光动力学疗法联合5-氟尿嘧啶治疗小鼠移植性实体肿瘤
作者：盛梓松 顾瑛 黄英才
单位：盛梓松 武装警察部队总医院保健办公室(北京市，100039)；顾瑛 黄英才 解放军总医院激光科
关键词：光化学疗法；药物疗法；肿瘤
中国激光医学杂志990305摘要
目的 探讨增强光动力学疗法(PDT)治疗恶性肿瘤疗效的有效途径。
方法 80只昆明种小白鼠于皮下接种小鼠肝癌细胞，待肿瘤长到6～8mm，随机分为先化疗后PDT、先PDT后化疗、单纯PDT、单纯化疗和空白对照共5组，每组16只。化疗方法为腹腔注射5-氟尿嘧啶75μg/g；PDT方法为经尾静脉注射血卟啉单醚20μg/g后3h以能量密度135J/cm2的铜蒸气激光照射肿瘤部位。
, 百拇医药
结果 采用不同治疗措施的4组小鼠瘤体缩小，而空白对照组小鼠瘤体迅速增大，各治疗组与空白对照组比较，差异均有显著意义(P<0.05)。各治疗组中以先化疗后PDT组瘤体缩小尤为显著，与其他3组比较，差异有显著意义(P<0.05)。
结论 PDT和化疗均有抑瘤效应，两种方法联合运用可提高对小鼠移植瘤的疗效，而先化疗后PDT治疗的疗效优于先PDT后化疗。
Experimental Study of Photodynamic Therapy Combined with Chemother apy
of Subcutaneously Transplanted Hepatoma in Mice
SHENG Zisong，Department of Healthy, Chinese People's Armed Police Forces General Hospital, Beijing 100039
, 百拇医药
GU Ying， HUANG Yingcai
Department of Laser Medicine, Chinese PLA General Hospital, Beijing
ABSTRACT
Objective To explore the possibility of photodynamic therapy (PDT) combined with chemotherapy (CMT) to improve the effectiveness of cancer treatment .
Methods 80 mice with subcutaneously transplanted hepatoma that grew to 6-8mm were randomly divided into 5 groups: CMT-PDT; PDT-CMT; PDT; CMT and control. Each group had 16 mice. CMT: 5-Fu (75μg/g) was injected i.p. PDT: H ematoporphyrin monomethyl ether (HMME) (20μg/g) was injected i.v. and followed by laser irradiation (wavelength 510.6nm, power density 135 J/cm2) 3 hours l ater.
, 百拇医药
Results The size of the tumors in 4 groups with different treatment reduced rapidly and the tumors in control group enlarged rapidly. A statistically significant difference was found between the experimental groups and the control group (P<0.05). In the experimental groups, the inhibition rate of CMT-PDT group was significantly higher than that of other 3 groups . The differences were statistically significant (P<0.05) .
Conclusions PDT and CMT have inhibition effect on tumors . The resutls revealed that PDT combined with CMT might excert better destructiv eeffect on tumors, and the destructive effect of CMT-PDT was significantly hi gher than that of PDT-CMT.
, 百拇医药
Key words Photochemotherapy; Drug therapy; Neoplasms
光动力学疗法(PDT)经多年的研究和临床实践取得了很大进展，在肿瘤治疗中发挥了很大作用。然而，PDT尚存在光线的穿透深度不够、对深部及较大体积的实体瘤难以获得完全效应等问题。为了提高PDT疗效、延长肿瘤患者的生存期，近年来国内外学者积极进行PDT与传统治疗方法联合应用的研究，如PDT与全身或局部化疗、外科手术、微波疗法、放疗或热疗相结合等[1]。我们以小鼠皮下移植性肝细胞癌为实验对象，观察比较单纯PDT、单纯化疗和PDT联合化疗的抑瘤效果，探讨增强PDT对恶性肿瘤治疗作用的有效途径。
材料与方法
一、实验对象及分组
昆明种小白鼠80只，雌雄各半，体重20～22g，由解放军总医院实验动物中心提供。取浓度为107/ml的小鼠肝癌瘤细胞(瘤株由海军总医院中心实验室提供)悬液，每只小鼠0.2ml接种于右后腿根部皮下，待肿瘤长到6～8mm，随机分为先化疗后PDT、先PDT后化疗、单纯PDT、单纯化疗和空白对照共5组，每组16只小鼠。
, 百拇医药
二、方法
化疗方法为每只小鼠腹腔注射5-氟尿嘧啶(5-Fu)75μg/g。PDT方法为每只小鼠经尾静脉注射血卟啉单甲醚(hematoperphyrinmonomethylether,简称HMME，第二军医大学抗疟药研室提供)20μg/g后3h，用铜蒸气激光照射小鼠肿瘤部位。照光前将肿瘤处脱毛，10%水合氯醛0.1ml腹腔注射麻醉，四肢固定。所用激光仪为ModelIECu-10型铜蒸气激光器(中国科学院电子研究所生产)，脉冲输出，脉宽20～40ns，频率6kHz，波长510.6nm，功率密度150mW/cm2，照射时间15min，能量密度135J/cm2，光斑直径2cm，由扩束光纤输出。
先化疗后PDT组实验第1天给予化疗，第2天给予PDT。先PDT后化疗组实验第1天给予PDT，第2天给予化疗。空白对照组每只小鼠腹腔注射生理盐水0.4ml。
, http://www.100md.com 照光和/或化疗后小鼠继续常规饲养，观察肿瘤部位变化。于实验第7天，以颈椎离断法处死全部小鼠。处死后先测量肿瘤体积，然后分离肿瘤并称重。测量方法：用游标卡尺测量肿瘤直径(D)，按直角测量2次，取其平均值。最后计算肿瘤体积(V)、肿瘤体积抑制率(VIR)和肿瘤重量抑制率(WIR)。
V=1/6πD3
VIR(%)=(空白对照组肿瘤体积-治疗组肿瘤体积)/空白对照组肿瘤体积×100%
WIR(%)=[1-(治疗组平均肿瘤重量/空白对照组平均肿瘤重量)]×100%
瘤组织用10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片，HE染色，观察组织学变化。
三、统计学处理
数据以
±s表示，采用SAS统计软件进行方差分析，若有差异，再行组间t检验。P<0.05为差异具有显著意义。
, http://www.100md.com
结 果
一、肿瘤体积和重量
先化疗后PDT组小鼠照光后24h照区皮肤红肿、渗出，2～3天局部坏死、结痂、瘤体缩小。先PDT后化疗组和单纯PDT组小鼠照光后3～4天瘤体表面发黑结痂、瘤体缩小。单纯化疗组小鼠瘤体表面无局灶性坏死，可见肿瘤缩小。空白对照组小鼠任何时间段均无皮肤和肿瘤坏死，瘤体逐渐增大。
采用不同措施的4个治疗组与空白对照组比较，肿瘤体积、重量的差异均有显著意义(表1、2)。4个治疗组中，先化疗后PDT组抑瘤作用明显高于其他3组(P<0.05)，其他3组之间抑瘤作用差异无显著意义(P>0.05)。
二、病理检查
各治疗组切片见癌细胞胞界不清，细胞质出现空泡样改变，核固缩、碎裂、溶解，出现凝固性或液化性坏死。对照组癌细胞无坏死。
, http://www.100md.com
表1 实验结束时各组小鼠肿瘤体积比较(±s)
Tab.1 Comparison of tumor volumes in different groups 分组
Groups
鼠数
No.of
mice
肿瘤体积
Tumor volume
(cm3)
, 百拇医药
肿瘤体积抑
制率
Inhibition rate
(%)
P值*
先化疗后PDT组
CMT-PDT group
16
0.14±0.04
93.2
<0.05
先PDT后化疗组
, http://www.100md.com
PDT-CMT group
16
0.50±0.08
75.8
<0.05
单纯PDT组
PDT group
16
0.59±0.16
71.5
<0.05
单纯化疗组
, 百拇医药
CMT group
16
0.57±0.10
72.5
<0.05
空白对照组
Control group
16
2.07±0.10
0.0
-
*与空白对照组比较Compared with control group
, 百拇医药
表2 实验结束时各组小鼠肿瘤重量比较(±s)
Tab.2 Comparison of tumor weights in different groups 分组
Groups
鼠数
No.of
mice
肿瘤重量
Tumor weight
(g)
, http://www.100md.com
肿瘤重量
抑制率
Inhibition rate
(%)
P值*
先化疗后PDT组
CMT-PDT group
16
0.12±0.08
91.9
<0.05
先PDT后化疗组
, 百拇医药
PDT-CMT group
16
0.38±0.07
74.
<0.05
单纯PDT组
PDT group
16
0.49±0.16
67.3
<0.05
单纯化疗组
, 百拇医药 CMT group
16
0.39±0.07
73.6
<0.05
空白对照组
Control group
16
1.48±0.86
0.0
[〗-
*与空白对照组比较Compared with control group
, 百拇医药
讨 论
PDT治疗肿瘤的机制，是肿瘤组织能够较长时间潴留光敏物质血卟啉衍生物(HpD)，在特定波长激光照射下，HpD可引发一系列光化学和光生物学反应，其中最重要的是产生单线态氧及释放前列腺素、淋巴因子、血栓素等细胞因子，破坏肿瘤组织的微血管和肿瘤细胞的生物膜，从而杀伤肿瘤细胞[2-5]。但激光穿透组织的能力有限，对深部及较大体积的实体瘤治疗效果不完全，使PDT的应用受到限制。
本研究结果表明，对移植于昆明种小鼠的肝癌细胞株所生成的肿瘤，单用PDT治疗、单用抗肿瘤药物治疗及PDT联合化疗治疗，均有抑制肿瘤生长、破坏肿瘤组织的作用，但在化疗基础上应用PDT，则抑瘤作用明显增强(P<0.05)。这一结果支持Doughery等[2]提出的化疗与PDT两种疗法产生协同作用有顺序依赖性的观点，即先化疗后PDT可产生协同作用，如改变这一顺序，则不会产生协同作用。这种协同作用的产生，可能与抗肿瘤药物对细胞周期的影响[6]和激光对抗肿瘤药物的激活[7]有关。不同的细胞周期时相，光敏剂在细胞内的聚集和分布是不同的。在细胞周期时相中，以S期细胞吸收HpD量最高，其次为G1期细胞，再次是G2+M期细胞。刘少臣等[6]的研究结果表明，5-Fu可将人舌鳞状细胞癌细胞的大部分阻断在G1期，癌细胞经5-Fu作用24h后再行PDT，细胞死亡率提高了近3倍。本实验中未作细胞周期测定，也未测定各组肿瘤细胞中的光敏剂剂量，但从实验结果看，可以推测是在5-Fu直接损伤小鼠肝癌细胞的基础上，PDT进一步发挥作用，从而使抑瘤率明显提高，表明先化疗后PDT是增强PDT疗效的有效途径。同时也提示，有必要进一步研究不同抗肿瘤药物对不同肿瘤细胞细胞周期的影响，阐明协同作用的机制及影响因素，更有效地发挥抗肿瘤药物和PDT对肿瘤细胞的杀伤作用，提高恶性肿瘤的治疗效果。
, 百拇医药
参考文献
1 Riondel J, Jacrot M, Picot F. Therapeutic response to taxol of six human tumors xenografted into nude mice. Cancer Chemother Phrmacol, 1986,17 :137-141.
2 Doughery TJ, Marcus SL. Photodynamic therapy. Eur J Cancer, 1992, 28A: 1734-1742.
3 Moan J, Berg K. Photochemotherapy of cancer: experimental rese arch. Photochem Photobiol, 1992, 55:931-948.
4 Henderson BW, Doughery TJ. How does photodynamic therapy work? Photochem Photobiol, 1992, 55:145-157.
5 黄英才, 范开春, 李峻亨. 肿瘤光动力学疗法生物医学机制研究进展. 中国医学物理杂志, 1994，11(4)：37-40.
6 刘少巨，赵福运，吴美娟. 光动力疗法与化疗药物合并应用对人舌鳞状细胞癌细胞株影响的实验研究. 中国激光医学杂志，1996，5：15-19.
7 哈献文. 激光光化学治疗：激光激活抗癌药. 中国激光医学杂志，1995，4 ：249-250.
(收稿日期：1998-09-04), http://www.100md.com
单位：盛梓松 武装警察部队总医院保健办公室(北京市，100039)；顾瑛 黄英才 解放军总医院激光科
关键词：光化学疗法；药物疗法；肿瘤
中国激光医学杂志990305摘要
目的 探讨增强光动力学疗法(PDT)治疗恶性肿瘤疗效的有效途径。
方法 80只昆明种小白鼠于皮下接种小鼠肝癌细胞，待肿瘤长到6～8mm，随机分为先化疗后PDT、先PDT后化疗、单纯PDT、单纯化疗和空白对照共5组，每组16只。化疗方法为腹腔注射5-氟尿嘧啶75μg/g；PDT方法为经尾静脉注射血卟啉单醚20μg/g后3h以能量密度135J/cm2的铜蒸气激光照射肿瘤部位。
, 百拇医药
结果 采用不同治疗措施的4组小鼠瘤体缩小，而空白对照组小鼠瘤体迅速增大，各治疗组与空白对照组比较，差异均有显著意义(P<0.05)。各治疗组中以先化疗后PDT组瘤体缩小尤为显著，与其他3组比较，差异有显著意义(P<0.05)。
结论 PDT和化疗均有抑瘤效应，两种方法联合运用可提高对小鼠移植瘤的疗效，而先化疗后PDT治疗的疗效优于先PDT后化疗。
Experimental Study of Photodynamic Therapy Combined with Chemother apy
of Subcutaneously Transplanted Hepatoma in Mice
SHENG Zisong，Department of Healthy, Chinese People's Armed Police Forces General Hospital, Beijing 100039
, 百拇医药
GU Ying， HUANG Yingcai
Department of Laser Medicine, Chinese PLA General Hospital, Beijing
ABSTRACT
Objective To explore the possibility of photodynamic therapy (PDT) combined with chemotherapy (CMT) to improve the effectiveness of cancer treatment .
Methods 80 mice with subcutaneously transplanted hepatoma that grew to 6-8mm were randomly divided into 5 groups: CMT-PDT; PDT-CMT; PDT; CMT and control. Each group had 16 mice. CMT: 5-Fu (75μg/g) was injected i.p. PDT: H ematoporphyrin monomethyl ether (HMME) (20μg/g) was injected i.v. and followed by laser irradiation (wavelength 510.6nm, power density 135 J/cm2) 3 hours l ater.
, 百拇医药
Results The size of the tumors in 4 groups with different treatment reduced rapidly and the tumors in control group enlarged rapidly. A statistically significant difference was found between the experimental groups and the control group (P<0.05). In the experimental groups, the inhibition rate of CMT-PDT group was significantly higher than that of other 3 groups . The differences were statistically significant (P<0.05) .
Conclusions PDT and CMT have inhibition effect on tumors . The resutls revealed that PDT combined with CMT might excert better destructiv eeffect on tumors, and the destructive effect of CMT-PDT was significantly hi gher than that of PDT-CMT.
, 百拇医药
Key words Photochemotherapy; Drug therapy; Neoplasms
光动力学疗法(PDT)经多年的研究和临床实践取得了很大进展，在肿瘤治疗中发挥了很大作用。然而，PDT尚存在光线的穿透深度不够、对深部及较大体积的实体瘤难以获得完全效应等问题。为了提高PDT疗效、延长肿瘤患者的生存期，近年来国内外学者积极进行PDT与传统治疗方法联合应用的研究，如PDT与全身或局部化疗、外科手术、微波疗法、放疗或热疗相结合等[1]。我们以小鼠皮下移植性肝细胞癌为实验对象，观察比较单纯PDT、单纯化疗和PDT联合化疗的抑瘤效果，探讨增强PDT对恶性肿瘤治疗作用的有效途径。
材料与方法
一、实验对象及分组
昆明种小白鼠80只，雌雄各半，体重20～22g，由解放军总医院实验动物中心提供。取浓度为107/ml的小鼠肝癌瘤细胞(瘤株由海军总医院中心实验室提供)悬液，每只小鼠0.2ml接种于右后腿根部皮下，待肿瘤长到6～8mm，随机分为先化疗后PDT、先PDT后化疗、单纯PDT、单纯化疗和空白对照共5组，每组16只小鼠。
, 百拇医药
二、方法
化疗方法为每只小鼠腹腔注射5-氟尿嘧啶(5-Fu)75μg/g。PDT方法为每只小鼠经尾静脉注射血卟啉单甲醚(hematoperphyrinmonomethylether,简称HMME，第二军医大学抗疟药研室提供)20μg/g后3h，用铜蒸气激光照射小鼠肿瘤部位。照光前将肿瘤处脱毛，10%水合氯醛0.1ml腹腔注射麻醉，四肢固定。所用激光仪为ModelIECu-10型铜蒸气激光器(中国科学院电子研究所生产)，脉冲输出，脉宽20～40ns，频率6kHz，波长510.6nm，功率密度150mW/cm2，照射时间15min，能量密度135J/cm2，光斑直径2cm，由扩束光纤输出。
先化疗后PDT组实验第1天给予化疗，第2天给予PDT。先PDT后化疗组实验第1天给予PDT，第2天给予化疗。空白对照组每只小鼠腹腔注射生理盐水0.4ml。
, http://www.100md.com 照光和/或化疗后小鼠继续常规饲养，观察肿瘤部位变化。于实验第7天，以颈椎离断法处死全部小鼠。处死后先测量肿瘤体积，然后分离肿瘤并称重。测量方法：用游标卡尺测量肿瘤直径(D)，按直角测量2次，取其平均值。最后计算肿瘤体积(V)、肿瘤体积抑制率(VIR)和肿瘤重量抑制率(WIR)。
V=1/6πD3
VIR(%)=(空白对照组肿瘤体积-治疗组肿瘤体积)/空白对照组肿瘤体积×100%
WIR(%)=[1-(治疗组平均肿瘤重量/空白对照组平均肿瘤重量)]×100%
瘤组织用10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片，HE染色，观察组织学变化。
三、统计学处理
数据以
±s表示，采用SAS统计软件进行方差分析，若有差异，再行组间t检验。P<0.05为差异具有显著意义。, http://www.100md.com
结 果
一、肿瘤体积和重量
先化疗后PDT组小鼠照光后24h照区皮肤红肿、渗出，2～3天局部坏死、结痂、瘤体缩小。先PDT后化疗组和单纯PDT组小鼠照光后3～4天瘤体表面发黑结痂、瘤体缩小。单纯化疗组小鼠瘤体表面无局灶性坏死，可见肿瘤缩小。空白对照组小鼠任何时间段均无皮肤和肿瘤坏死，瘤体逐渐增大。
采用不同措施的4个治疗组与空白对照组比较，肿瘤体积、重量的差异均有显著意义(表1、2)。4个治疗组中，先化疗后PDT组抑瘤作用明显高于其他3组(P<0.05)，其他3组之间抑瘤作用差异无显著意义(P>0.05)。
二、病理检查
各治疗组切片见癌细胞胞界不清，细胞质出现空泡样改变，核固缩、碎裂、溶解，出现凝固性或液化性坏死。对照组癌细胞无坏死。
, http://www.100md.com
表1 实验结束时各组小鼠肿瘤体积比较(
±s)Tab.1 Comparison of tumor volumes in different groups 分组
Groups
鼠数
No.of
mice
肿瘤体积
Tumor volume
(cm3)
, 百拇医药
肿瘤体积抑
制率
Inhibition rate
(%)
P值*
先化疗后PDT组
CMT-PDT group
16
0.14±0.04
93.2
<0.05
先PDT后化疗组
, http://www.100md.com
PDT-CMT group
16
0.50±0.08
75.8
<0.05
单纯PDT组
PDT group
16
0.59±0.16
71.5
<0.05
单纯化疗组
, 百拇医药
CMT group
16
0.57±0.10
72.5
<0.05
空白对照组
Control group
16
2.07±0.10
0.0
-
*与空白对照组比较Compared with control group
, 百拇医药
表2 实验结束时各组小鼠肿瘤重量比较(
±s)Tab.2 Comparison of tumor weights in different groups 分组
Groups
鼠数
No.of
mice
肿瘤重量
Tumor weight
(g)
, http://www.100md.com
肿瘤重量
抑制率
Inhibition rate
(%)
P值*
先化疗后PDT组
CMT-PDT group
16
0.12±0.08
91.9
<0.05
先PDT后化疗组
, 百拇医药
PDT-CMT group
16
0.38±0.07
74.
<0.05
单纯PDT组
PDT group
16
0.49±0.16
67.3
<0.05
单纯化疗组
, 百拇医药 CMT group
16
0.39±0.07
73.6
<0.05
空白对照组
Control group
16
1.48±0.86
0.0
[〗-
*与空白对照组比较Compared with control group
, 百拇医药
讨 论
PDT治疗肿瘤的机制，是肿瘤组织能够较长时间潴留光敏物质血卟啉衍生物(HpD)，在特定波长激光照射下，HpD可引发一系列光化学和光生物学反应，其中最重要的是产生单线态氧及释放前列腺素、淋巴因子、血栓素等细胞因子，破坏肿瘤组织的微血管和肿瘤细胞的生物膜，从而杀伤肿瘤细胞[2-5]。但激光穿透组织的能力有限，对深部及较大体积的实体瘤治疗效果不完全，使PDT的应用受到限制。
本研究结果表明，对移植于昆明种小鼠的肝癌细胞株所生成的肿瘤，单用PDT治疗、单用抗肿瘤药物治疗及PDT联合化疗治疗，均有抑制肿瘤生长、破坏肿瘤组织的作用，但在化疗基础上应用PDT，则抑瘤作用明显增强(P<0.05)。这一结果支持Doughery等[2]提出的化疗与PDT两种疗法产生协同作用有顺序依赖性的观点，即先化疗后PDT可产生协同作用，如改变这一顺序，则不会产生协同作用。这种协同作用的产生，可能与抗肿瘤药物对细胞周期的影响[6]和激光对抗肿瘤药物的激活[7]有关。不同的细胞周期时相，光敏剂在细胞内的聚集和分布是不同的。在细胞周期时相中，以S期细胞吸收HpD量最高，其次为G1期细胞，再次是G2+M期细胞。刘少臣等[6]的研究结果表明，5-Fu可将人舌鳞状细胞癌细胞的大部分阻断在G1期，癌细胞经5-Fu作用24h后再行PDT，细胞死亡率提高了近3倍。本实验中未作细胞周期测定，也未测定各组肿瘤细胞中的光敏剂剂量，但从实验结果看，可以推测是在5-Fu直接损伤小鼠肝癌细胞的基础上，PDT进一步发挥作用，从而使抑瘤率明显提高，表明先化疗后PDT是增强PDT疗效的有效途径。同时也提示，有必要进一步研究不同抗肿瘤药物对不同肿瘤细胞细胞周期的影响，阐明协同作用的机制及影响因素，更有效地发挥抗肿瘤药物和PDT对肿瘤细胞的杀伤作用，提高恶性肿瘤的治疗效果。
, 百拇医药
参考文献
1 Riondel J, Jacrot M, Picot F. Therapeutic response to taxol of six human tumors xenografted into nude mice. Cancer Chemother Phrmacol, 1986,17 :137-141.
2 Doughery TJ, Marcus SL. Photodynamic therapy. Eur J Cancer, 1992, 28A: 1734-1742.
3 Moan J, Berg K. Photochemotherapy of cancer: experimental rese arch. Photochem Photobiol, 1992, 55:931-948.
4 Henderson BW, Doughery TJ. How does photodynamic therapy work? Photochem Photobiol, 1992, 55:145-157.
5 黄英才, 范开春, 李峻亨. 肿瘤光动力学疗法生物医学机制研究进展. 中国医学物理杂志, 1994，11(4)：37-40.
6 刘少巨，赵福运，吴美娟. 光动力疗法与化疗药物合并应用对人舌鳞状细胞癌细胞株影响的实验研究. 中国激光医学杂志，1996，5：15-19.
7 哈献文. 激光光化学治疗：激光激活抗癌药. 中国激光医学杂志，1995，4 ：249-250.
(收稿日期：1998-09-04), http://www.100md.com