腹膜外脂肪组织UCP mRNA表达水平
n
UCP mRNA
(amol/fmol β-actin)
腹膜内脂肪组织
21
6.853±4.207
腹膜外脂肪组织
15
0.521±0.497
P
<0.001
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3 讨论
近年来，UCP在成人脂肪组织中表达的有关报道使UCP在机体产热调节中的作用问题受到关注。因此，建立一种对UCP mRNA表达水平进行定量的检测方法对于这一问题的阐明应为十分必需。我们最初曾尝试用RPA法，但在总RNA用量达100 ng的情况下，只有少量样品检测到被保护UCP mRNA片段。因此，我们改用更敏感的RT-PCR法。
本文建立的cRT-PCR法以中央缺失型△ UCP mRNA为内设对照，与被检测的wt UCP RNA用相同引物在同一反应体系中共同进行RT-PCR扩增，从而可避免因内设对照与靶片段用不同引物扩增而出现的引物结合效率问题。此外，wt UCP mRNA与△ UCP RNA 产物片段大小适合凝胶电泳分离。重现性检测和回收试验显示：本方法重现性好，回收结果理想。而且，有很高的灵敏度 (UCP mRNA检测浓度<0.07 amol/assay)。
对成人腹膜内和腹膜外脂肪组织样品的测定结果显示：①本研究的腹膜内与腹膜外脂肪组织样品中均检测到UCP mRNA；②UCP mRNA表达水平腹膜内脂肪组织为(6.853±4.207)amol/fmol β-actin，腹膜外脂肪组织为(0.521±0.497)amol/fmol β-actin。表明成人的腹膜内与腹膜外脂肪均有UCP mRNA表达，并且表达水平腹膜内高于腹膜外脂肪组织(P<0.001)。此结果支持并扩充了前人[3，5]有关UCP 在成人脂肪组织表达的研究。
, 百拇医药
*本研究由桂林医学院人才工程基金和奥地利萨尔茨堡医学研究基金资助
参考文献
1 Klaus S,Casteilla L,Bouillaud F,et al.The uncoupling protein UCP: a membranous mitochondrial ion carrier exclusively expressed in brown adipose tissue.Int J Biochem,1991,23:791～801
2 Lowell BB,Flier JS.Brown adipose tissue,β 3-adrenergic receptors,and obesity.Annu Rev Med,1997,48:307～316
3 Huttunen P,Hirvonen J,Kinnula V.The occurrence of brown adipose tissue in outdoor workers.Eur J Appl Physiol,1981,46:339～345
, 百拇医药
4 Huttunen P,Kortelainen MJ.Longterm alcohol consumption and brown adipose tissue in man.Eur J Appl Physiol,1990,60:418～424
5 Garruti G,Ricquiec D.Analysis of uncoupling protein and its mRNA in adipose tissue deposits of adult humans.Int J Obes Relat Metab Disord,1992,16:383～390
6 Krief S,Loenngvist F,Raimbault S,et al.Tissue distribution of beta 3 adrenergic receptor mRNA in man.J Clin Invest 1993,91:344～349
7 Chomczynski N,Sacchi N.Single-step method of RNA isolation by acid quanidinium thiocyanate-phenol-chlorop-horm extraction.Anal Biochem,1987,162:156～159
收稿日期：1998-12-16, 百拇医药
单位：刘永明 广西桂林医学院生物化学教研室 桂林 541001；Hannes Oberkofler，Wolfgang Patsch Department of Laboratory Medicine，Landerkrankenanstalten Salzburg，Austria
关键词：解偶联蛋白；mRNA；RT-PCR
广西医科大学学报990302 摘要 目的:建立解偶联蛋白(UCP) mRNA表达水平的竞争性RT-PCR测定法；并应用该方法测定UCP mRNA在成人腹膜内与腹膜外脂肪组织的表达水平。方法：应用剪接重叠延伸PCR (SOE-PCR)合成中央缺失型UCP竞争者RNA。UCP mRNA 与作为内设标准的UCP竞争者RNA用相同的引物在同一反应体系中进行逆转录反应和PCR扩增。通过比较UCP mRNA产物和UCP竞争者RNA产物的放射性信号强度求取UCP mRNA表达水平。结果：腹膜内与腹膜外脂肪组织样品中均检测到UCP mRNA；UCP mRNA表达水平腹膜内脂肪组织为(6.853±4.207)amol/fmol β-actin，腹膜外脂肪组织为(0.521±0.497)amol/fmol β-actin(
±s)(P<0.001)。结论:本竞争性RT-PCR方法测定脂肪组织UCP mRNA表达水平灵敏、准确；UCP mRNA在成人腹膜内与腹膜外脂肪组织均有表达，并且表达水平腹膜内脂肪组织高于腹膜外脂肪组织。, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 Q753
QUANTIFICATION OF UNCOUPLING PROTEIN mRNA EXPRESSION LEVEL IN ADIPOSE TISSUE BY RT-PCR ASSAY
Liu Yongming
Department of Biochemistry,Guilin Medical College,Guilin 541001
Hannes Oberkofler,Wolfgang Patsch
Department of Laboratory Medicine,Landerkrankenanstalten Salzburg，Austria
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Abstract Objective:To establish a competitive reverse transcription-PCR(cRT-PCR) assay for quantification of uncoupling protein (UCP) mRNA and determine UCP mRNA expression levels in intra-and extraperitoneal adipose tissues of adult humans.Methods:Splice overlap extension-PCR (SOE-PCR) was used for synthesis of a competitor fragment that contained a deletion at its center.UCP mRNA and UCP competitor RNA which was used as an internal standard were reverse transcribed and coamplified in one reaction in which the same primers were used.The signal intensities of UCP mRNA products were compared with the signal intensities of UCP competitor RNA products to quanlify UCP mRNA abundance.Results:UCP mRNA was detected in all intra-and extraperitoneal adipose tissue samples studied; UCP mRNA expression levels in intra- and extraperitoneal adipose tissues were (6.853±4.207) amol/fmol β-actin and (0.521±0.497) amol/fmol β-actin respectively (P<0.001).Conclusion:The cRT-PCR assay is a sensitive and accurate method for quantification of UCP mRNA expression level in adipose tissue;UCP mRNA expresses in both of intra-and extraperitoneal adipose tissues and UCP mRNA abundance is higher in intraperitoneal than in the extraperitoneal tissue.
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Key words uncoupling protein; mRNA; RT-PCR
产热调节是机体能量消耗与体质量平衡的重要环节。在啮齿类动物,机体产热调节的主要部位是褐色脂肪组织(Brown adipose tissue,BAT),其中的解偶联蛋白(Uncoupling protein,UCP)在产热调节中起关键作用。UCP是一种在BAT特异表达的线粒体内膜蛋白质，分子质量为32×103u[1]。UCP的作用是使呼吸链的氧化与ADP磷酸化解偶联而成为产热过程[2]。在人类，UCP在机体产热调节中的作用还不明确。以往的观点认为，BAT在成年人已经消失。然而，近年的一些研究指出，户外工人和长期饮酒人群的颈动脉周围和心包有BAT分布[3，4]。此外，成人一些部位的脂肪组织被检测到UCP及其mRNA[5，6]。这些报道提示成人的产热调节仍有UCP的参与。为了进一步探讨UCP在成人总体能量消耗调节和体质量平衡中的作用，本文建立了UCP mRNA 的竞争性逆转录-PCR(Competitive reverse transcription-PCR,cRT-PCR)定量检测法，并对成人的腹膜内与腹膜外脂肪组织UCP mRNA表达水平进行了测定。现将结果报道如下。
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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品来源：脂肪组织来自进行胃箍术、胆囊切开术或疝气修补术等外科手术的患者，患者间无亲缘关系。其中取自腹部皮下的脂肪组织称腹膜外脂肪，取自腹腔内网膜的脂肪称腹膜内脂肪。脂肪组织取样后浸泡于预冷生理盐水运至实验室，经分装贮存于-70℃低温冰箱。
1.1.2 试剂：Tag DNA聚合酶和耐热逆转录酶Tth DNA聚合酶购自Perking-Elmer-Applied Biosy-
stems公司；Pfu DNA聚合酶购自Stratagene公司；质粒pGEM-3Zf购自Promega公司。其余试剂均为上述公司以及Sigma公司产品。
1.1.3 引物：UCP sense:5'-ACCTCGCTACACGGGG-AC-3'(+450,+467),UCP antisense:5'-GCACAGTTGGG-CACACTTTTGT-3'(+761,+740);SOE P1:5'-CCTCGAATAAGCTTTGAAATTGATGATGACACTTCT-3'(+562,+542),SOE P2:5'-TCAAAGCTTATTCTCGAGGCA-CTTGGTGTCGGCTCTT-3'(+655,+638)。
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1.2 方法
1.2.1 脂肪组织总RNA制备：取2 g脂肪组织参照 Chomczynski和Sacchi法[7]制备总RNA。RNA完整性通过观察rRNA 的含甲醛琼脂糖凝胶电泳图谱确定。RNA浓度用吸光度法于260nm波长测定。
1.2.2 UCP mRNA的测定
1.2.2.1 UCP竞争者(Δ UCP) RNA的合成： 用SOE-PCR法合成ΔUCP RNA。具体步骤为：①分别用UCP sense、SOE P1和UCP antisense、SOE P2两对引物于61℃(循环1～5)，57℃(循环6～10)和53℃(循环11～35)退火温度扩增 UCP cDNA模板，扩增产物用凝胶电泳纯化后得到 UCP 上游和下游cDNA片段，两片段经退火重叠连接，两端单链于72℃用Pfu DNA 聚合酶延伸10 min补成双链，并用作下一轮PCR的模板。PCR扩增用UCP sense和UCP antisense引物按上述退火温度循环35次。产物经凝胶电泳纯化得到中部有75 bp缺失，另插入19 bp外源性序列的UCP 256 bp cDNA 片段；②将该cDNA片段克隆于SmaⅠ消化的pGEM-3Zf；重组质粒以Hind Ⅲ消化呈线性化后用作体外转录模板，反应体系中加入[5-3H]UTP 进行体外转录；④凝胶电泳纯化3H标记RNA；⑤液体闪烁计算测RNA含量。
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1.2.2.2 cRT-PCR扩增野生型UCP mRNA(wt UCP mRNA)与△ UCP RNA：首先用0.6 μg脂肪组织总RNA与△ UCP RNA进行逆转录反应。反应分三管进行，△ UCP RNA用 量从管1至管3呈倍数递增。反应体积20 μl, 含2 U Tth DNA聚合酶,2.5 μmol UCP antisense引物,10 mmol Tris-HCl,pH 8.3,90 mmol KCl,10 mmol MgCl2和dNTP各2 mmol,于70℃反应30 min。然后从各管中取5 μl逆转录反应液进行PCR 扩增。反应体积100 μl,含 UCP sense和antisense引物各0.2 μmol,dNTP各200 μmol,10 mmol Tris-HCl,pH 8.3,50 mmol KCl,2.5 mmol MgCl2,2 mCi[α-32P] dCTP和2 U Taq酶。反应体系用石蜡油覆盖。反应开始于95 ℃变性5 min，然后于61℃(循环1～3)，57℃(循环4～6)和53℃(循环7～28)退火，72℃延伸以及95℃变性各1 min，循环28次，最后72 ℃延伸10 min。
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1.2.2.3 PCR产物的定量：PCR产物用4%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。凝胶经干燥后进行放射自显影，然后扫描测定各管UCP mRNA和UCP竞争者RNA区带的放射自显影强度。
1.2.2.4 UCP mRNA 表达水平表示法的标准化:用RNA酶保护检测法(Ribonuclease protection assay,RPA)测定总RNA样品的β-肌动蛋白(β-actin) mRNA表达水平，并以之为参照对UCP mRNA表达水平的表示法作标准化处理。标准化后的UCP mRNA表达水平表示单位为： amol/fmol β-actin mRNA。
1.3 统计学处理：所有数据以均数±标准差(
±s)表示,资料比较采用t检验。2 结果
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wt UCP mRNA与△UCP RNA的cRT-PCR产物经凝胶电泳分离后的放射自显影图谱见图1。图中wtUCP mRNA与△UCP RNA片段分别为312bp和256bp,1、2和3的△UCP RNA用量分别为0.14，0.28和0.56 amol，区带的放射性信号强度也相应增强。本方法的重现性检测和回收实验结果见表1，成人脂肪组织UCP mRNA表达水平的测定结果见表2。
图1 腹膜内与腹膜外脂肪组织的cRT-PCR放射自显影图谱
I:腹膜内脂肪组织 II:腹膜外脂肪组织
表1 UCP[3H]RNA 在脂肪组织总RNA中的回收试验 样品
未加UCP[3H]RNA
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加入UCP[3H]RNA
(0.2amol/检测)
回收率
(%)
样品 A
0.070±0.008
0.250±0.032
90
样品 B
0.256±0.021
0.467±0.031
103
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表2 成人腹膜内与腹膜外脂肪组织UCP mRNA表达水平
n
UCP mRNA
(amol/fmol β-actin)
腹膜内脂肪组织
21
6.853±4.207
腹膜外脂肪组织
15
0.521±0.497
P
<0.001
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3 讨论
近年来，UCP在成人脂肪组织中表达的有关报道使UCP在机体产热调节中的作用问题受到关注。因此，建立一种对UCP mRNA表达水平进行定量的检测方法对于这一问题的阐明应为十分必需。我们最初曾尝试用RPA法，但在总RNA用量达100 ng的情况下，只有少量样品检测到被保护UCP mRNA片段。因此，我们改用更敏感的RT-PCR法。
本文建立的cRT-PCR法以中央缺失型△ UCP mRNA为内设对照，与被检测的wt UCP RNA用相同引物在同一反应体系中共同进行RT-PCR扩增，从而可避免因内设对照与靶片段用不同引物扩增而出现的引物结合效率问题。此外，wt UCP mRNA与△ UCP RNA 产物片段大小适合凝胶电泳分离。重现性检测和回收试验显示：本方法重现性好，回收结果理想。而且，有很高的灵敏度 (UCP mRNA检测浓度<0.07 amol/assay)。
对成人腹膜内和腹膜外脂肪组织样品的测定结果显示：①本研究的腹膜内与腹膜外脂肪组织样品中均检测到UCP mRNA；②UCP mRNA表达水平腹膜内脂肪组织为(6.853±4.207)amol/fmol β-actin，腹膜外脂肪组织为(0.521±0.497)amol/fmol β-actin。表明成人的腹膜内与腹膜外脂肪均有UCP mRNA表达，并且表达水平腹膜内高于腹膜外脂肪组织(P<0.001)。此结果支持并扩充了前人[3，5]有关UCP 在成人脂肪组织表达的研究。
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参考文献
1 Klaus S,Casteilla L,Bouillaud F,et al.The uncoupling protein UCP: a membranous mitochondrial ion carrier exclusively expressed in brown adipose tissue.Int J Biochem,1991,23:791～801
2 Lowell BB,Flier JS.Brown adipose tissue,β 3-adrenergic receptors,and obesity.Annu Rev Med,1997,48:307～316
3 Huttunen P,Hirvonen J,Kinnula V.The occurrence of brown adipose tissue in outdoor workers.Eur J Appl Physiol,1981,46:339～345
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4 Huttunen P,Kortelainen MJ.Longterm alcohol consumption and brown adipose tissue in man.Eur J Appl Physiol,1990,60:418～424
5 Garruti G,Ricquiec D.Analysis of uncoupling protein and its mRNA in adipose tissue deposits of adult humans.Int J Obes Relat Metab Disord,1992,16:383～390
6 Krief S,Loenngvist F,Raimbault S,et al.Tissue distribution of beta 3 adrenergic receptor mRNA in man.J Clin Invest 1993,91:344～349
7 Chomczynski N,Sacchi N.Single-step method of RNA isolation by acid quanidinium thiocyanate-phenol-chlorop-horm extraction.Anal Biochem,1987,162:156～159
收稿日期：1998-12-16, 百拇医药