510.6nm激光诱导兔在体血管平滑肌细胞凋亡的研究
作者：顾瑛 刘凡光 江忆平 梁洁 李峻亨 朱建国
单位：解放军总医院激光科(北京市，100853)
关键词：激光；细胞凋亡；血管平滑肌细胞
中国激光医学杂志990303摘要
目的 观察510.6nm波长激光对兔在体血管平滑肌细胞(SMC)凋亡的诱导作用。
方法 日本大耳白兔36只，由股动脉导入柱状光纤至腹主动脉，对腹主动脉血管壁进行分段激光照射，功率密度分别为50、100、200或300mW/cm2，照射500或1000s。于照射后4、8、12、24或72h处死动物，取照射段腹主动脉，光镜观察SMC形态改变，DNA末端标记法确定细胞凋亡率。
结果 兔腹主动脉经100mW/cm2及以上功率密度的激光照射后24h，SMC可出现变性、凋亡和坏死三种损伤性改变，而血管内皮细胞无明显变化。激光诱导下SMC呈现典型的细胞凋亡形态特征：细胞明显固缩，细胞质着色加深，染色质固缩深染，并沿核膜着边排列。DNA末端标记显示，SMC凋亡与激光照射剂量有关。在100mW/cm2照射1000s和200mW/cm2照射500s组(能量密度均为100J/cm2)，细胞凋亡的发生率最高。
, 百拇医药
结论 510.6nm激光以能量密度100J/cm2照射，能使兔在体腹主动脉SMC发生细胞凋亡，且发生率较高。
Apoptosis of Vascular Smooth Muscle Cells in Vivo Induced by
510.6 nm Laser Irradiation
GU Ying, LIU Fanguang, JIANG Yiping, LIANG Jie, LI Junheng, ZHU Jianguo
Department of Laser Medicine, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853
ABSTRACT
, 百拇医药
Objective To investigate the effect of 510.6 nm laser irradiation on apoptosis of vascular smooth muscle cells(SMC).
Methods Rabbit normal abdominal aorta was irradiated by 510.6 nm laser with the power densities of 50, 100, 200 or 300 mW/cm2 and the energy dens ities of 50, 100, 150, 200 or 300 J/cm2. The apoptosis of SMC was identified by morphologic observation and specific labeling of nuclear DNA fragment (TU NEL) technique.
, 百拇医药
Results A typical appearance of apoptosis was found in the groups of the power densities of 100, 200 and 300 mW/cm2 at 24 hours after irradiati on. Apoptotic SMC showed that the cells and nuclei were condensed, and the fragm ented chromatin was arranged against the nuclear membrane. The TUNEL results ind icated that the incidence rate of apoptosis in the group of the energy density o f 100 J/cm2 was higher than that of other groups.
Conclusions 510.6 nm laser irradiation with the energy density of 100 J/cm2 may initiate apoptosis of SMC in vivo.
, 百拇医药
Keyword Lasers; Apoptosis; Vascularsmoothmusclecells
细胞凋亡是细胞组织、器官、系统发育成熟过程中的一种常见的生理现象，无功能或老化的细胞通过此种机制被淘汰，以维持组织器官的正常形态和功能[1]。血管平滑肌细胞(SMC)凋亡亦有同样的意义。在生理情况下，SMC凋亡可见于新生儿动脉导管的闭锁、萎缩；在非生理情况下，见于经皮腔内血管成形术(PTA)后血管的损伤修复。在PTA术后血管修复过程中，SMC增殖和凋亡之间的平衡决定着新生血管内膜的增厚程度，提高SMC凋亡率将有助于防止血管再狭窄的发生[2]。在以往的研究中，作者用510.6nm激光照射体外培养的兔SMC，成功地诱导出细胞凋亡[3]。本研究意在探索用510.6nm激光诱导兔在体SMC的凋亡。
材料和方法
一、激光设备
, http://www.100md.com
IECu-10型铜蒸气激光器(中国科学院电子研究所提供)，脉冲输出，脉宽20～40ns，输出波长510.6nm和578.2nm，经滤光后输出单一510.6nm波长；经400μm柱状光导纤维输出，光纤出光端长2.0cm。CLP-1型柱状激光功率计(军事医学科学院二所生产，中国计量科学研究院标定)监测输出功率。
二、实验动物及处理
日本大耳白兔36只(解放军总医院动物实验中心提供)，雄性，体重2.5～3.0kg。静脉注射复方氯胺酮麻醉。开腹暴露腹主动脉，以旁侧缝线作为标志将其划分为近心段、中间段、远心段，每段长20mm。然后分离出左侧股动脉，肝素化抗凝，由股动脉导入光纤至腹主动脉，分别对各段血管进行照射，照射后结扎股动脉，缝合切口。分别于照射后4、8、12、24和72h处死动物，按标志分段取出腹主动脉。
三、实验分组
, 百拇医药 实验动物按取材时间分成5组。24h组8只，每只兔的三段血管分别接受3种不同剂量的激光照射处理(含不照光对照)，使每一照射剂量组和对照组标本均来源于3只兔的近心段、中间段、远心段共三段血管(表1)；其余4组各7只，除不含无照光对照外，其他处理同24h组。
四、标本制备和形态学观察
每段血管两端各切除5mm(留取10mm)，4%甲醛固定，常规脱水、石蜡包埋、切片、HE染色。用OlympusBX50生物显微镜观察各段血管SMC和血
管内皮细胞(EC)的形态变化。
表1 激光照射后24h取材组8只兔激光照射方法
Tab.1 Grouping of laser irradiatio n and sampling at 24 hours later 兔编号
, 百拇医药
RabbitNo.
血管段
Aorta segment
近心段
Proximal
中段
Middle
远心段
Distal
1
A
B
C
, 百拇医药
2
D
E
F
3
G
H
A
4
B
C
D
5
E
, http://www.100md.com
F
G
6
H
A
B
7
C
D
E
8
F
G
H
, http://www.100md.com
注：A.50 mW/cm2×1000s，50 J/cm2；B.100 mW/cm2×500 s，50 J/cm 2；C.100 mW/cm2×1000s，100 J/cm2；D.200 mW/cm2×500s，100 J/cm2；E .200 mW/cm2×1000s，200 J/cm2；F.300 mW/cm2×500s，150 J/cm2；G.300 mW/cm2×1000 s，300 J/cm2；H.不照光 no laser irradiation
五、细胞凋亡率的检测方法
采用DNA末端标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)检测细胞凋亡率[4]。TUNEL试剂盒为德国保灵曼公司产品。标本的取材时间为术后24h，每份标本染2张切片，每组6张切片。操作按说明书进行，苏木素复染。设阴性对照，即第一步反应中不加TDT酶(脱氧核苷酸末端转移酶)。染色阳性判定标准按染色强度指数法(staining intensity index,SII)[5]进行，即计数500个细胞，按其阳性着色深度由阴性至强阳性分为0～3四级，A、B、C、D为相应级别的细胞数，SII=(A×0+B×1+C×2+D×3)÷100。结果取6张切片的平均值，SII<0.5为阴性(-)，0.5～1.0为弱阳性(+)，1.1～2.0为阳性(+ +)，>2.0为强阳性(+ + +)。
, 百拇医药
六、温度控制及测定
维持腹主动脉的血流，并用35℃生理盐水浸泡腹主动脉，以促进散热。应用多导电子测温仪，将热导探针置于腹主动脉外膜下，监测照光过程中的温度变化。
结 果
一、激光诱导的SMC凋亡的形态学特点
1.激光诱导的SMC凋亡与坏死的区别 光镜下观察，SMC在激光照射后有变性、凋亡和坏死等三种损伤性改变。变性在各激光剂量组均可见到，表现为SMC形态不规则，细胞质着色稍深，属于轻度损伤的表现；SMC凋亡见于功率密度100、200和300mW/cm2组；SMC坏死多见于功率密度200和300mW/cm2组，以300mW/cm2最重。凋亡细胞呈散在和灶状分布，细胞明显固缩，边界清楚，细胞质着色略加深，核膜完整，染色质固缩深染，着色均匀，并沿核膜着边排列。细胞坏死呈灶状分布，细胞边界不清楚，细胞质着色较深，核碎裂，染色质着色浅而不均匀，并呈点块状散落在细胞质中。
, 百拇医药
2.激光诱导的SMC凋亡的形态演变过程 在兔正常腹主动脉的横断切片上，SMC排列规则，细胞呈梭形，核呈梭形或椭圆形，细胞质和核着色均匀(图1)。用100mW/cm2照射1000s后4h，SMC排列和形态仍较正常；照射后8h，内层SMC排列紊乱，细胞出现固缩，形态不规则，着色加深(图2)；照射后12h，细胞进一步固缩呈圆形，着色也进一步加深；照射后24h，可见到较典型的凋亡细胞(图3)；照射后72h，已见不到凋亡细胞，SMC排列仍紊乱，但其形态和着色已接近正常，血管壁中有一些细胞稀少的区域。
图1 兔正常腹主动脉SMC HE×1000
Fig.1 Normal abdominal aorta SMC of rabbit from a control rabbit. HE×1000
, 百拇医药
图2 100J/cm2激光照射兔腹主动脉后8h，SMC形态不规则，核固缩，着色加深 HE×1000
Fig.2 8 hours after laser irradiation of 100 J/cm2 on the rabbit abdominal aorta. The shape of SMC is irregular and nuclei are condensed. HE×1000
图3 100J/cm2激光照射兔腹主动脉后24h，SMC固缩呈圆形，边界清楚，染色质固缩深染，沿核膜排列，部分细胞染色质碎裂 HE×1000
Fig.3 24 hours after laser irradiation of 100J/cm2 on the rabbit abdominal aorta.Apoptotic SMC show the margination of con-densed and fragmented chromatin.HE×1000
, 百拇医药
二、激光照射剂量与SMC凋亡的关系
50mW/cm2×1000s、100mW/cm2×500s、100mW/cm2×1000s、200mW/cm2×500s、200mW/cm2×1000s、300mW/cm2×500s和300mW/cm2×1000s7种不同激光剂量照射后24h取材的兔腹主动脉标本，TUNEL标记结果分别为-、+、+++、+++、++、++、++，显示功率密度在100mW/cm2及以上的激光照射均能诱导出SMC细胞凋亡，但以100mW/cm2×1000s和200mW/cm2×500s组(能量密度均为100J/cm2)的凋亡发生率最高。
三、激光照射对EC的作用
, http://www.100md.com
光镜下观察，本研究采用的各照射剂量对腹主动脉EC形态均无显著影响，即使在功率密度300mW/cm2组，SMC出现较多坏死，而EC形态无明显改变。经TUNEL标记，也未见到染色阳性的EC。
四、激光照射对组织温度的影响
照射开始后，组织温度随照射时间的延长而升高，但上升的速率逐渐降低，最终恒定于某一点上。各功率密度组的最高温度不同，分别为50mW/cm2组38.2℃、100mW/cm2组39.5℃、200mW/cm2组40.1℃、300mW/cm2组40.7℃。
讨 论
细胞凋亡是指细胞发生象树叶凋谢一样的形态变化。其典型特征是细胞首先变圆，随即与邻周细胞脱离，失去微绒毛，细胞质浓缩，核染色质密度增高呈半月形，并凝聚在核膜周边，核仁裂解，进而胞膜内陷将细胞分割为多个有膜包裹、内涵物不外溢的凋亡小体[6]。不同组织细胞的凋亡或不同因素诱导的细胞凋亡在形态上可以略有差别。在本研究中，由510.6nm激光照射所诱导出的SMC凋亡的形态特点与上述改变基本一致。这与以细胞肿胀、碎裂为特征的坏死性改变有着明显的区别。
, http://www.100md.com
本组光镜观察结果表明兔在体腹主动脉经激光照射后24h，SMC出现变性、凋亡和坏死等三种损伤性改变，这三种改变的程度和比例分布在不同激光剂量组间差别很大，并随照光后时间的推移而变化；在照射后72h，凋亡和坏死的细胞已被清除，镜下仅见到正在恢复中的形态轻度异常的SMC。表明经激光照射后SMC可发生三种转归，损伤程度轻的细胞可通过修复机制逐渐恢复正常；损伤程度重的细胞可发生坏死；损伤程度介于二者之间的细胞才能发生凋亡。而激光照射剂量(似乎主要是功率密度)决定了SMC的损伤程度，进而决定着SMC受损后的结局。目前认为，细胞凋亡是一个由基因调控、主动耗能的过程，需要合成新的蛋白质，激活核酸内切酶，需要细胞骨架收缩来完成胞膜内陷和细胞分割。激光作为一种物理性损伤因素，如以适当的波长和光剂量进行照射，有可能对DNA等敏感的细胞结构产生较特异的损伤，从而诱导细胞发生凋亡；如照射剂量过高，细胞蛋白质、酶、骨架和脂质等也将受到损伤，使与凋亡相关机制的功能被抑制，致使细胞只能以坏死的形式完成死亡。
虽然通过坏死和凋亡都能使SMC数量减少，但在体情况下，坏死和凋亡对PTA术后新生血管内膜增厚的作用结果却大不相同。细胞坏死导致细胞膜和溶酶体破裂，细胞内容物释放，在局部产生炎症反应，刺激邻近部位的SMC迁移至新生内膜中并持续增殖，使内膜增厚。而细胞凋亡是通过细胞膜内陷和细胞分割形成凋亡小体，最终被巨噬细胞吞噬，没有细胞内容物的释放，不产生炎症反应和随之发生的血管内膜过度增生，故可望用于防止PTA术后血管再狭窄的发生。本研究结果显示，100mW/cm2照射1000s和200mW/cm2照射500s(能量密度均为100J/cm2)组，TUNEL标记的“SII>2.0，均呈强阳性(+ + +)”，由SII的计算方法可推论，其细胞凋亡率至少在13%以上。因此，就细胞凋亡诱导率而言，510.6nm激光有可能通过诱导一定数量的SMC凋亡而有效地减少新生血管内膜的厚度，进而达到防止PTA术后再狭窄的目的。此外，实验中还观察到，510.6nm激光在SMC与EC间具有很好的选择性作用。这可能与SMC内含有丰富的肌红蛋白而对绿光更为敏感有关。EC结构的完整和功能的正常，对维持在体SMC的静止状态起着非常重要的作用。因而，510.6nm激光的这一作用特点可能对研究防治再狭窄的方法具有一定的意义。本组研究对象为正常兔腹主动脉SMC，其结果是否能反映人动脉粥样硬化斑块中的SMC，尚有待于深入研究。
, 百拇医药
本课题受国家自然科学基金资助(批准号69878034)
参考文献
1 郑德先. 淋巴细胞的程序化死亡. 基础医学与临床，1994，14:170-173 .
2 Piallat MB, Gabbiani F, Redard M, et al. Apoptosis participates in cellularity regulation during rat aortic intimal thickening. Am J Pathol, 1995, 146:1059-1064.
3 刘凡光，顾瑛，李峻亨，等. 510 nm激光诱导血管平滑肌细胞凋亡的初步研究. 中国激光医学杂志, 1996, 5:137-139.
4 Kressel M, Groscurth P. Distinction of apoptosis and necrotic cell death by in situ labeling of fragmented DNA. Cell Tissue Res, 1994, 278:549 -556.
, 百拇医药
5 McClelland RA, Berger U, Miller LS, et al. Immunocytochemical as say for estrogen receptor: relationship to outcome of therapy in patients with a dvanced breast cancer. Cancer Res, 1986, 46:4241s-4243s.
6 Bursch W, Oberhammer F, Schulte-Hermann R. Cell death by apoptosis and its protective role against disease. Trends Pharmacol Sci, 1992, 13:245 -251.
(收稿日期：1999-04-30), http://www.100md.com
单位：解放军总医院激光科(北京市，100853)
关键词：激光；细胞凋亡；血管平滑肌细胞
中国激光医学杂志990303摘要
目的 观察510.6nm波长激光对兔在体血管平滑肌细胞(SMC)凋亡的诱导作用。
方法 日本大耳白兔36只，由股动脉导入柱状光纤至腹主动脉，对腹主动脉血管壁进行分段激光照射，功率密度分别为50、100、200或300mW/cm2，照射500或1000s。于照射后4、8、12、24或72h处死动物，取照射段腹主动脉，光镜观察SMC形态改变，DNA末端标记法确定细胞凋亡率。
结果 兔腹主动脉经100mW/cm2及以上功率密度的激光照射后24h，SMC可出现变性、凋亡和坏死三种损伤性改变，而血管内皮细胞无明显变化。激光诱导下SMC呈现典型的细胞凋亡形态特征：细胞明显固缩，细胞质着色加深，染色质固缩深染，并沿核膜着边排列。DNA末端标记显示，SMC凋亡与激光照射剂量有关。在100mW/cm2照射1000s和200mW/cm2照射500s组(能量密度均为100J/cm2)，细胞凋亡的发生率最高。
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结论 510.6nm激光以能量密度100J/cm2照射，能使兔在体腹主动脉SMC发生细胞凋亡，且发生率较高。
Apoptosis of Vascular Smooth Muscle Cells in Vivo Induced by
510.6 nm Laser Irradiation
GU Ying, LIU Fanguang, JIANG Yiping, LIANG Jie, LI Junheng, ZHU Jianguo
Department of Laser Medicine, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853
ABSTRACT
, 百拇医药
Objective To investigate the effect of 510.6 nm laser irradiation on apoptosis of vascular smooth muscle cells(SMC).
Methods Rabbit normal abdominal aorta was irradiated by 510.6 nm laser with the power densities of 50, 100, 200 or 300 mW/cm2 and the energy dens ities of 50, 100, 150, 200 or 300 J/cm2. The apoptosis of SMC was identified by morphologic observation and specific labeling of nuclear DNA fragment (TU NEL) technique.
, 百拇医药
Results A typical appearance of apoptosis was found in the groups of the power densities of 100, 200 and 300 mW/cm2 at 24 hours after irradiati on. Apoptotic SMC showed that the cells and nuclei were condensed, and the fragm ented chromatin was arranged against the nuclear membrane. The TUNEL results ind icated that the incidence rate of apoptosis in the group of the energy density o f 100 J/cm2 was higher than that of other groups.
Conclusions 510.6 nm laser irradiation with the energy density of 100 J/cm2 may initiate apoptosis of SMC in vivo.
, 百拇医药
Keyword Lasers; Apoptosis; Vascularsmoothmusclecells
细胞凋亡是细胞组织、器官、系统发育成熟过程中的一种常见的生理现象，无功能或老化的细胞通过此种机制被淘汰，以维持组织器官的正常形态和功能[1]。血管平滑肌细胞(SMC)凋亡亦有同样的意义。在生理情况下，SMC凋亡可见于新生儿动脉导管的闭锁、萎缩；在非生理情况下，见于经皮腔内血管成形术(PTA)后血管的损伤修复。在PTA术后血管修复过程中，SMC增殖和凋亡之间的平衡决定着新生血管内膜的增厚程度，提高SMC凋亡率将有助于防止血管再狭窄的发生[2]。在以往的研究中，作者用510.6nm激光照射体外培养的兔SMC，成功地诱导出细胞凋亡[3]。本研究意在探索用510.6nm激光诱导兔在体SMC的凋亡。
材料和方法
一、激光设备
, http://www.100md.com
IECu-10型铜蒸气激光器(中国科学院电子研究所提供)，脉冲输出，脉宽20～40ns，输出波长510.6nm和578.2nm，经滤光后输出单一510.6nm波长；经400μm柱状光导纤维输出，光纤出光端长2.0cm。CLP-1型柱状激光功率计(军事医学科学院二所生产，中国计量科学研究院标定)监测输出功率。
二、实验动物及处理
日本大耳白兔36只(解放军总医院动物实验中心提供)，雄性，体重2.5～3.0kg。静脉注射复方氯胺酮麻醉。开腹暴露腹主动脉，以旁侧缝线作为标志将其划分为近心段、中间段、远心段，每段长20mm。然后分离出左侧股动脉，肝素化抗凝，由股动脉导入光纤至腹主动脉，分别对各段血管进行照射，照射后结扎股动脉，缝合切口。分别于照射后4、8、12、24和72h处死动物，按标志分段取出腹主动脉。
三、实验分组
, 百拇医药 实验动物按取材时间分成5组。24h组8只，每只兔的三段血管分别接受3种不同剂量的激光照射处理(含不照光对照)，使每一照射剂量组和对照组标本均来源于3只兔的近心段、中间段、远心段共三段血管(表1)；其余4组各7只，除不含无照光对照外，其他处理同24h组。
四、标本制备和形态学观察
每段血管两端各切除5mm(留取10mm)，4%甲醛固定，常规脱水、石蜡包埋、切片、HE染色。用OlympusBX50生物显微镜观察各段血管SMC和血
管内皮细胞(EC)的形态变化。
表1 激光照射后24h取材组8只兔激光照射方法
Tab.1 Grouping of laser irradiatio n and sampling at 24 hours later 兔编号
, 百拇医药
RabbitNo.
血管段
Aorta segment
近心段
Proximal
中段
Middle
远心段
Distal
1
A
B
C
, 百拇医药
2
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注：A.50 mW/cm2×1000s，50 J/cm2；B.100 mW/cm2×500 s，50 J/cm 2；C.100 mW/cm2×1000s，100 J/cm2；D.200 mW/cm2×500s，100 J/cm2；E .200 mW/cm2×1000s，200 J/cm2；F.300 mW/cm2×500s，150 J/cm2；G.300 mW/cm2×1000 s，300 J/cm2；H.不照光 no laser irradiation
五、细胞凋亡率的检测方法
采用DNA末端标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)检测细胞凋亡率[4]。TUNEL试剂盒为德国保灵曼公司产品。标本的取材时间为术后24h，每份标本染2张切片，每组6张切片。操作按说明书进行，苏木素复染。设阴性对照，即第一步反应中不加TDT酶(脱氧核苷酸末端转移酶)。染色阳性判定标准按染色强度指数法(staining intensity index,SII)[5]进行，即计数500个细胞，按其阳性着色深度由阴性至强阳性分为0～3四级，A、B、C、D为相应级别的细胞数，SII=(A×0+B×1+C×2+D×3)÷100。结果取6张切片的平均值，SII<0.5为阴性(-)，0.5～1.0为弱阳性(+)，1.1～2.0为阳性(+ +)，>2.0为强阳性(+ + +)。
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六、温度控制及测定
维持腹主动脉的血流，并用35℃生理盐水浸泡腹主动脉，以促进散热。应用多导电子测温仪，将热导探针置于腹主动脉外膜下，监测照光过程中的温度变化。
结 果
一、激光诱导的SMC凋亡的形态学特点
1.激光诱导的SMC凋亡与坏死的区别 光镜下观察，SMC在激光照射后有变性、凋亡和坏死等三种损伤性改变。变性在各激光剂量组均可见到，表现为SMC形态不规则，细胞质着色稍深，属于轻度损伤的表现；SMC凋亡见于功率密度100、200和300mW/cm2组；SMC坏死多见于功率密度200和300mW/cm2组，以300mW/cm2最重。凋亡细胞呈散在和灶状分布，细胞明显固缩，边界清楚，细胞质着色略加深，核膜完整，染色质固缩深染，着色均匀，并沿核膜着边排列。细胞坏死呈灶状分布，细胞边界不清楚，细胞质着色较深，核碎裂，染色质着色浅而不均匀，并呈点块状散落在细胞质中。
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2.激光诱导的SMC凋亡的形态演变过程 在兔正常腹主动脉的横断切片上，SMC排列规则，细胞呈梭形，核呈梭形或椭圆形，细胞质和核着色均匀(图1)。用100mW/cm2照射1000s后4h，SMC排列和形态仍较正常；照射后8h，内层SMC排列紊乱，细胞出现固缩，形态不规则，着色加深(图2)；照射后12h，细胞进一步固缩呈圆形，着色也进一步加深；照射后24h，可见到较典型的凋亡细胞(图3)；照射后72h，已见不到凋亡细胞，SMC排列仍紊乱，但其形态和着色已接近正常，血管壁中有一些细胞稀少的区域。
图1 兔正常腹主动脉SMC HE×1000
Fig.1 Normal abdominal aorta SMC of rabbit from a control rabbit. HE×1000
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图2 100J/cm2激光照射兔腹主动脉后8h，SMC形态不规则，核固缩，着色加深 HE×1000
Fig.2 8 hours after laser irradiation of 100 J/cm2 on the rabbit abdominal aorta. The shape of SMC is irregular and nuclei are condensed. HE×1000
图3 100J/cm2激光照射兔腹主动脉后24h，SMC固缩呈圆形，边界清楚，染色质固缩深染，沿核膜排列，部分细胞染色质碎裂 HE×1000Fig.3 24 hours after laser irradiation of 100J/cm2 on the rabbit abdominal aorta.Apoptotic SMC show the margination of con-densed and fragmented chromatin.HE×1000
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二、激光照射剂量与SMC凋亡的关系
50mW/cm2×1000s、100mW/cm2×500s、100mW/cm2×1000s、200mW/cm2×500s、200mW/cm2×1000s、300mW/cm2×500s和300mW/cm2×1000s7种不同激光剂量照射后24h取材的兔腹主动脉标本，TUNEL标记结果分别为-、+、+++、+++、++、++、++，显示功率密度在100mW/cm2及以上的激光照射均能诱导出SMC细胞凋亡，但以100mW/cm2×1000s和200mW/cm2×500s组(能量密度均为100J/cm2)的凋亡发生率最高。
三、激光照射对EC的作用
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光镜下观察，本研究采用的各照射剂量对腹主动脉EC形态均无显著影响，即使在功率密度300mW/cm2组，SMC出现较多坏死，而EC形态无明显改变。经TUNEL标记，也未见到染色阳性的EC。
四、激光照射对组织温度的影响
照射开始后，组织温度随照射时间的延长而升高，但上升的速率逐渐降低，最终恒定于某一点上。各功率密度组的最高温度不同，分别为50mW/cm2组38.2℃、100mW/cm2组39.5℃、200mW/cm2组40.1℃、300mW/cm2组40.7℃。
讨 论
细胞凋亡是指细胞发生象树叶凋谢一样的形态变化。其典型特征是细胞首先变圆，随即与邻周细胞脱离，失去微绒毛，细胞质浓缩，核染色质密度增高呈半月形，并凝聚在核膜周边，核仁裂解，进而胞膜内陷将细胞分割为多个有膜包裹、内涵物不外溢的凋亡小体[6]。不同组织细胞的凋亡或不同因素诱导的细胞凋亡在形态上可以略有差别。在本研究中，由510.6nm激光照射所诱导出的SMC凋亡的形态特点与上述改变基本一致。这与以细胞肿胀、碎裂为特征的坏死性改变有着明显的区别。
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本组光镜观察结果表明兔在体腹主动脉经激光照射后24h，SMC出现变性、凋亡和坏死等三种损伤性改变，这三种改变的程度和比例分布在不同激光剂量组间差别很大，并随照光后时间的推移而变化；在照射后72h，凋亡和坏死的细胞已被清除，镜下仅见到正在恢复中的形态轻度异常的SMC。表明经激光照射后SMC可发生三种转归，损伤程度轻的细胞可通过修复机制逐渐恢复正常；损伤程度重的细胞可发生坏死；损伤程度介于二者之间的细胞才能发生凋亡。而激光照射剂量(似乎主要是功率密度)决定了SMC的损伤程度，进而决定着SMC受损后的结局。目前认为，细胞凋亡是一个由基因调控、主动耗能的过程，需要合成新的蛋白质，激活核酸内切酶，需要细胞骨架收缩来完成胞膜内陷和细胞分割。激光作为一种物理性损伤因素，如以适当的波长和光剂量进行照射，有可能对DNA等敏感的细胞结构产生较特异的损伤，从而诱导细胞发生凋亡；如照射剂量过高，细胞蛋白质、酶、骨架和脂质等也将受到损伤，使与凋亡相关机制的功能被抑制，致使细胞只能以坏死的形式完成死亡。
虽然通过坏死和凋亡都能使SMC数量减少，但在体情况下，坏死和凋亡对PTA术后新生血管内膜增厚的作用结果却大不相同。细胞坏死导致细胞膜和溶酶体破裂，细胞内容物释放，在局部产生炎症反应，刺激邻近部位的SMC迁移至新生内膜中并持续增殖，使内膜增厚。而细胞凋亡是通过细胞膜内陷和细胞分割形成凋亡小体，最终被巨噬细胞吞噬，没有细胞内容物的释放，不产生炎症反应和随之发生的血管内膜过度增生，故可望用于防止PTA术后血管再狭窄的发生。本研究结果显示，100mW/cm2照射1000s和200mW/cm2照射500s(能量密度均为100J/cm2)组，TUNEL标记的“SII>2.0，均呈强阳性(+ + +)”，由SII的计算方法可推论，其细胞凋亡率至少在13%以上。因此，就细胞凋亡诱导率而言，510.6nm激光有可能通过诱导一定数量的SMC凋亡而有效地减少新生血管内膜的厚度，进而达到防止PTA术后再狭窄的目的。此外，实验中还观察到，510.6nm激光在SMC与EC间具有很好的选择性作用。这可能与SMC内含有丰富的肌红蛋白而对绿光更为敏感有关。EC结构的完整和功能的正常，对维持在体SMC的静止状态起着非常重要的作用。因而，510.6nm激光的这一作用特点可能对研究防治再狭窄的方法具有一定的意义。本组研究对象为正常兔腹主动脉SMC，其结果是否能反映人动脉粥样硬化斑块中的SMC，尚有待于深入研究。
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本课题受国家自然科学基金资助(批准号69878034)
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(收稿日期：1999-04-30), http://www.100md.com