转化生长因子β1基因修饰的小鼠树突状细胞在移植体内的迁移与生存
作者：钟翠平 李威震 吕丽娜 钱诗光 Angus W. Thomson
单位：200032 上海医科大学组织胚胎学教研室(钟翠平)；中国台湾长庚纪念医院(李威震)；美国匹兹保大学Starzl移植研究所(吕丽娜、钱诗光、Angus W. Thomson)
关键词：树突状细胞；转化生长因子β；基因转移
中华医学杂志990304 【摘要】 目的 观察β型转化生长因子(TGFβ1)基因修饰的B10小鼠骨髓树突状细胞(DC)在C3H小鼠体内的迁移和存活，以探讨DC生物学特性与移植耐受性的关系。方法 从B10小鼠骨髓分离DC前体细胞，在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子+β型转化生长因子(GM-CSF+TGFβ)条件下培养增殖(DC1)，并转导Ad-LacZ(DC2)或Ad-TGFβ1(DC3)。每组5×105个细胞注入C3H小鼠后掌皮下，分别于第1、2、7及14天取淋巴器官，以免疫组织化学方法检测I-Ab阳性细胞的分布及数量。结果 各组DC在C3H小鼠体内的迁移及分布均相似，即I-Ab阳性细胞首先出现在窝淋巴结被膜下，继而迁入脾的T细胞依赖区和边缘区，第7天脾内阳性细胞数达顶峰。与DC1组相比，DC2在脾内的阳性细胞数减少，DC3阳性细胞数在各时间点都为最高。结论 DC经转导Ad-LacZ，可增加其免疫活性，使宿主加速排斥反应；而转导Ad-TGFβ1可使TGFβDC表达TGFβ1，维持DC于功能不成熟状态，从而提高宿主的耐受性。
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In vivo migration and survival of donor-derived dendritic cell progenitors genetically modified using an adenoviral vector encoding cDNA for TGFβ1 * ZHONG Cuiping, LI Wei Zhen, Lü Lina, et al. * Department of Histology and Embryology Shanghai Medical University 200032
【Abstract】 Objective To investigate the migration and survival of B10 mouse bone marrow (BM)-derived DCs in C3H mice and if genetic modification of these DCs to overexpress TGFβ1 may potentiate their tolerogenicity. Method B10 mouse BM-derived DCs were propagated in GM-CSF and TGFβ (DC1), transduced DC1 with replication-deficient Ad vectors encoding genes for LacZ (DC2) or TGFβ1 (DC3). Cells of different groups were injected into one footpad of C3H mice. The mice were sacrificed on days 1, 2, 7, and 14, and spleens, thymuses, popliteal and mesenteric lymph nodes removed and stained with anti-IAb mAb. The incidences of B10 DC were determined by the mean number of IAb positive cells with dendriform morphology per low power field (×100). Results Transduction with Ad-LacZ or Ad-TGFβ1 did not affect DC migration or distribution in C3H recipients, i. e. IAb+ cells were first observed under the capsule of popliteal LN (peak at d1), then migrated into the marginal T dependent area of spleens (peak at d7), and were found occasionally in the thymus. Transduction of Ad-LacZ reduced the numbers of IAb+ cells identified in both LN and spleens at all time points post injection, compared with injection of unmodified control DC, suggesting that Ad transduction itself can affect DC life span in allogeneic recipients. Overexpression of TGFβ1 by transduction of Ad-TGFβ1 not only fully reversed the reduction of DC numbers induced by Ad transduction, but also prolonged the life span of DC in spleen, as shown by the 2-fold increase in number of IAb+cells in spleen at d14 compared with control DCs. Conclusion Mouse BM-derived TGFβ DCs can be transduced to express TGFβ1 using an adenoviral vector, and exhibit the same migration characteristics as unmodified DC. The survival of TGFβ gene transduced DCs appears to be enhanced compared with unmodified or LacZ gene-transduced DCs.
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【Key words】 Dendritic cell Transforming growth factor beta Gene transfer
(Natl Med J China, 1999, 79:174-177)
在器官移植中，异体移植物发生的免疫应答反应是十分复杂的，致敏和识别过程包括直接抗原呈递途径和间接抗原呈递途径，其反应过程中起关键性作用的细胞就是抗原递呈细胞(antigen presenting cell, APC)[1]。APC包括组织的巨噬细胞、树突状细胞、B细胞及一些内皮细胞，其中树突状细胞(dendritic cell, DC )更以其强大的专职性抗原呈递能力而备受注目。然而，有文献报道[2]，从小鼠骨髓分离、在体外经粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子+β型转化生长因子(GM-CSF+TGFβ)培养、扩增的DC前体细胞在体外不能激发异体T细胞的混合淋巴细胞反应(MLR)，而且，在同种心脏移植手术前，将此种DC注入受者体内，能显著延长小鼠移植心脏的存活时间。显然，此类DC进入宿主小鼠体内后，改变了供者与受者之间的免疫反应过程，使机体的免疫反应与耐受性之间达到了新的平衡，在宿主体内形成了一个较高的“微嵌合性”(microchimerism)水平[3]。
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最近报道[4]，在成功地进行了器官移植、存活长达30年的患者淋巴器官内，发现还有供者表型特征的DC存在。这个现象提示：(1)器官移植后，供者DC向宿主淋巴器官(及一些非淋巴器官)进行了迁移；(2)供受双方免疫细胞经调整达到和平共处，即微嵌合状态，从而形成机体免疫耐受性。我们采用从B10小鼠骨髓分离的DC前体，经粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子+β型转化生长因子(GM-CSF+TGFβ)培养、扩增(称为TGFβDC)，并经体外转导TGFβ1基因，注入C3H小鼠体内，以观察DC生物特性的改变对宿主微嵌合水平的影响，并探讨其与移植耐受性的关系。
材料与方法
一、材料
1. 动物：C57BL/10J(B10)及C3H/HeJ(C3H)纯种小鼠，10～12周龄(Jackson Lab提供)。
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2. 试剂：重组小鼠GM-CSF(Schering-Pliugh产品)；重组人TGFβ1(Rand D systems，minneapolis，MN产品)；LacZ及猪TGFβ1重组腺病毒载体(Microbix Biosystems Inc产品)；ABC Kit(Vector Lab产品)；Vector blocking kit(Vector Lab产品)；生物素标记I-Ab单抗(Pharmingen Co.产品)。
二、方法
1. 骨髓DC前体细胞的分离及扩增：取B10小鼠后肢骨，以Hanks液冲洗出骨髓液,蒸馏水溶解红细胞后，分离出单个核细胞，以RPMI-1640培养液内加GM-CSF(500 μ/ml)及TGFβ(0.2 ng/ml)于24孔培养板置37 ℃、5% CO2中培养扩增。隔天更换培液，并丢弃部分粒细胞和巨噬细胞。于培养第8～10天收获DC(TGFβDC)，并检测其表型及免疫生物活性。
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2. DC的基因修饰：Lacz和猪TGFβ1重组腺病毒载体，转染293细胞，制备病毒。对数生长期的TGFβDC按10、20、50、100 MOI(multiplicity of infection)加入LacZ或TGFβ1重组腺病毒，培养24小时后，收集上清，用ELISA法测定TGFβ1水平，另收集细胞备用。
3. 动物模型制作及分组：C3H小鼠分3组，每组3～5只动物。取TGFβDC(DC1组)、转导Ad-LacZ的TGFβDC(DC2组)及转导Ad TGFβ1的TGFβDC(DC3组)3种细胞分别注射到C3H小鼠后脚掌皮下，每只小鼠注射5×105细胞。于注射后1、2、7和14天，取窝淋巴结、脾、胸腺制作2～3 μm厚冰冻切片。
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4. X-gal染色：为检测腺病毒载体转导DC及其转导后基因表达能力，培养DC细胞涂片及窝淋巴结冰冻切片以5%甲醛固定，PBS漂洗3次，以配制的X-gal工作液在37 ℃湿盒内孵育过夜，核增红复染后封片观察。
5. 免疫组织化学染色及I-Ab阳性细胞计数：冰冻切片干燥后，冷丙酮固定。以生物素标记的抗I-Ab单克隆抗体(1∶200)对各组切片进行常规ABC法免疫组织化学染色，DAB/H2O2显色，甲基绿复染。光镜下观察切片中阳性细胞的形态及分布特征，并在低倍(100×)视野计数器官不同水平切片整个脏器断面的视野数及平均每个视野的阳性细胞数。每个组织块计数10～15张切片，并以t检验进行统计学处理。
结 果
1.骨髓分离DC的体外扩增：由B10小鼠骨髓分离的DC前体在含GM-CSF+TGFβ因子的培养液中培养2天后镜下观察，大小不等的悬浮细胞中出现簇状细胞集落。集落逐渐增大，疏松附着于培养板。集落内大部分细胞边缘毛茸状为DC，也有少量粒细胞及巨噬细胞。第5天后，簇状细胞集落数量减少，悬浮细胞密度增加，体积增大。培养8～10天收获细胞。细胞甩片(cytospin) Giemsa染色显示，涂片约有90%以上为具有树枝状突起特征的DC。
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2.培养DC的免疫表型分析：培养8～10天收获的DC甩片MHCⅡ类抗原(I-Ab)免疫细胞化学染色显示，大部分细胞为弱或中等阳性。FACScan检测细胞表型，淋巴细胞系列标记为阴性，CD40、B7阴性。
3.TGFβ1检测：以ELISA法对收集的DC1、DC2及DC3组细胞培养上清TGFβ1进行免疫学检测，结果发现，DC1、DC2不分泌TGFβ1，DC3能表达TGFβ1，表达量为5 ng/106细胞/24小时。
4.X-gal染色：DC1及DC3细胞涂片X-gal染色均呈阴性。DC2即转导LacZ的TGFβDC，在10，20，50，100 MOI，转染率分别为40%～50%，60%～70%及85%以上。阳性细胞胞质呈鲜绿色，核红色。在50～100 MOI，部分细胞胞质呈深墨色(图1)，冰冻切片X-gal染色显示，DC2注射后数小时，即在窝淋巴结被膜下发现绿色X-gal阳性细胞(图2)。
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5.免疫组织化学染色及I-Ab阳性细胞计数：各组动物淋巴器官切片于注射后不同时间点I-Ab阳性细胞分布及计数结果显示，转导Ad-LacZ及转导TGFβ1基因对从B10小鼠来的DC在C3H小鼠体内的迁移方式和分布特点均无影响，即阳性细胞首先出现在窝淋巴结被膜下(高峰在第1天)，继而迁入脾的T细胞依赖区和边缘区(高峰在第7天)。胸腺皮髓质交界处也可见少量阳性细胞。与注射DC1相比，DC2组淋巴结和脾内的I-Ab阳性细胞数减少，DC3组在各时间点，脾内的阳性细胞数都大大高于其他两组(P<0.05)，第14天脾内I-Ab阳性细胞数是DC1组的2倍(图3～6)。
图1 DC2细胞用X-gal染色，显示80%以上细胞为阳性，胞质呈绿色，部分细胞胞质呈深墨绿色(×400)
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图2 DC2注射后6小时窝淋巴结冰冻切片，X-gal染色显示淋 巴结被膜下X-gal阳性DC(×400)
图3 DC1组7天脾脏冰冻切片，I-Ab染色(×200)
图4 DC2组7天脾脏冰冻切片，I-Ab染色(×200)
图5 DC3组7天脾脏冰冻切片，I-Ab染色(×200)
图6 不同时间点C3H小鼠脾内I-Ab阳性DC的变化
讨 论 讨 论
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有关移植免疫的研究提示，移植器官、组织本身没有或只有很弱的免疫原性，移植器官之所以受到受者机体排斥，是因为一些具有组织相容性Ⅱ类抗原的细胞群体主要为DC，随着器官移植到达受者体内，提供了排斥反应的最初免疫刺激[3]。多年来，为减少器官移植后的排斥反应，临床上必须长期大量使用一些非特异性免疫抑制剂，而这些非特异性制剂往往引起严重、有时是致命的副作用。
根据近年对DC免疫生物特性的研究，越来越多证据说明，DC与移植排斥和移植耐受有密切关系。为预防或减少排斥的发生，某些学者曾致力于移植前去除供体组织内的DC[4]或预先对移植物使用抗DC的特异性单克隆抗体[5]，取得一定效果。最近有文献报道，从B10小鼠骨髓分离、在体外经GM-CSF+TGFβ培养、扩增的DC前体细胞在体外不能激发异体T细胞的混合淋巴细胞反应(MLR)，而且，将此种DC注入C3H小鼠体内后，进行B10小鼠→C3H小鼠心脏移植手术，能显著延长移植心脏的存活时间[6]。显然，此类DC进入宿主小鼠体内后，改变了移植物与受者之间的免疫反应过程，在宿主体内形成了一个较高的“微嵌合性”(microchimerism)水平[7]，使受者对移植物产生了一定的耐受性。究其原因，可能是因为经不同细胞因子培育的DC，具有不同的免疫生物活性。
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以GM-CSF+IL-4(或TNF-α)培养DC前体细胞，经8～10天增殖、分化，可获得功能完全成熟的DC，其表型特征是MHC-Ⅱ及T细胞共刺激分子(如CD40，B7-1，B7-2等)均为强阳性，此种DC具有极强的刺激T细胞能力，如进入受者体内，会导致剧烈的移植排斥反应。
应用GM-CSF+TGFβ因子培养的DC，其细胞表面MHC-Ⅱ类抗原呈中度或弱阳性，T细胞共刺激分子B7-1(CD80)表达极弱，B7-2(CD86)表达阴性，提示该种DC处于功能未成熟状态。此种DC不能引起宿主T细胞的免疫反应，却可能成为导致耐受性的原因。但实验证明，此种耐受性并不是永久的[8]，推测原因可能是这种DC在体外虽处于未成熟状态，但进入受者体内后，经过与宿主T细胞及各种细胞因子的相互作用，会提高本身共刺激分子的水平。
本实验以TGFβ1基因转导TGFβDC，以期进一步探讨控制DC免疫生物习性表现的可能性。实验中观察到DC2组脾内I-Ab阳性细胞数，在各时间点均为最少,这可能是由于腺病毒的导入提高了DC的免疫活性，从而表现出较低的微嵌合水平；然而转导Ad-TGFβ1不仅能完全逆转因转导腺病毒引起的供者的DC的减少，而且，在各时间点(尤其是7～14天)，脾内I-Ab阳性细胞数都大大高于其它两组，即保持最高的微嵌合水平，提示由于TGFβ1的分泌，使进入宿主的DC能在较长时间内维持于未成熟状态，从而降低了对宿主T细胞的免疫刺激活性。
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参考文献 1 Austyn JM, Steinman RM. The passenger leukocyte-a fresh look Transplant Revs. 1988, 2:139-145.
2 Thomson AW, Lu L, Murase N, et al. Microchimerism, dendritic cell progenitors and transplantation tolerance. Stem Cells. 1995, 13:622-639.
3 Austyn JM. Dendritic cells in transplantation. In: Kamperdi JK, ed. Dendritic Cells in Fundamental and Clinical Immunology. Plenum Press: New York. 1993. 55-70.
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4 Lechler RI, Batchelor JR. Restoration of immunogenicity to passenger cell-depleted kidney allografts by the addition of donor strain dendritic cells. J Exp Med. 1982, 155:31-41.
5 Iwai H, Kuma SI, Inaba MM, et al. Acceptance of murine thyroid allografts by pretreatment of anti-Ia antibody or anti-dendritic cell antibody in vitro. Transplantation. 1989, 47:45-49.
6 Fu F, Li Y, Qian S, et al. Costimulatory molecule-deficient dendritic cell progenitors(MHC classⅡ+, CD80dim,CD86-) prolong cardiac allograft survival in non-immunosuppressed recipients Transplantation. 1996, 62:659-665.
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7 Starzl TE, Demetris AS, Murase N, et al. Cell migration, chimerism, and graft acceptance. Lancet. 1992, 339:1579-1582.
8 Lu Lian, Li W, Fu F, et al. Blockade of the CD40-CD40 ligand pathway potentiates the capacity of donor-derived dendritic cell progenitors to induce long-term cardiac allograft survival Transplantation 1997, 64:1808-1818.
(收稿：1998-07-22 修回：1998-10-12), 百拇医药
单位：200032 上海医科大学组织胚胎学教研室(钟翠平)；中国台湾长庚纪念医院(李威震)；美国匹兹保大学Starzl移植研究所(吕丽娜、钱诗光、Angus W. Thomson)
关键词：树突状细胞；转化生长因子β；基因转移
中华医学杂志990304 【摘要】 目的 观察β型转化生长因子(TGFβ1)基因修饰的B10小鼠骨髓树突状细胞(DC)在C3H小鼠体内的迁移和存活，以探讨DC生物学特性与移植耐受性的关系。方法 从B10小鼠骨髓分离DC前体细胞，在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子+β型转化生长因子(GM-CSF+TGFβ)条件下培养增殖(DC1)，并转导Ad-LacZ(DC2)或Ad-TGFβ1(DC3)。每组5×105个细胞注入C3H小鼠后掌皮下，分别于第1、2、7及14天取淋巴器官，以免疫组织化学方法检测I-Ab阳性细胞的分布及数量。结果 各组DC在C3H小鼠体内的迁移及分布均相似，即I-Ab阳性细胞首先出现在窝淋巴结被膜下，继而迁入脾的T细胞依赖区和边缘区，第7天脾内阳性细胞数达顶峰。与DC1组相比，DC2在脾内的阳性细胞数减少，DC3阳性细胞数在各时间点都为最高。结论 DC经转导Ad-LacZ，可增加其免疫活性，使宿主加速排斥反应；而转导Ad-TGFβ1可使TGFβDC表达TGFβ1，维持DC于功能不成熟状态，从而提高宿主的耐受性。
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In vivo migration and survival of donor-derived dendritic cell progenitors genetically modified using an adenoviral vector encoding cDNA for TGFβ1 * ZHONG Cuiping, LI Wei Zhen, Lü Lina, et al. * Department of Histology and Embryology Shanghai Medical University 200032
【Abstract】 Objective To investigate the migration and survival of B10 mouse bone marrow (BM)-derived DCs in C3H mice and if genetic modification of these DCs to overexpress TGFβ1 may potentiate their tolerogenicity. Method B10 mouse BM-derived DCs were propagated in GM-CSF and TGFβ (DC1), transduced DC1 with replication-deficient Ad vectors encoding genes for LacZ (DC2) or TGFβ1 (DC3). Cells of different groups were injected into one footpad of C3H mice. The mice were sacrificed on days 1, 2, 7, and 14, and spleens, thymuses, popliteal and mesenteric lymph nodes removed and stained with anti-IAb mAb. The incidences of B10 DC were determined by the mean number of IAb positive cells with dendriform morphology per low power field (×100). Results Transduction with Ad-LacZ or Ad-TGFβ1 did not affect DC migration or distribution in C3H recipients, i. e. IAb+ cells were first observed under the capsule of popliteal LN (peak at d1), then migrated into the marginal T dependent area of spleens (peak at d7), and were found occasionally in the thymus. Transduction of Ad-LacZ reduced the numbers of IAb+ cells identified in both LN and spleens at all time points post injection, compared with injection of unmodified control DC, suggesting that Ad transduction itself can affect DC life span in allogeneic recipients. Overexpression of TGFβ1 by transduction of Ad-TGFβ1 not only fully reversed the reduction of DC numbers induced by Ad transduction, but also prolonged the life span of DC in spleen, as shown by the 2-fold increase in number of IAb+cells in spleen at d14 compared with control DCs. Conclusion Mouse BM-derived TGFβ DCs can be transduced to express TGFβ1 using an adenoviral vector, and exhibit the same migration characteristics as unmodified DC. The survival of TGFβ gene transduced DCs appears to be enhanced compared with unmodified or LacZ gene-transduced DCs.
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【Key words】 Dendritic cell Transforming growth factor beta Gene transfer
(Natl Med J China, 1999, 79:174-177)
在器官移植中，异体移植物发生的免疫应答反应是十分复杂的，致敏和识别过程包括直接抗原呈递途径和间接抗原呈递途径，其反应过程中起关键性作用的细胞就是抗原递呈细胞(antigen presenting cell, APC)[1]。APC包括组织的巨噬细胞、树突状细胞、B细胞及一些内皮细胞，其中树突状细胞(dendritic cell, DC )更以其强大的专职性抗原呈递能力而备受注目。然而，有文献报道[2]，从小鼠骨髓分离、在体外经粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子+β型转化生长因子(GM-CSF+TGFβ)培养、扩增的DC前体细胞在体外不能激发异体T细胞的混合淋巴细胞反应(MLR)，而且，在同种心脏移植手术前，将此种DC注入受者体内，能显著延长小鼠移植心脏的存活时间。显然，此类DC进入宿主小鼠体内后，改变了供者与受者之间的免疫反应过程，使机体的免疫反应与耐受性之间达到了新的平衡，在宿主体内形成了一个较高的“微嵌合性”(microchimerism)水平[3]。
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最近报道[4]，在成功地进行了器官移植、存活长达30年的患者淋巴器官内，发现还有供者表型特征的DC存在。这个现象提示：(1)器官移植后，供者DC向宿主淋巴器官(及一些非淋巴器官)进行了迁移；(2)供受双方免疫细胞经调整达到和平共处，即微嵌合状态，从而形成机体免疫耐受性。我们采用从B10小鼠骨髓分离的DC前体，经粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子+β型转化生长因子(GM-CSF+TGFβ)培养、扩增(称为TGFβDC)，并经体外转导TGFβ1基因，注入C3H小鼠体内，以观察DC生物特性的改变对宿主微嵌合水平的影响，并探讨其与移植耐受性的关系。
材料与方法
一、材料
1. 动物：C57BL/10J(B10)及C3H/HeJ(C3H)纯种小鼠，10～12周龄(Jackson Lab提供)。
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2. 试剂：重组小鼠GM-CSF(Schering-Pliugh产品)；重组人TGFβ1(Rand D systems，minneapolis，MN产品)；LacZ及猪TGFβ1重组腺病毒载体(Microbix Biosystems Inc产品)；ABC Kit(Vector Lab产品)；Vector blocking kit(Vector Lab产品)；生物素标记I-Ab单抗(Pharmingen Co.产品)。
二、方法
1. 骨髓DC前体细胞的分离及扩增：取B10小鼠后肢骨，以Hanks液冲洗出骨髓液,蒸馏水溶解红细胞后，分离出单个核细胞，以RPMI-1640培养液内加GM-CSF(500 μ/ml)及TGFβ(0.2 ng/ml)于24孔培养板置37 ℃、5% CO2中培养扩增。隔天更换培液，并丢弃部分粒细胞和巨噬细胞。于培养第8～10天收获DC(TGFβDC)，并检测其表型及免疫生物活性。
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2. DC的基因修饰：Lacz和猪TGFβ1重组腺病毒载体，转染293细胞，制备病毒。对数生长期的TGFβDC按10、20、50、100 MOI(multiplicity of infection)加入LacZ或TGFβ1重组腺病毒，培养24小时后，收集上清，用ELISA法测定TGFβ1水平，另收集细胞备用。
3. 动物模型制作及分组：C3H小鼠分3组，每组3～5只动物。取TGFβDC(DC1组)、转导Ad-LacZ的TGFβDC(DC2组)及转导Ad TGFβ1的TGFβDC(DC3组)3种细胞分别注射到C3H小鼠后脚掌皮下，每只小鼠注射5×105细胞。于注射后1、2、7和14天，取窝淋巴结、脾、胸腺制作2～3 μm厚冰冻切片。
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4. X-gal染色：为检测腺病毒载体转导DC及其转导后基因表达能力，培养DC细胞涂片及窝淋巴结冰冻切片以5%甲醛固定，PBS漂洗3次，以配制的X-gal工作液在37 ℃湿盒内孵育过夜，核增红复染后封片观察。
5. 免疫组织化学染色及I-Ab阳性细胞计数：冰冻切片干燥后，冷丙酮固定。以生物素标记的抗I-Ab单克隆抗体(1∶200)对各组切片进行常规ABC法免疫组织化学染色，DAB/H2O2显色，甲基绿复染。光镜下观察切片中阳性细胞的形态及分布特征，并在低倍(100×)视野计数器官不同水平切片整个脏器断面的视野数及平均每个视野的阳性细胞数。每个组织块计数10～15张切片，并以t检验进行统计学处理。
结 果
1.骨髓分离DC的体外扩增：由B10小鼠骨髓分离的DC前体在含GM-CSF+TGFβ因子的培养液中培养2天后镜下观察，大小不等的悬浮细胞中出现簇状细胞集落。集落逐渐增大，疏松附着于培养板。集落内大部分细胞边缘毛茸状为DC，也有少量粒细胞及巨噬细胞。第5天后，簇状细胞集落数量减少，悬浮细胞密度增加，体积增大。培养8～10天收获细胞。细胞甩片(cytospin) Giemsa染色显示，涂片约有90%以上为具有树枝状突起特征的DC。
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2.培养DC的免疫表型分析：培养8～10天收获的DC甩片MHCⅡ类抗原(I-Ab)免疫细胞化学染色显示，大部分细胞为弱或中等阳性。FACScan检测细胞表型，淋巴细胞系列标记为阴性，CD40、B7阴性。
3.TGFβ1检测：以ELISA法对收集的DC1、DC2及DC3组细胞培养上清TGFβ1进行免疫学检测，结果发现，DC1、DC2不分泌TGFβ1，DC3能表达TGFβ1，表达量为5 ng/106细胞/24小时。
4.X-gal染色：DC1及DC3细胞涂片X-gal染色均呈阴性。DC2即转导LacZ的TGFβDC，在10，20，50，100 MOI，转染率分别为40%～50%，60%～70%及85%以上。阳性细胞胞质呈鲜绿色，核红色。在50～100 MOI，部分细胞胞质呈深墨色(图1)，冰冻切片X-gal染色显示，DC2注射后数小时，即在窝淋巴结被膜下发现绿色X-gal阳性细胞(图2)。
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5.免疫组织化学染色及I-Ab阳性细胞计数：各组动物淋巴器官切片于注射后不同时间点I-Ab阳性细胞分布及计数结果显示，转导Ad-LacZ及转导TGFβ1基因对从B10小鼠来的DC在C3H小鼠体内的迁移方式和分布特点均无影响，即阳性细胞首先出现在窝淋巴结被膜下(高峰在第1天)，继而迁入脾的T细胞依赖区和边缘区(高峰在第7天)。胸腺皮髓质交界处也可见少量阳性细胞。与注射DC1相比，DC2组淋巴结和脾内的I-Ab阳性细胞数减少，DC3组在各时间点，脾内的阳性细胞数都大大高于其他两组(P<0.05)，第14天脾内I-Ab阳性细胞数是DC1组的2倍(图3～6)。
图1 DC2细胞用X-gal染色，显示80%以上细胞为阳性，胞质呈绿色，部分细胞胞质呈深墨绿色(×400)
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图2 DC2注射后6小时窝淋巴结冰冻切片，X-gal染色显示淋 巴结被膜下X-gal阳性DC(×400)
图3 DC1组7天脾脏冰冻切片，I-Ab染色(×200)
图4 DC2组7天脾脏冰冻切片，I-Ab染色(×200)
图5 DC3组7天脾脏冰冻切片，I-Ab染色(×200)
图6 不同时间点C3H小鼠脾内I-Ab阳性DC的变化
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有关移植免疫的研究提示，移植器官、组织本身没有或只有很弱的免疫原性，移植器官之所以受到受者机体排斥，是因为一些具有组织相容性Ⅱ类抗原的细胞群体主要为DC，随着器官移植到达受者体内，提供了排斥反应的最初免疫刺激[3]。多年来，为减少器官移植后的排斥反应，临床上必须长期大量使用一些非特异性免疫抑制剂，而这些非特异性制剂往往引起严重、有时是致命的副作用。
根据近年对DC免疫生物特性的研究，越来越多证据说明，DC与移植排斥和移植耐受有密切关系。为预防或减少排斥的发生，某些学者曾致力于移植前去除供体组织内的DC[4]或预先对移植物使用抗DC的特异性单克隆抗体[5]，取得一定效果。最近有文献报道，从B10小鼠骨髓分离、在体外经GM-CSF+TGFβ培养、扩增的DC前体细胞在体外不能激发异体T细胞的混合淋巴细胞反应(MLR)，而且，将此种DC注入C3H小鼠体内后，进行B10小鼠→C3H小鼠心脏移植手术，能显著延长移植心脏的存活时间[6]。显然，此类DC进入宿主小鼠体内后，改变了移植物与受者之间的免疫反应过程，在宿主体内形成了一个较高的“微嵌合性”(microchimerism)水平[7]，使受者对移植物产生了一定的耐受性。究其原因，可能是因为经不同细胞因子培育的DC，具有不同的免疫生物活性。
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以GM-CSF+IL-4(或TNF-α)培养DC前体细胞，经8～10天增殖、分化，可获得功能完全成熟的DC，其表型特征是MHC-Ⅱ及T细胞共刺激分子(如CD40，B7-1，B7-2等)均为强阳性，此种DC具有极强的刺激T细胞能力，如进入受者体内，会导致剧烈的移植排斥反应。
应用GM-CSF+TGFβ因子培养的DC，其细胞表面MHC-Ⅱ类抗原呈中度或弱阳性，T细胞共刺激分子B7-1(CD80)表达极弱，B7-2(CD86)表达阴性，提示该种DC处于功能未成熟状态。此种DC不能引起宿主T细胞的免疫反应，却可能成为导致耐受性的原因。但实验证明，此种耐受性并不是永久的[8]，推测原因可能是这种DC在体外虽处于未成熟状态，但进入受者体内后，经过与宿主T细胞及各种细胞因子的相互作用，会提高本身共刺激分子的水平。
本实验以TGFβ1基因转导TGFβDC，以期进一步探讨控制DC免疫生物习性表现的可能性。实验中观察到DC2组脾内I-Ab阳性细胞数，在各时间点均为最少,这可能是由于腺病毒的导入提高了DC的免疫活性，从而表现出较低的微嵌合水平；然而转导Ad-TGFβ1不仅能完全逆转因转导腺病毒引起的供者的DC的减少，而且，在各时间点(尤其是7～14天)，脾内I-Ab阳性细胞数都大大高于其它两组，即保持最高的微嵌合水平，提示由于TGFβ1的分泌，使进入宿主的DC能在较长时间内维持于未成熟状态，从而降低了对宿主T细胞的免疫刺激活性。
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参考文献 1 Austyn JM, Steinman RM. The passenger leukocyte-a fresh look Transplant Revs. 1988, 2:139-145.
2 Thomson AW, Lu L, Murase N, et al. Microchimerism, dendritic cell progenitors and transplantation tolerance. Stem Cells. 1995, 13:622-639.
3 Austyn JM. Dendritic cells in transplantation. In: Kamperdi JK, ed. Dendritic Cells in Fundamental and Clinical Immunology. Plenum Press: New York. 1993. 55-70.
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4 Lechler RI, Batchelor JR. Restoration of immunogenicity to passenger cell-depleted kidney allografts by the addition of donor strain dendritic cells. J Exp Med. 1982, 155:31-41.
5 Iwai H, Kuma SI, Inaba MM, et al. Acceptance of murine thyroid allografts by pretreatment of anti-Ia antibody or anti-dendritic cell antibody in vitro. Transplantation. 1989, 47:45-49.
6 Fu F, Li Y, Qian S, et al. Costimulatory molecule-deficient dendritic cell progenitors(MHC classⅡ+, CD80dim,CD86-) prolong cardiac allograft survival in non-immunosuppressed recipients Transplantation. 1996, 62:659-665.
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7 Starzl TE, Demetris AS, Murase N, et al. Cell migration, chimerism, and graft acceptance. Lancet. 1992, 339:1579-1582.
8 Lu Lian, Li W, Fu F, et al. Blockade of the CD40-CD40 ligand pathway potentiates the capacity of donor-derived dendritic cell progenitors to induce long-term cardiac allograft survival Transplantation 1997, 64:1808-1818.
(收稿：1998-07-22 修回：1998-10-12), 百拇医药