尿毒症大鼠的胰岛素样生长因子及其结合蛋白的水平测定和在肝脏中的表达
作者：周湘 MANIAR Saad KLEINKNECHT Claire
单位：100029 北京，中日友好医院儿科(周湘)；法国巴黎Bichat医学院肾生理室(MANIAR Saad、KLEINKNECHT Claire)
关键词：
中华医学杂志990328 儿童时期慢性肾功能不全(CRF)的生长障碍以及采用人工合成生长激素治疗促进儿童生长已成为被关注的研究课题 。本研究的目的是通过检测尿毒症大白鼠血清胰岛素样生长 因子-Ⅰ(IGF-I)及其结合蛋白(IGFBP)血浆水平 和在肝脏中的表达，以探讨IGF-Ⅰ和IGFBP在生长障碍中的作用。
一、材料与方法
1.动物：为雌性幼年Spraque Darley大白鼠(法国)，体重60～70 g。实验组大白鼠的肾脏切除80%，采用质量分数为0.3的酪蛋白食物导致尿毒症合并酸中毒(UA组)，对其中尿毒症未合并酸中毒大白鼠(UB组)在食物中加入碳酸氢钠纠正酸中毒。对照组采用剥离肾包膜的假性手术，采用上述同样食物，其中一组随意进食(AL组)，另一组按配对方式给与尿毒症大白鼠同量的食物(CR组)。
, 百拇医药
2.方法：实验中每日测定大白鼠体重和食物摄入量，实验前后测定2次身长(嘴与尾尖的长度)，并且测定血清尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、pH值及碳酸氢(HCO3-)，两组尿毒症大白鼠的血清Cr和BUN为正常对照组的2倍以上。UA组每只大白鼠血清pH<7.35，HCO3-为13 mmol。术后20天后，取血清冷冻于-20 ℃用于测定血清IGFBP。杀死大白鼠快速取出肝脏组织速冻于液氮中用于测定IGFBP mRNA。
采用放射免疫分析法测定血清IGF-Ⅰ，用Western Ligand Blot分析方法测定IGFBP3和IGFBP4[1]，首先将血清标本经SDS聚丙乙烯凝胶电泳分析，将分离的蛋白转移到醋酸纤维膜上(0.45 μm，法国Amersham公司产品)，将其膜置于含有
125 Ⅰ-IGF-Ⅰ(8～10)×105脉冲信号/min(法国Amersham公司产品)的缓冲液中，4 ℃浮育48小时，在-80 ℃放射自显影7天。显影后的X线片相对分子质量为38 000～43 000的电泳带者为IGFBP3，24 000为IGFBP4，而28 000～32 000为IGFBP2和IGFBP1。采用Immunoblot方法将Western Ligand Blot放射自显影后的纤维膜分别用抗牛IGFBP2多克隆抗体(Code 06-007,法国Euronedex公司产品)和抗人IGFBP1抗体(巴黎Trouseau 医院Binonx教授提供)浮育1小时，再用抗兔免疫球蛋白浮育1小时，用LEC药盒(RPN 2109，法国Amersham公司产品)显影。采用Northern bolt分析法测定肝脏IGFBPmRNA[2]。从大白鼠肝脏抽取总RNA，并用琼脂凝胶电流分离，转移至尼龙膜后，进行预杂交。然后分别用P32标记的IGFBP1-cDNA、IGFBP2-cDNA及IGFBP4-cDNA(由荷兰鹿特丹Erasees大学Van Neck教授提供。)杂交过夜。经-80 ℃放射自显影48小时后，所有显影后X线胶片的带均采用密度测定仪进行定量测定。
, 百拇医药
3.统计学分析：一般营养及生物化学资料均用
±s表示，采用ANOVA检测进行组间比较。然后采用Scheffer进行两两比较，密度测定资料采用Sign检测分析。
二、结果
各组大白鼠的营养和生长指标如表1所示，尿毒症两组大白鼠食物摄入量、生长指标以及血浆IGF-Ⅰ均低于AL组(P<0.01或P<0.05)，与CR组比较差异无显著意义，由表2可见，大白鼠的IGFBP血清水平，除IGFBP1外IGFBP 2～4的CR组与AL组的比值均为低值,表明血清IGFBP 值CR组低于AL组，但差异无显著意义。血清IGFBP 1～4的UB组与CR组的比值均为高值，表明UB组的IGFBP高于CR组(除IGFBP3外，均P<0.05)。血清IGFBP2的UA组与UA组比值是低值，表明血清IGFBP2值UA组低于UB组(P<0.05)，图1，2。
, 百拇医药
表1 各组大白鼠的食物摄入量、食物效益、生物指标以及血清IGF-I水平(±s) 组别
鼠数
食物摄入量
(g/日)
体重增长
(g/日)
身长增长
(cm/日)
食物效益
IGF-I(μg/L)
体重/食物
, 百拇医药
(g/g)
身长/食物
(mm/g)
随意进食组
12
20.0±0.7
8.7±0.3
0.58±0.03
0.44±0.03
0.29±0.02
441±26
限制食物组
, 百拇医药
12
11.7±0.3*
4.5±0.3*
0.30±0.02*
0.38±0.02*
0.26±0.01
301±23**
尿毒症组
12
11.3±0.6*
4.7±0.5*
, 百拇医药
0.36±0.04*
0.40±0.04*
0.31±0.02
256±24**
尿毒症伴酸中毒组
12
12.9±0.5*
5.1±0.3*
0.29±0.02*
0.39±0.02*
, 百拇医药
0.22±0.01
267±35**
注：与随意进食组比**P<0.01,*P<0.05
表2 各组大白鼠血清IGFBP的比值 组 别
IGFBP1
IGFBP2
IGFBP3
IGFBP4
限制食物组/随意进食组
344*
, 百拇医药
71
81
61
尿毒症组/限制食物组
833**
639**
125**
193
尿毒症伴酸中毒组/尿毒症组
298*
68*
, 百拇医药
112
94
注：与IGFBP4比较**P<0.01，*P<0.05
A：尿毒症组大鼠血清，相对分子质量分别为42 000～38 000(IGFBP3)、28 000～32 000(IGFBP2、IGFBP1)及24 000(IGFBP4)；B：食物限制组大鼠血清
图1 Western Ligand blot的放射自显影图
A、B同图1，两者比较P<0.05
, http://www.100md.com
图2 Immunobloting的放射自显影图
表3为IGFBPmRNA在肝脏的表达情况，尿毒症组的IGFBP1和IGFBP2 mRNA均高于AL组(P<0.05)，与CR组比较差异无显著意义，IGFBP4无明显改变。
表3 各组大白鼠肝脏的IGFBPmRNA表达情况(±s) 组别
鼠数
IGFBP1
IGFBP2
IGFBP4
随意进食组
, 百拇医药 6
0.32±0.10
0.11±0.12
1.46±0.24
限制进食组
6
1.40±0.27*
0.43±0.08*
1.31±0.19
尿毒症组
6
0.91±0.17*
, 百拇医药
0.37±0.04*
1.17±0.06
尿毒症伴酸中毒组
6
1.21±0.45*
0.52±0.03*
0.85±0.21
注：与随意进食组比较*P<0.05
三、讨论
本研究发现，尿毒症的大白鼠血清IGFBP均明显高于同样食物摄入的CR组，表明IGFBP升高可能与肾功能障碍有关[3]。本研究表明，尿毒症大鼠和CR组大白鼠肝脏IGFBP1和IGFBP2 mRNA表达均高于正常组，提示食物和营养因素调节肝脏mRNA表达，使IGFBP1和IGFBP2产生增加。IGFBP4主要产生于骨组织，而上述营养因素作用较小，所以肝脏mRNA的反应较小。CR组大白鼠具有正常肾功能，因此不伴有IGFBP升高。尿毒症大白鼠IGFBP升高原因是排出量减少产生量增加。
, 百拇医药
IGF-Ⅰ能促进细胞的分化及功能表达，而其特异性结合蛋白是其功能发挥的重要调节剂，他们的异常增加和减少都有可能影响IGF-Ⅰ的生物活性及功能的表达[4]。目前研究证实，小分子未饱和IGFBP可能抑制IGF介导的生长作用，纯化IGFBP1在0.2 nmol/L 浓度时可抑制IGF-Ⅰ刺激软骨细胞生长，在CRF的IGFBP1浓度约5 nmol/L时，足以抑制软骨细胞增殖[5]。IGFBP2也能抑制IGF刺激纤维母细胞的合成，血清IGFBP3升高后能与循环中IGF-Ⅰ结合而抑制其活性，IGFBP2高浓度时其作用比IGFBP1强，可能是CRF的IGF-Ⅰ活性的抑制剂。而IGFBP4在CRF中的作用研究较少。
本研究发现，大白鼠尿毒症合并酸中毒时，IGFBP2在肝脏的mRNA表达增加，但血浆水平却是降低的。提示，IGFBP2对酸中毒大白鼠引起异常蛋白的分解代谢较为敏感。
参考文献
, http://www.100md.com
1 Hossenlopp P, Seurin P, Segovia-Quinson B，et al.Analysis of serum insulin-like growth factor binding proteins using binding protein and competitive binding studies. Anal Biochem, 1986, 154:138-143.
2 Chomczynski P，Sacchi N.Single-step method of RNA isolation by acid Guanidinium Thiocyanate phenol-Chloroform extraction. Anal Biochem, 1986, 162:156-160.
3 Binoux M，Hossenlopp P.Insulin-like growth factor (IGF) and IGF-binding protein: Comparison of human serum and lymph. Clin Endorcrinol Metab, 1988,67:509-514.
4 Rechler MM, Brown AL. Insulin-like growth factor binding protein: genstructure and expression. Growth Regu, 1992, 2:55-68.
5 Tonshoff B, Blum WF，Mehls O.Derangements of the somatotropic hormone axis in chromie renal failure. Kidney Int，1997，51suppl 58:106-113.
(收稿：1998-05-15 修回：1998-10-10), 百拇医药
单位：100029 北京，中日友好医院儿科(周湘)；法国巴黎Bichat医学院肾生理室(MANIAR Saad、KLEINKNECHT Claire)
关键词：
中华医学杂志990328 儿童时期慢性肾功能不全(CRF)的生长障碍以及采用人工合成生长激素治疗促进儿童生长已成为被关注的研究课题 。本研究的目的是通过检测尿毒症大白鼠血清胰岛素样生长 因子-Ⅰ(IGF-I)及其结合蛋白(IGFBP)血浆水平 和在肝脏中的表达，以探讨IGF-Ⅰ和IGFBP在生长障碍中的作用。
一、材料与方法
1.动物：为雌性幼年Spraque Darley大白鼠(法国)，体重60～70 g。实验组大白鼠的肾脏切除80%，采用质量分数为0.3的酪蛋白食物导致尿毒症合并酸中毒(UA组)，对其中尿毒症未合并酸中毒大白鼠(UB组)在食物中加入碳酸氢钠纠正酸中毒。对照组采用剥离肾包膜的假性手术，采用上述同样食物，其中一组随意进食(AL组)，另一组按配对方式给与尿毒症大白鼠同量的食物(CR组)。
, 百拇医药
2.方法：实验中每日测定大白鼠体重和食物摄入量，实验前后测定2次身长(嘴与尾尖的长度)，并且测定血清尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、pH值及碳酸氢(HCO3-)，两组尿毒症大白鼠的血清Cr和BUN为正常对照组的2倍以上。UA组每只大白鼠血清pH<7.35，HCO3-为13 mmol。术后20天后，取血清冷冻于-20 ℃用于测定血清IGFBP。杀死大白鼠快速取出肝脏组织速冻于液氮中用于测定IGFBP mRNA。
采用放射免疫分析法测定血清IGF-Ⅰ，用Western Ligand Blot分析方法测定IGFBP3和IGFBP4[1]，首先将血清标本经SDS聚丙乙烯凝胶电泳分析，将分离的蛋白转移到醋酸纤维膜上(0.45 μm，法国Amersham公司产品)，将其膜置于含有
125 Ⅰ-IGF-Ⅰ(8～10)×105脉冲信号/min(法国Amersham公司产品)的缓冲液中，4 ℃浮育48小时，在-80 ℃放射自显影7天。显影后的X线片相对分子质量为38 000～43 000的电泳带者为IGFBP3，24 000为IGFBP4，而28 000～32 000为IGFBP2和IGFBP1。采用Immunoblot方法将Western Ligand Blot放射自显影后的纤维膜分别用抗牛IGFBP2多克隆抗体(Code 06-007,法国Euronedex公司产品)和抗人IGFBP1抗体(巴黎Trouseau 医院Binonx教授提供)浮育1小时，再用抗兔免疫球蛋白浮育1小时，用LEC药盒(RPN 2109，法国Amersham公司产品)显影。采用Northern bolt分析法测定肝脏IGFBPmRNA[2]。从大白鼠肝脏抽取总RNA，并用琼脂凝胶电流分离，转移至尼龙膜后，进行预杂交。然后分别用P32标记的IGFBP1-cDNA、IGFBP2-cDNA及IGFBP4-cDNA(由荷兰鹿特丹Erasees大学Van Neck教授提供。)杂交过夜。经-80 ℃放射自显影48小时后，所有显影后X线胶片的带均采用密度测定仪进行定量测定。
, 百拇医药
3.统计学分析：一般营养及生物化学资料均用
±s表示，采用ANOVA检测进行组间比较。然后采用Scheffer进行两两比较，密度测定资料采用Sign检测分析。二、结果
各组大白鼠的营养和生长指标如表1所示，尿毒症两组大白鼠食物摄入量、生长指标以及血浆IGF-Ⅰ均低于AL组(P<0.01或P<0.05)，与CR组比较差异无显著意义，由表2可见，大白鼠的IGFBP血清水平，除IGFBP1外IGFBP 2～4的CR组与AL组的比值均为低值,表明血清IGFBP 值CR组低于AL组，但差异无显著意义。血清IGFBP 1～4的UB组与CR组的比值均为高值，表明UB组的IGFBP高于CR组(除IGFBP3外，均P<0.05)。血清IGFBP2的UA组与UA组比值是低值，表明血清IGFBP2值UA组低于UB组(P<0.05)，图1，2。
, 百拇医药
表1 各组大白鼠的食物摄入量、食物效益、生物指标以及血清IGF-I水平(
±s) 组别鼠数
食物摄入量
(g/日)
体重增长
(g/日)
身长增长
(cm/日)
食物效益
IGF-I(μg/L)
体重/食物
, 百拇医药
(g/g)
身长/食物
(mm/g)
随意进食组
12
20.0±0.7
8.7±0.3
0.58±0.03
0.44±0.03
0.29±0.02
441±26
限制食物组
, 百拇医药
12
11.7±0.3*
4.5±0.3*
0.30±0.02*
0.38±0.02*
0.26±0.01
301±23**
尿毒症组
12
11.3±0.6*
4.7±0.5*
, 百拇医药
0.36±0.04*
0.40±0.04*
0.31±0.02
256±24**
尿毒症伴酸中毒组
12
12.9±0.5*
5.1±0.3*
0.29±0.02*
0.39±0.02*
, 百拇医药
0.22±0.01
267±35**
注：与随意进食组比**P<0.01,*P<0.05
表2 各组大白鼠血清IGFBP的比值 组 别
IGFBP1
IGFBP2
IGFBP3
IGFBP4
限制食物组/随意进食组
344*
, 百拇医药
71
81
61
尿毒症组/限制食物组
833**
639**
125**
193
尿毒症伴酸中毒组/尿毒症组
298*
68*
, 百拇医药
112
94
注：与IGFBP4比较**P<0.01，*P<0.05
A：尿毒症组大鼠血清，相对分子质量分别为42 000～38 000(IGFBP3)、28 000～32 000(IGFBP2、IGFBP1)及24 000(IGFBP4)；B：食物限制组大鼠血清
图1 Western Ligand blot的放射自显影图
A、B同图1，两者比较P<0.05
, http://www.100md.com
图2 Immunobloting的放射自显影图
表3为IGFBPmRNA在肝脏的表达情况，尿毒症组的IGFBP1和IGFBP2 mRNA均高于AL组(P<0.05)，与CR组比较差异无显著意义，IGFBP4无明显改变。
表3 各组大白鼠肝脏的IGFBPmRNA表达情况(
±s) 组别鼠数
IGFBP1
IGFBP2
IGFBP4
随意进食组
, 百拇医药 6
0.32±0.10
0.11±0.12
1.46±0.24
限制进食组
6
1.40±0.27*
0.43±0.08*
1.31±0.19
尿毒症组
6
0.91±0.17*
, 百拇医药
0.37±0.04*
1.17±0.06
尿毒症伴酸中毒组
6
1.21±0.45*
0.52±0.03*
0.85±0.21
注：与随意进食组比较*P<0.05
三、讨论
本研究发现，尿毒症的大白鼠血清IGFBP均明显高于同样食物摄入的CR组，表明IGFBP升高可能与肾功能障碍有关[3]。本研究表明，尿毒症大鼠和CR组大白鼠肝脏IGFBP1和IGFBP2 mRNA表达均高于正常组，提示食物和营养因素调节肝脏mRNA表达，使IGFBP1和IGFBP2产生增加。IGFBP4主要产生于骨组织，而上述营养因素作用较小，所以肝脏mRNA的反应较小。CR组大白鼠具有正常肾功能，因此不伴有IGFBP升高。尿毒症大白鼠IGFBP升高原因是排出量减少产生量增加。
, 百拇医药
IGF-Ⅰ能促进细胞的分化及功能表达，而其特异性结合蛋白是其功能发挥的重要调节剂，他们的异常增加和减少都有可能影响IGF-Ⅰ的生物活性及功能的表达[4]。目前研究证实，小分子未饱和IGFBP可能抑制IGF介导的生长作用，纯化IGFBP1在0.2 nmol/L 浓度时可抑制IGF-Ⅰ刺激软骨细胞生长，在CRF的IGFBP1浓度约5 nmol/L时，足以抑制软骨细胞增殖[5]。IGFBP2也能抑制IGF刺激纤维母细胞的合成，血清IGFBP3升高后能与循环中IGF-Ⅰ结合而抑制其活性，IGFBP2高浓度时其作用比IGFBP1强，可能是CRF的IGF-Ⅰ活性的抑制剂。而IGFBP4在CRF中的作用研究较少。
本研究发现，大白鼠尿毒症合并酸中毒时，IGFBP2在肝脏的mRNA表达增加，但血浆水平却是降低的。提示，IGFBP2对酸中毒大白鼠引起异常蛋白的分解代谢较为敏感。
参考文献
, http://www.100md.com
1 Hossenlopp P, Seurin P, Segovia-Quinson B，et al.Analysis of serum insulin-like growth factor binding proteins using binding protein and competitive binding studies. Anal Biochem, 1986, 154:138-143.
2 Chomczynski P，Sacchi N.Single-step method of RNA isolation by acid Guanidinium Thiocyanate phenol-Chloroform extraction. Anal Biochem, 1986, 162:156-160.
3 Binoux M，Hossenlopp P.Insulin-like growth factor (IGF) and IGF-binding protein: Comparison of human serum and lymph. Clin Endorcrinol Metab, 1988,67:509-514.
4 Rechler MM, Brown AL. Insulin-like growth factor binding protein: genstructure and expression. Growth Regu, 1992, 2:55-68.
5 Tonshoff B, Blum WF，Mehls O.Derangements of the somatotropic hormone axis in chromie renal failure. Kidney Int，1997，51suppl 58:106-113.
(收稿：1998-05-15 修回：1998-10-10), 百拇医药