閻犲洤鍢查崢娑㈡儌鐠囪尙绉�
几种肿瘤多药抗药性逆转剂对耐药细胞膜脂流动性及P－糖蛋白表达的影响
作者：符立梧 潘启超 黄红兵 梁永钜 杨小平 冯公侃
单位：中山医科大学肿瘤防治中心(广州，510060)
关键词：多药抗药性；吗丙嗪；苄普地尔；HWL-12；P-糖蛋白；膜脂流动性
New Page 1
【摘要】目的：探讨几种有效的抗肿瘤药多药抗药性(MDR)逆转剂对MDR细胞膜脂流动性及P糖蛋白(P-gp)表达的影响，以阐明其逆转MDR机理。方法：细胞株为抗阿霉素人乳腺癌细胞MCF-7/ADR及其相应的敏感株MCF-7。P-gp表达测定采用Western blot法，膜脂流动性的测定采用DPH标记的荧光分光光度计法。结果：在无逆转剂存在时，MCF-7/ADR细胞的荧光偏振度显著低于MCF-7细胞，吲哚衍生物2-苯-3-(3’，5’-双吗啉甲基-4’-羟基)苯甲酰吲哚(HWL-12)及吗丙嗪(Pro-)显著增加MCF-7/ADR细胞的荧光偏振度，即降低膜脂流动性。苄普地尔(Bep)及维拉帕米(Ver)对MCF-7/ADR细胞的荧光偏振度无影响，即不能改变膜脂流动性。Ver、Bep、HWL-12能显著地降低P-gp表达，而Pro无此作用。结论：pro逆转MDR的作用可能与降低MDR细胞膜脂流动性有关；Bep及Ver可能与降低P-gp表达有关；HWL-12可能既与降低MDR细胞的膜脂流动性有关，也与降低P-gp表达有关。
中图号：R979.1 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)03-0270-03
Influence of some potent modulators of multidrug resistance on
cellular membrane fluidity and expression of P-gp protein
FU li-wu, PAN Qi-chao, HUANG Hong-bing,et al
Cancer Center, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510060,China
【Abstract】Objective：To explore the possible reversal mechanism of multidrug resistance(MDR),the effects of probimane(Pro),2-phenyl-3(3',5'-dimor-pholinomethyl-4'-hydroxy)-benzoyl-indole (HWL- 12),bepridil (Bep) and verapamil (Ver)on P-glycoprotein(P-gp)expression and membrane fluidity in MCF-7/ADR and MCF-7 cells were studied.Methods：P-gp expression was determined by western blot.Membrane fluidity was determined by fluorescence spectrophotometry measurement with DPH label.Results：The membrane fluidity was higher in MCF-7/ADR than in MCF-7.HWL-12 and Pro could reduce the membrane fluidity in MCF-7/ADR,while Bep and Ver could not.Ver,Bep and HWL-12 could decrease P-gp expression in MCF-7/ADR, but Pro did not.Conclusion：The decrease of membrane fluidity was associated with the reversal of MDR by pro. The decrease of P-gp expression was associated with the reversal of MDR by ver and bep. The decreases of both P-gp expression and membrane fluidity were involved in the reversal of MDR by HWL-12.
Key words：Multidrug resistance;Probimane;Bepridil; HWL-12;Verapamil;P-glycoprotein;Membrane fluidity
肿瘤化疗失败的主要原因之一为肿瘤细胞产生抗药性，尤其是肿瘤多药抗药性(Multidrugresistance, MDR)。多药抗药性是指肿瘤细胞接触一种来源于天然的抗肿瘤药物并产生抗药性时，同时对结构和作用机理不同的多种天然来源的抗肿瘤药物产生交叉抗药性。已证实MDR的主要原因之一是P-糖蛋白(Permeability glycoprotein, P-gp)过度表达〔1〕。实际上，P-gp是一种依赖于ATP的外排泵，能将抗癌药物从肿瘤细胞内排至细胞外，从而使肿瘤细胞内的抗癌药物浓度降低，因此产生MDR。逆转MDR是提高肿瘤化疗疗效的主要途径。P-gp表达量的改变，影响着肿瘤细胞的耐药程度；细胞膜的物理状态影响着细胞膜的功能包括细胞膜通透性及存在于细胞膜中的酶的活性〔2〕。P-gp是存在于膜中的糖蛋白质，且依赖于ATP酶的活性，那么膜流动性的改变也可能影响着P-gp的功能。
为了寻找逆转剂，我们对具有“理想”活性结构的化合物已进行了筛选，发现吲哚类化合物2-苯-3-(3’，5’-双吗啉甲基-4’-羟基)-苯甲酰吲哚(HWL-12)〔3〕、吗丙嗪(Probiman,Pro)〔4〕及苄普地尔(Bepridil,Bep)〔5〕在体外具有比维拉帕米(Verapamil,Ver)更强的逆转MDR的活性，且均使MDR细胞内抗癌药物的积累增加，但其通过什么样途径增加MDR细胞内抗癌药物的积累?机理尚不清楚。本研究旨在探讨其对MDR细胞膜脂流动性及Pgp表达的影响，以期阐明其逆转MDR的机理。
1 材料与方法
1.1 材料
DPH为Sigma公司产品；P-gp单克隆抗体JBS-1由美国纪念SloanKettering肿瘤研究所周廷潮教授赠送。维拉帕米(Ver)由奥地利Ebewe药厂惠赠，做阳性对照之用。吗丙嗪由中国科学院药物研究所胥彬教授赠送；HWL-12由中国药科大学黄文龙教授合成及提供；具有较弱的钙通道的阻断活性；Bep(钙道通阻断剂)由广州市第一人民医院药剂科王娟药师赠送(质谱纯)。
1.2 方法
1.2.1 细胞系及其培养：MCF-7为人乳腺癌细胞，MCF-7/ADR为耐阿霉素的人乳腺癌细胞。两细胞株均由北京肿瘤研究所刘叙仪教授赠送(来源于美国国立肿瘤研究所)。MCF-7/ADR细胞是由敏感的MCF7细胞接触浓度递增的ADR诱导而成。已证实MCF-71ADR能稳定过度表达P糖蛋白，具有典型的多药抗药性。在不含ADR的培养基中培养3个月仍能维持MDR的表型〔6〕。两细胞株均培养于DMEM培养液中，内含10%小牛血清，青霉素100IU.m-1和链霉素100μg.ml1，置于37℃含5%CO2的孵箱中培养。
1.2.2 细胞毒测定：本实验以噻唑兰(MTT)法〔7〕进行。对数生长期细胞加入不同浓度的受试物，作用72小时后，结束培养前4h加入MTT再培养，然后倾去培养液，加入二甲亚砜，测定其吸光度。分别计算抑制细胞生长达50%时的药物浓度，以IC50值表示。逆转倍数为IC50(ADR)/IC50(ADR+逆转剂)。
1.2.3 P-gp表达测定：10μmol/L药物作用不同时间，收集细胞，分离细胞膜，以Westernblot法〔8〕测定。
1.2.4 膜脂流动性的测定：10μmol/L药物作用24h，收集细胞。以DPH标记的荧光分光光度计法测定，以荧光偏振度表示，荧光偏振度越大，表示膜脂流动性越小〔9〕。
2 结果
2.1 HWL-12、Pro、Bep及Ver对MCF-7/ADR及MCF-7细胞荧光偏振度的影响
MCF-7细胞的荧光偏振度较MCF-7/ADR大(P<0.01)，即MCF-7细胞的膜脂流动性较MCF-7/ADR小。HWL-12及Pro均能显著增加MCF-7/ADR的荧光偏振度，即降低膜脂流动性；而Bep及Ver对MCF-7/ADR及MCF-7细胞的膜脂流动性均无影响(见表1)。
表1 HWL-12、Pro、Bep及Ver对MCF-7/ADR及MCF-7
细胞荧光偏振度的影响
逆转剂
浓度
(μmol/L)
荧光偏振度(P)(
±s)MCF-7
MCF-7/ADR
Control
0.187±0.001
0.146±0.002
Ver
10
0.185±0.006
0.144±0.008
Bep
10
0.182±0.006
0.155±0.008
Pro
10
0.191±0.004*
0.170±0.009**
HWL-12
10
0.185±0.008
0.178±0.002**
3次独立试验
±s，与不加逆转剂的对照组相比*P<0.05；**P<0.012.2 HWL-12、Pro、Bep及Ver对P-gp表达的影响
10μmol/LHWL-12、Bep及Ver分别与MCF-7/ADR共同培养一定时间均能降低P-gp的表达，而Pro无此作用(见图1)。
图1 HWL-12、Pro、Bep及Ver对P-gp表达的影响
1.MCF-7/ADR阳性对照；
2.MCF-7/ADRPro培养3天，P-gp表达不变；3.MCR-7/ADRPro培养6天，P-gp表达不变；4.MCR-7/ADR阳性对照组；
5；MCF-7阴性对照组；6.MCF-7/ADR阳性对照组；7.MCF-7/ADRHWL-12培养3天，P-gp表达降低；
8；MCF-7/ADRHWL-12培养6天，P-gp表达降低；9.MCF-7/ADRVer培养3天，P-gp表达降低；10.MCF-7/ADRVer培养6天，P-gp表达降低；11.MCF-7/ADR阳性对照组；
12.MCF-7/ADRBep培养3天，P-gp表达降低；13.MCF-7/ADRBep培养6天，P-gp表达降低。
3 讨论
加入不同浓度的逆转剂及不同浓度的Dox作用72小时，结果表明HWL-12〔3〕、Pro〔4〕、Bep〔5〕及Ver均具有明显的体外逆转MDR活性。在10μmol/L浓度下，对MCF-7/ADR细胞，HWL-12、Pro及Bep逆转MDR活性分别为17.2，16.2，16.8倍较VRP的8.2倍为高。
不同的逆转剂其逆转MDR的机理不同，一种逆转剂可能同时存在着多种逆转机理。P-gp的过度表达是MDR生成的主要原因之一。Muller等〔8〕报道Ver与人白血病细胞K562/ADM共同培养，使P-gp表达量减少。Biedler等〔10〕指出许多MDR的逆转剂可降低mdrl基因的表达。本研究结果提示HWL-12、Bep及Ver均显著地降低MCF-7/ADR的P-gp的表达，而Pro无明显降低P-gp表达。
生物膜调节着膜的物理特性和膜蛋白的功能。细胞膜脂质的物理状态的改变可能影响着许多重要递质的转运过程，包括不同物质及电解质的转运，也影响着膜结合酶的活性〔2〕。P-gp是存在于细胞膜的糖蛋白，膜脂状态的改变可能也影响着P-gp的功能。Siegfried等〔11〕观察到S180细胞株细胞膜脂流动性的降低与该细胞株对阿霉素的抗药性程度呈相关关系。Dudeja等〔12〕报道具有降低膜流动性的表面活性剂，能逆转MDR，无降低膜流动性的表面活性剂，则无逆转MDR作用；Sinicrope〔13〕等指出苯乙醇能增加MDR细胞柔红霉素的积累，但当其浓度降低至不能改变膜流动性时，则无增加MDR细胞内柔红霉素的积累。这表明，改变MDR细胞膜流动性可逆逆MDR。
Pajeva〔14〕研究提示，MDR细胞膜流动性不同于相应的敏感细胞株，是由于其细胞膜的结构及组成不同。许多MDR的逆转剂，直接(与细胞膜磷脂成份的交互作用)或间接(改变细胞膜组成成分等)作用而改变细胞膜流动性。本研究表明，HWL-12及Pro能显著降低MCF-7/ADR细胞的膜脂流动性的作用，而降低MCF-7细胞膜脂流动性的作用不明显，这是否与改变其组成或结构有关?有待进一步研究。
本研究发现HWL-12及Pro能显著降低MCF-7/ADR细胞的膜脂流动性的作用，但Bep及Ver对MCF-7/ADR细胞的膜脂流动性未见影响。这说明HWL-12及Pro的逆转机理可能与Bep及Ver不同，Pro的逆转机理可能与降低MDR细胞膜脂流动性，从而影响着MDR细胞膜P-gp的功能有关；而Bep及Ver的逆转机理可能与降低MDR细胞的P-gp的表达有关；而HWL-12可既与降低MDR细胞膜脂流动性有关，也与降低P-gp表达有关。
基金项目：广东省科委自然科研基金资助(No.980104)
参考文献
1 Beck WT. Mechanisms of multidrug resistance in human tumor cells.The roles of P-glycoprotein,DNA topoisomeraseⅡ,and other factors〔J〕.Cancer Treat Rev,1990,17(Suppl A)：11.
2 Hui SW and Sen A. Effects of lipid packing on polymorphic phase behavior and membrane properties〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,1989,86：5825.
3 FU LW PAN QC, HUANG WL,et al.Reversal tumor multdrug resistance by 2-pheny1-3-(3',5' dimorpholinomethy1-4'-hydroxy)-benzoyl-indole(HWL-12)〔J〕.Acta Pharma Sinic,1998,19(1)： 77.
4 符立语，潘启超，梁永钜，等.吗丙嗪逆转肿瘤多药抗药性作用及其机理〔J〕.中国药理学通报，1997，13(4)：318.
5 符立梧，潘启超，张永明，等.Bepridil逆转肿瘤多药抗药性作用〔J〕.癌症，1998，17(3)：178.
6 Fairchild CR, Ivy SP, Kao-Chan KC, et al. Isolation of amplified and overexpression DNA sequences from adriamycin-resistant human breast cancer cells〔J〕. Cancer Res,1987, 47：5141.
7 符立梧，潘启超，林广云.MTT法与Fura-2/AM法筛选多药抗药性逆转剂的比较研究〔J〕.药学学报，1997，6：401.
8 Muller C, Bailly JD, Goubin F, et al. Verapamil decreases P-glycoprotein expression in multidrug resistant human leukemic cell lines〔J〕.Int J Cancer,1994,56：749.
9 林克椿，聂松青，薄惠卿，等.用荧光探剂DPH研究腹水癌细胞膜脂流动性〔J〕.生物化学与生物物理学进展，1982，1：31.
10 Biedler JL, Chang T, Druskin H, et al. Modulation of multidrug-resistance gene expression by chemosensitizing agents〔J〕. Proc Amer Ass Cancer Res, 1993,34：579.
11 Siegfried JA, Kennedy KA, Sartorelli AC, et al. The role of membranes in the mechanism of action of the antineoplastic agent adriamycin〔J〕.J Biol Chem,1983,258：339.
12 Dudeja PK, Anderson KM, Harris JS, et al. Reversal of multidrug resistance phenotype by surfactants： relationship to membrane lipid fluidity〔J〕.Arch Biochem Biophys,1995,319(1)：309.
13 Sinicrope FA,Dudeja PK,Bissonnette BM,et al. Modulation of P-glycoprotein mediated drug transport by alternations in lipid fluidity of rat liver canalicular membrane vesicles〔J〕. J Biochem, 1992,267：24995.
14 Pajeva IK,Wiese M,Cordes HP,et al.Membrane interactions of some catamphiphilic drugs and relation to their multidrug-resistance-reversing ability〔J〕. J Cancer Res Clin Oncol,1996,122(1)：27～ 40.
收稿日期：1998-07-27；修回日期：1999-01-05