CD44v6基因编码蛋白表达与胃癌转移和预后的关系*
作者：辛 彦 赵风凯 张素敏 吴东瑛 王艳萍 徐 蕾
单位：中国医科大学肿瘤研究所第四研究室 辽宁省沈阳市 110001
关键词：胃肿瘤；肿瘤转移；腺癌；CD44v6基因；基因表达
世界化人消化杂志990309
中国图书资料分类号 R735.2
摘 要
目的 观察转移相关粘附分子拼接变异体CD44v6在人胃癌组织中的不同表达，探讨CD44v6与胃癌病理生物学行为之间的关系，评价CD44v6可否作为一个新的客观预测胃癌细胞转移潜能和胃癌患者预后的可靠生物学指标.
方法 采用鼠抗人CD44v6特异性mAb，对45例早期胃癌，22例中期胃癌和103例晚期胃癌手术切除标本之胃原发灶与转移灶进行了ABC免疫组化检测. 应用χ2检验和Log rank检验方法对结果做统计学分析.
, 百拇医药
结果 CD44v6在晚期胃癌中的检出率为46.6%(48/103)，明显高于早期胃癌(26.7%，12/45)和中期胃癌(27.3%，6/22，P<0.01). 伴淋巴结转移和伴肝脏转移之胃癌CD44v6检出率分别为49%(50/102)和71.4%(5/7)，明显高于不伴转移的胃癌(18.6%，11/59，P<0.01). 肠型胃癌中CD44v6检出率为44.9%(48/107)，明显高于弥漫型胃癌(27.4%，17/62，P<0.05). 但是，CD44v6的表达与胃癌原发灶大小和组织学类型及分化程度未见明显相关. CD44v6阳性胃癌患者的术后生存期显著短于CD44v6阴性胃癌的患者(P=0.0002).
结论 CD44v6基因编码蛋白的表达与胃癌的临床病理生物学行为密切相关，特别是与胃癌细胞的转移潜能和胃癌患者的不良预后密切相关. CD44v6基因编码蛋白可作为一个新的准确预测胃癌细胞转移潜能并客观估计胃癌患者预后的生物学指标.
Relationship between CD44v6
, 百拇医药
expression and prognosis in gastric
carcinoma patients*
XIN Yan, ZHAO Feng-Kai, ZHANG Su-Min, WU Dong-Ying, WANG Yan-Ping and XU Lei
Fourth Laboratory, Cancer Institute, China Medical University, Shenyang 110001, Liaoning Province, China
Subject headings stomach neoplasms; neoplasm metastasis; adenocarcinoma; CD44v6 gene; gene expression
, 百拇医药
Abstract
AIM To investigate differential expressions of the human metastasis molecule adhesion CD44 splice variant 6 (CD44v6) in gastric carcinomas (GC), and to evaluate whether CD44v6 can be a useful marker in predicting metastatic potential of GC and prognosis of the patients with GC.
METHODS Forty-five cases of early gastric carcinoma(EGC), 103 advanced gastric carcinoma(AGC) and 22 intermediate gastric carcinoma(MGC)surgically resected specimens were studied immunohistochemically by using a mAb against CD44v6 (from R&D Systems). An antigen retrieval method followed by a routine ABC Process was employed.
, 百拇医药
RESULTS In the gastric mucosa adjacent to tumour, weak and focal CD44v6 expression was detected within the foveolar proliferation zone but not on mucoid surface epithelium. There was also focally positive reaction in the intestinal metaplasia adjacent to GC. CD44v6 was detected in the membrane of cancer cells in 38.8% (66/170) of GC investigated. CD44v6 was detected in 26.7% (12/45) of EGC, 27.3% (6/22) of MGC, and 46.6% (48/103) of AGC. CD44v6 was detected in 48.2% (53/110) of GC with lymph node metastasis (Ln mets) , 71.4% (5/7) of GC with liver metastasis, while only in 18.6% (11/59) of GC without any metastasis (P<0.01). Furthermore, CD44v6 was detected in 47 out of 107 (43.9%) intestinal-type gastric carcinomas, compared with 17 out of 62 (27.4%)in diffuse-type tumours (P<0.05). The strongly positive reaction to mAb-CD44v6 was detected only in GC with Ln mets and liver mets but not in GC without mets (P<0.05). CD44v6 positive GC patients showed a significantly shorter survival period after surgical operation than those with CD44v6 negative GC patients (P=0.0002).
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CONCLUSION The expression of CD44v6 is correlated with progression and metastasis of GC, as well as with worse prognosis of patients with GC. CD44v6 is hopefully to be a useful marker of predicting the metastatic potential of GC and the prognosis of the patients with GC.
0 引言
CD44v6蛋白是位于人类第11号染色体短臂上的基因所编码的细胞表面粘附分子，主要参与细胞-细胞，细胞-基质之间的特异性粘连过程. CD44v6完整基因组在染色体DNA上大约跨越50Kb，有20个高度保守的外显子[1]. 在第5，6编码子间，至少有10个编码子(亦称变异编码子v1～v10)可随时发生拼接变异，指导合成一系列结构相似，分子大小相异且功能有别的拼接变异体CD44分子(以下简称CD44v). 研究发现，CD44v的表达可增加大鼠肿瘤的转移潜能. 人乳腺癌、结肠癌和甲状腺癌均表达多种CD44v，而上述器官的非肿瘤性正常组织则不表达[2]. 在多种伴有转移的肿瘤和临床上无任何转移迹象的肿瘤之间，CD44v的表达有显著差异[3，4]. 胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，在我国，胃癌多年来一直是死亡率最高的恶性肿瘤[5]. 胃癌患者死亡的主要原因是术后转移. 由于临床上尚无可靠的方法预测，故而使转移的早诊和有效防治显得力不从心. 因此，探究胃癌转移的分子机制，寻找与胃癌转移相关的生物标志多年来一直是胃癌基础与临床研究的主题之一. 我们观察CD44v6基因编码蛋白在胃癌组织中的表达及其与胃癌临床病理生物学行为之间的关系，评价CD44v6可否作为一个可靠预测胃癌转移潜能和胃癌患者预后的生物学指标.
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1 材料和方法
1.1 材料 中国医科大学肿瘤研究所胃癌术后标本170例，按全国胃癌协作组制定的有关胃癌大体分型，组织学分型和临床病理分期等规范进行严格的病理诊断. 临床病理分期：早期45例，中期22例，晚期胃癌103例. 转移情况：无转移59例，伴淋巴结转移102例，伴肝转移7例，伴卵巢转移2例. 170例胃癌患者中，155例进行了至少5a的术后随访.
1.2 方法 每例分别选择远癌“正常”胃粘膜(距癌灶>4cm)，癌旁胃粘膜(距癌灶<2cm)，胃原发癌灶，淋巴结转移灶及肝脏，卵巢转移癌灶组织的石蜡包埋之常规病理组织蜡块各一枚，制作4μm厚切片备免疫组化用. 每块组织均留1张连续切片做HE对照. 鼠抗人CD44v6 mAb购自R&D System， Europe. 该抗体可特异性识别人CD44v6基因编码蛋白，工作浓度1∶200. 生物素标记的兔抗鼠二抗为DAKO公司产品，工作浓度1∶200. 试剂盒购自Vector公司，工作浓度1∶100. 脱蜡后的切片置于10mol/L枸橼酸缓冲剂(pH 6.0)中，在75℃恒温箱中16h. 此抗原修复方法与微波炉及高压加热比，可明显提高CD44v6的检出率. 抗原修复后的切片进行常规ABC免疫组化染色，DAB呈色，苏木素复染. 定性标准：凡在细胞膜和细胞质见清晰褐色颗粒者为CD44v6阳性细胞. 半定量分级方法：根据阳性细胞在同类细胞中所占比例的多少将免疫组化染色结果分为4个等级. 阴性(-)：无阳性细胞或<5%的细胞呈阳性反应；弱阳性(+)：5%～24%的细胞呈阳性反应；中度阳性(++)：25%～50%的细胞呈阳性反应；强阳性反应(+++)：>50%的细胞呈阳性反应.
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统计学处理 采用χ2检验和Log rank检验方法分别对免疫组化结果和胃癌患者术后生存资料进行分析处理.
2 结果
本组远癌“正常”胃粘膜组织中未见CD44v6表达. 癌旁胃粘膜组织内见局灶性CD44v6表达，多为弱阳性(+)，少数为中度阳性(++). 阳性反应主要位于腺颈部增殖带区，或位于癌周再生粘膜的增殖旺盛区(图1). 胃粘膜表层粘液上皮细胞未见CD44v6的表达. 胃粘膜肠上皮化生区CD44v6的表达较非肠化生区强(图2). 本组170例胃癌标本中有66例检出CD44v6的特异表达，阳性率为38.8%. 胃癌细胞CD44v6阳性反应定位于癌细胞膜. CD44v6在晚期胃癌中的检出率(46.6%，48/103)明显高于早期胃癌(26.7%，12/45)和中期胃癌(27.3%，6/22，P<0.01). 伴淋巴结和肝脏转移之胃癌CD44v6检出率分别为49.0%(50/102)和71.4%(5/7)，明显高于不伴转移的胃癌(18.6%，11/59，P<0.01). 肠型胃癌中CD44v6检出率(44.9%，48/107)明显高于弥漫型胃癌(27.4%,17/62，P<0.05，表1～5和图3～8). 采用Log rank检验对155例胃癌患者术后生存期分析的结果表明，CD44v6阳性胃癌患者的生存期明显短于CD44v6阴性的患者(P=0.0002，图9).
, 百拇医药
表1 CD44v6蛋白表达与胃癌临床病理分期的关系
(n,%) 临床病理分期
n
CD44v6蛋白表达
合计
+～+++
+
++
+++
早期胃癌
45
2(4.4)
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10(22.2)
0
26.7
中期胃癌
22
2(9.1)
4(18.2)
0
27.3
晚期胃癌
103
20(19.4)
12(11.7)
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16(15.5)
46.6a
合计
170
24(14.1)
26(15.3)
16(9.4)
38.8
aP<0.05，vs 早、中期.表2 CD44v6蛋白表达与胃癌转移的关系
(n,%) 转移情况
n
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CD44v6蛋白表达
合计
+～+++
+
++
+++
无转移
59
2(3.4)
8(13.6)
1(1.7)
18.6
淋巴结转移
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102
20(19.6)
17(16.7)
13(12.7)
49.0b
肝脏转移
7
2(28.6)
1(14.3)
2(28.6)
71.4a
卵巢转移
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2
0
0
0
aP<0.05，bP<0.01，vs 无转移.表3 CD44v6蛋白表达与Lauren分型的关系
(n,%) Lauren分型
n
CD44v6蛋白表达
合计
+～+++
+
, 百拇医药 ++
+++
肠型
107
17(15.9)
20(18.7)
11(10.3)
44.9a
弥漫型
62
7(11.3)
6(13.8)
4(6.5)
, 百拇医药
27.4
aP<0.05，vs 弥漫型.
图1 癌旁粘膜. 腺颈部增殖区CD44v6弱阳性(+)，阳性颗粒位于胞质中 ×100
图2 癌旁肠化生粘膜. CD44v6中度阳性(++)，阳性颗粒位于肠化生细胞质内 ×200
图3 胃腺癌(肠型). 癌细胞膜上CD44v6中～强阳性 ×200
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图4 早期胃癌淋巴结转移. 癌细胞膜上CD44v6强阳性 ×200
图5 进展期胃癌淋巴结转移. 原发灶癌细胞膜上CD44v6强阳性 ×200
图6 淋巴结转移灶内. 癌细胞膜CD44v6强阳性 ×200
图7 胃腺癌(肠型)肝转移灶 HE×200
图8 肝脏转移灶癌细胞膜上CD44v6中度阳性 ×200
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图9 CD44v6表达与胃癌患者预后的关系.
表4 CD44v6蛋白表达与胃癌原发灶大小的关系
(n,%) 原发灶大小
n
CD44v6蛋白表达
合计
+～+++
+
++
+++
≤4cm
39
, 百拇医药
3(7.7)
6(15.4)
0
23.1
>4cm
116
24(12.1)
16(13.8)
13(11.2)
37.1
表5 CD44v6蛋白表达与胃癌组织学类型和分化的关系
(n,%) 组织学类型/分化程度
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CD44v6蛋白表达+～+++
乳头状腺癌
9/24(37.5)
高分化管状腺癌
3/13(23.1)
中分化管状腺癌
12/30(40.0)
低分化腺癌
30/62(48.4)
未分化癌
4/15(26.7)
印戒细胞癌
, 百拇医药
2/17(11.8)
粘液腺癌
5/8(62.5)
鳞状细胞癌
1/1(100.0)
合计
66/170(38.8)
3 讨论
细胞与细胞之间，细胞与细胞外间质之间粘附特性的异常是恶性肿瘤细胞最基本的生物学特征之一. 这种粘附特性的异常导致肿瘤细胞具有了从原发部位脱落并向周围正常组织侵袭的能力，而正是这种侵袭能力的大小决定了肿瘤恶性程度的高低. CD44是一个近年来倍受关注，在细胞恶性转化过程中其结构和功能均发生显著变化而影响转化后肿瘤细胞侵袭转移行为的典型的细胞表面粘附分子. CD44产物主要有两类，即标准型(CD44s)，也称血型(CD44H)，和变异型(CD44v). CD44s在生理状态下参与细胞的游走和运动. CD44v则主要出现在机体的病理过程，特别是肿瘤的发生发展过程中. CD44v的出现改变了肿瘤细胞表面粘附分子的构成和功能，使肿瘤细胞侵袭与转移的能力增强.
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正常胃粘膜是否表达CD44v目前仍不清楚. Heider et al[6]认为正常胃粘膜组织中有CD44v5/v6变异分子的表达. Harn et al[7]报告，在福尔马林固定，石蜡包埋的常规病理组织标本中，正常胃粘膜不表达CD44v3/v4,v5,v6,v7和v8-10. 最近，Mirecka et al[8]发现，利用微波抗原修复方法处理后，可在正常胃体腺的壁细胞中检出CD44v6的表达. 由于不同作者的研究报告基于不同处理的组织标本或采用不同的抗原修复方法，故难以将来自不同作者的结果直接进行比较. 与迄今其他相关报告不同，我们采用了一种非常简便有效的抗原修复方法，在降低背景非特异着色的基础上，提高了CD44v6的检出率，效果很好. 本结果表明，在远癌“正常”胃粘膜中未检出CD44v6，而在癌旁的非癌胃粘膜中，在腺颈部增殖区和再生粘膜的增生活跃区可见CD44v6呈弱阳性表达，但在表面粘液上皮细胞及胃体腺壁细胞中未见CD44v6表达. 在胃粘膜肠上皮化生区，可见CD44v6呈局灶性中度阳性表达，主要分布在肠化生粘膜隐窝部增殖区. 此结果与以往的报告相符[6]. CD44v6在远癌胃粘膜中不表达而在癌旁胃粘膜中和肠上皮化生中有一定程度表达这一现象，似乎提示：①CD44v6可能与胃粘膜上皮细胞的恶性转化有关；②胃癌细胞可以从胃粘膜和肠化生粘膜两种上皮细胞转化而来.
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胃癌的组织学类型以腺癌占大多数，可高达97%以上. Lauren根据胃癌组织学形态特征将其分为肠型胃癌和弥漫型胃癌两大类. 已发现肠型胃癌和弥漫型胃癌在病理生物学行为和流行病学特点等方面存在着显著差异. Heider曾报道，92.6%的肠型胃癌呈CD44v6阳性，而弥漫型胃癌仅有17.6%呈阳性[6]. Mirecka et al发现肠型和弥漫型胃癌CD44v6表达无统计学差异[7]. 我们发现，肠型胃癌CD44v6的表达率(44.8%)明显高于弥漫型胃癌(27.4%，P<0.05). 此结果提示：①CD44v6的表达与肠型胃癌发生发展的关系可能较与弥漫型胃癌更加密切；②肠型胃癌和弥漫型胃癌可能通过不同的基因调控途径发展而来. 关于肠化生和肠型胃癌之间的分子病理学联系尚需做进一步深入探讨.
Kerbel et al[9]报道，具有转移潜能的亚克隆瘤细胞在原发癌灶发生的早期即具有生长优势，这种生长优势是由于转移性亚克隆细胞群体可分泌某种特殊因子或对局部细胞生长因子具有特殊反应而呈现的选择性生长所决定的. 所以，检测原发肿瘤标本中某些肿瘤分子标志的水平有可能反应出整个肿瘤的一般转移特性. Mayer et al[10]报道，肿瘤的进展与CD44v6表达相关. Heider et al报道，当对原发癌灶和转移灶进行配对研究中发现，肿瘤的转移与CD44v6的表达相关，并因此推测在原发灶和淋巴结转移灶中均可检出CD44v6呈阳性的细胞克隆这一事实提示CD44v6在转移过程中起着重要作用. 在本组研究中，均匀一致的CD44v6强阳性表达仅存在于伴有淋巴结转移或伴肝脏转移的晚期胃癌病例，而早期和中期胃癌仅见CD44v6呈局灶性弱-中度阳性表达. 此外，85.7%(12/14)伴有淋巴结转移的胃癌，在其淋巴结转移灶中也可检出CD44v6的表达；3例伴肝脏转移的胃癌，于原发灶和转移灶中同时检出CD44v6的表达. 上述结果提示在早期胃癌原发灶中，CD44v6仅在转移性亚克隆细胞膜上表达，随着肿瘤的进展，表达CD44v6的亚克隆癌细胞因其与周围细胞和间质具有特殊的相互作用，即具有转移潜能而在生长中逐渐占居优势并发生转移. 据此，作者认为，CD44v6的检测在预测原发肿瘤的转移潜能方面具有较大实用价值. 本研究还发现，CD44v6阳性胃癌患者的术后生存期明显短于CD44v6阴性胃癌患者，提示CD44v6的表达与胃癌患者的预后密切相关，有望作为一个新的、可靠估计胃癌患者预后的病理生物学指标.
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作者简介：
辛彦，女，1956-09-26生，辽宁省沈阳市人，汉族. 1982年中国医科大学临床医学系毕业. 1987年中国医科大学硕士，1993年中国医科大学博士. 1994年和1996年两度赴英国和爱尔兰留学研修. 肿瘤病理学教授，博士生导师，享受国务院政府特殊津贴专家，第四研究室主任. 主要从事消化道肿瘤病理学研究，发表论文50篇，获辽宁省政府科技进步二等奖和国家教委科技进步三等奖. 1996年首批入选国家人事部百千万人才工程.
*国家自然科学基金资助，No.39370772.
通讯作者 辛彦教授，110001，中国医科大学肿瘤研究所第四研究室，辽宁省沈阳市和平区南京北街155号.
*Supported by the National Natural Science Foundation of China, Grant No.39370772.
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Correspondence to:Prof. XIN Yan, Fourth Laboratory, Cancer Institute, China Medical University, 155 Nanjing Beijie, Heping District, Shenyang 110001, Liaoning Province, China
Tel. +86.24.23863731 Ext. 6351, Fax. +86.24.23224417
4 参考文献
[1] Screaton GR, Bell MV, Jackson DG, Cornelis FB, Gerth U, Bell JI. Genomic structure of DNA encoding the lymphocyte homing receptor CD44 reveals at least 12 alternatively spliced exons. Proc Natl Acad Sci USA, 1992;89:12160-12164
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[2] Matsumura Y, Tarin D. Significance of CD44 gene products for cancer diagnosis and disease evaluation. Lancet, 1992;340:1053-1058
[3] Rudy W, Hofmann M, Lbiez RS, Zoller M, Heider KH, Ponta H. The two major CD44 proteins expressed on a metastatic rat tumour cell line are derived from different splice variants: each one individually siffices to confer metastatic behaviour. Cancer Res, 1993;53:1262-1268
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[5] 李连第，鲁凤珠，张思维，牧人，孙秀娣，皇甫小梅. 中国恶性肿瘤亡率20年变化趋势和近期预测分析. 中华肿瘤杂志1997；19：3-9
[6] Heider KH, Dammrich J, Skroch-Angel P, Muller-Hermelink HK, Vollmers HP, Herrlich P. Differential expression of CD44 splice variants in intestinal-and diffuse-type human gastric carcinomas and normal gastric mucosa. Cancer Res, 1993;53:4197-4203
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[8] Mirecka J, Mark D, Schauer A. Immunohistochemical localization of CD44 variants 5 and 6 in human gastric mucosa and gastric cancer. Anticancer Res, 1995;15:1459-1466
[9] Kerbel RS. Growth dominance of the metastatic cancer cell: cellular and molecular aspects. Adv Cancer Res, 1990;55:87-131
[10] Mayer B, Jauch KW, Gunthert U, Figdor CG, Schidberg FW, Funke I. De-novo expression of CD44 and survival in gastric cancer. Lancet, 1993;341:1019-1022
收稿日期 1998-07-07 修回日期 1998-11-22, http://www.100md.com
单位：中国医科大学肿瘤研究所第四研究室 辽宁省沈阳市 110001
关键词：胃肿瘤；肿瘤转移；腺癌；CD44v6基因；基因表达
世界化人消化杂志990309
中国图书资料分类号 R735.2
摘 要
目的 观察转移相关粘附分子拼接变异体CD44v6在人胃癌组织中的不同表达，探讨CD44v6与胃癌病理生物学行为之间的关系，评价CD44v6可否作为一个新的客观预测胃癌细胞转移潜能和胃癌患者预后的可靠生物学指标.
方法 采用鼠抗人CD44v6特异性mAb，对45例早期胃癌，22例中期胃癌和103例晚期胃癌手术切除标本之胃原发灶与转移灶进行了ABC免疫组化检测. 应用χ2检验和Log rank检验方法对结果做统计学分析.
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结果 CD44v6在晚期胃癌中的检出率为46.6%(48/103)，明显高于早期胃癌(26.7%，12/45)和中期胃癌(27.3%，6/22，P<0.01). 伴淋巴结转移和伴肝脏转移之胃癌CD44v6检出率分别为49%(50/102)和71.4%(5/7)，明显高于不伴转移的胃癌(18.6%，11/59，P<0.01). 肠型胃癌中CD44v6检出率为44.9%(48/107)，明显高于弥漫型胃癌(27.4%，17/62，P<0.05). 但是，CD44v6的表达与胃癌原发灶大小和组织学类型及分化程度未见明显相关. CD44v6阳性胃癌患者的术后生存期显著短于CD44v6阴性胃癌的患者(P=0.0002).
结论 CD44v6基因编码蛋白的表达与胃癌的临床病理生物学行为密切相关，特别是与胃癌细胞的转移潜能和胃癌患者的不良预后密切相关. CD44v6基因编码蛋白可作为一个新的准确预测胃癌细胞转移潜能并客观估计胃癌患者预后的生物学指标.
Relationship between CD44v6
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expression and prognosis in gastric
carcinoma patients*
XIN Yan, ZHAO Feng-Kai, ZHANG Su-Min, WU Dong-Ying, WANG Yan-Ping and XU Lei
Fourth Laboratory, Cancer Institute, China Medical University, Shenyang 110001, Liaoning Province, China
Subject headings stomach neoplasms; neoplasm metastasis; adenocarcinoma; CD44v6 gene; gene expression
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Abstract
AIM To investigate differential expressions of the human metastasis molecule adhesion CD44 splice variant 6 (CD44v6) in gastric carcinomas (GC), and to evaluate whether CD44v6 can be a useful marker in predicting metastatic potential of GC and prognosis of the patients with GC.
METHODS Forty-five cases of early gastric carcinoma(EGC), 103 advanced gastric carcinoma(AGC) and 22 intermediate gastric carcinoma(MGC)surgically resected specimens were studied immunohistochemically by using a mAb against CD44v6 (from R&D Systems). An antigen retrieval method followed by a routine ABC Process was employed.
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RESULTS In the gastric mucosa adjacent to tumour, weak and focal CD44v6 expression was detected within the foveolar proliferation zone but not on mucoid surface epithelium. There was also focally positive reaction in the intestinal metaplasia adjacent to GC. CD44v6 was detected in the membrane of cancer cells in 38.8% (66/170) of GC investigated. CD44v6 was detected in 26.7% (12/45) of EGC, 27.3% (6/22) of MGC, and 46.6% (48/103) of AGC. CD44v6 was detected in 48.2% (53/110) of GC with lymph node metastasis (Ln mets) , 71.4% (5/7) of GC with liver metastasis, while only in 18.6% (11/59) of GC without any metastasis (P<0.01). Furthermore, CD44v6 was detected in 47 out of 107 (43.9%) intestinal-type gastric carcinomas, compared with 17 out of 62 (27.4%)in diffuse-type tumours (P<0.05). The strongly positive reaction to mAb-CD44v6 was detected only in GC with Ln mets and liver mets but not in GC without mets (P<0.05). CD44v6 positive GC patients showed a significantly shorter survival period after surgical operation than those with CD44v6 negative GC patients (P=0.0002).
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CONCLUSION The expression of CD44v6 is correlated with progression and metastasis of GC, as well as with worse prognosis of patients with GC. CD44v6 is hopefully to be a useful marker of predicting the metastatic potential of GC and the prognosis of the patients with GC.
0 引言
CD44v6蛋白是位于人类第11号染色体短臂上的基因所编码的细胞表面粘附分子，主要参与细胞-细胞，细胞-基质之间的特异性粘连过程. CD44v6完整基因组在染色体DNA上大约跨越50Kb，有20个高度保守的外显子[1]. 在第5，6编码子间，至少有10个编码子(亦称变异编码子v1～v10)可随时发生拼接变异，指导合成一系列结构相似，分子大小相异且功能有别的拼接变异体CD44分子(以下简称CD44v). 研究发现，CD44v的表达可增加大鼠肿瘤的转移潜能. 人乳腺癌、结肠癌和甲状腺癌均表达多种CD44v，而上述器官的非肿瘤性正常组织则不表达[2]. 在多种伴有转移的肿瘤和临床上无任何转移迹象的肿瘤之间，CD44v的表达有显著差异[3，4]. 胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，在我国，胃癌多年来一直是死亡率最高的恶性肿瘤[5]. 胃癌患者死亡的主要原因是术后转移. 由于临床上尚无可靠的方法预测，故而使转移的早诊和有效防治显得力不从心. 因此，探究胃癌转移的分子机制，寻找与胃癌转移相关的生物标志多年来一直是胃癌基础与临床研究的主题之一. 我们观察CD44v6基因编码蛋白在胃癌组织中的表达及其与胃癌临床病理生物学行为之间的关系，评价CD44v6可否作为一个可靠预测胃癌转移潜能和胃癌患者预后的生物学指标.
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1 材料和方法
1.1 材料 中国医科大学肿瘤研究所胃癌术后标本170例，按全国胃癌协作组制定的有关胃癌大体分型，组织学分型和临床病理分期等规范进行严格的病理诊断. 临床病理分期：早期45例，中期22例，晚期胃癌103例. 转移情况：无转移59例，伴淋巴结转移102例，伴肝转移7例，伴卵巢转移2例. 170例胃癌患者中，155例进行了至少5a的术后随访.
1.2 方法 每例分别选择远癌“正常”胃粘膜(距癌灶>4cm)，癌旁胃粘膜(距癌灶<2cm)，胃原发癌灶，淋巴结转移灶及肝脏，卵巢转移癌灶组织的石蜡包埋之常规病理组织蜡块各一枚，制作4μm厚切片备免疫组化用. 每块组织均留1张连续切片做HE对照. 鼠抗人CD44v6 mAb购自R&D System， Europe. 该抗体可特异性识别人CD44v6基因编码蛋白，工作浓度1∶200. 生物素标记的兔抗鼠二抗为DAKO公司产品，工作浓度1∶200. 试剂盒购自Vector公司，工作浓度1∶100. 脱蜡后的切片置于10mol/L枸橼酸缓冲剂(pH 6.0)中，在75℃恒温箱中16h. 此抗原修复方法与微波炉及高压加热比，可明显提高CD44v6的检出率. 抗原修复后的切片进行常规ABC免疫组化染色，DAB呈色，苏木素复染. 定性标准：凡在细胞膜和细胞质见清晰褐色颗粒者为CD44v6阳性细胞. 半定量分级方法：根据阳性细胞在同类细胞中所占比例的多少将免疫组化染色结果分为4个等级. 阴性(-)：无阳性细胞或<5%的细胞呈阳性反应；弱阳性(+)：5%～24%的细胞呈阳性反应；中度阳性(++)：25%～50%的细胞呈阳性反应；强阳性反应(+++)：>50%的细胞呈阳性反应.
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统计学处理 采用χ2检验和Log rank检验方法分别对免疫组化结果和胃癌患者术后生存资料进行分析处理.
2 结果
本组远癌“正常”胃粘膜组织中未见CD44v6表达. 癌旁胃粘膜组织内见局灶性CD44v6表达，多为弱阳性(+)，少数为中度阳性(++). 阳性反应主要位于腺颈部增殖带区，或位于癌周再生粘膜的增殖旺盛区(图1). 胃粘膜表层粘液上皮细胞未见CD44v6的表达. 胃粘膜肠上皮化生区CD44v6的表达较非肠化生区强(图2). 本组170例胃癌标本中有66例检出CD44v6的特异表达，阳性率为38.8%. 胃癌细胞CD44v6阳性反应定位于癌细胞膜. CD44v6在晚期胃癌中的检出率(46.6%，48/103)明显高于早期胃癌(26.7%，12/45)和中期胃癌(27.3%，6/22，P<0.01). 伴淋巴结和肝脏转移之胃癌CD44v6检出率分别为49.0%(50/102)和71.4%(5/7)，明显高于不伴转移的胃癌(18.6%，11/59，P<0.01). 肠型胃癌中CD44v6检出率(44.9%，48/107)明显高于弥漫型胃癌(27.4%,17/62，P<0.05，表1～5和图3～8). 采用Log rank检验对155例胃癌患者术后生存期分析的结果表明，CD44v6阳性胃癌患者的生存期明显短于CD44v6阴性的患者(P=0.0002，图9).
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表1 CD44v6蛋白表达与胃癌临床病理分期的关系
(n,%) 临床病理分期
n
CD44v6蛋白表达
合计
+～+++
+
++
+++
早期胃癌
45
2(4.4)
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10(22.2)
0
26.7
中期胃癌
22
2(9.1)
4(18.2)
0
27.3
晚期胃癌
103
20(19.4)
12(11.7)
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16(15.5)
46.6a
合计
170
24(14.1)
26(15.3)
16(9.4)
38.8
aP<0.05，vs 早、中期.表2 CD44v6蛋白表达与胃癌转移的关系
(n,%) 转移情况
n
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CD44v6蛋白表达
合计
+～+++
+
++
+++
无转移
59
2(3.4)
8(13.6)
1(1.7)
18.6
淋巴结转移
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102
20(19.6)
17(16.7)
13(12.7)
49.0b
肝脏转移
7
2(28.6)
1(14.3)
2(28.6)
71.4a
卵巢转移
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2
0
0
0
aP<0.05，bP<0.01，vs 无转移.表3 CD44v6蛋白表达与Lauren分型的关系
(n,%) Lauren分型
n
CD44v6蛋白表达
合计
+～+++
+
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+++
肠型
107
17(15.9)
20(18.7)
11(10.3)
44.9a
弥漫型
62
7(11.3)
6(13.8)
4(6.5)
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27.4
aP<0.05，vs 弥漫型.
图1 癌旁粘膜. 腺颈部增殖区CD44v6弱阳性(+)，阳性颗粒位于胞质中 ×100
图2 癌旁肠化生粘膜. CD44v6中度阳性(++)，阳性颗粒位于肠化生细胞质内 ×200
图3 胃腺癌(肠型). 癌细胞膜上CD44v6中～强阳性 ×200
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图4 早期胃癌淋巴结转移. 癌细胞膜上CD44v6强阳性 ×200
图5 进展期胃癌淋巴结转移. 原发灶癌细胞膜上CD44v6强阳性 ×200
图6 淋巴结转移灶内. 癌细胞膜CD44v6强阳性 ×200
图7 胃腺癌(肠型)肝转移灶 HE×200
图8 肝脏转移灶癌细胞膜上CD44v6中度阳性 ×200
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图9 CD44v6表达与胃癌患者预后的关系.
表4 CD44v6蛋白表达与胃癌原发灶大小的关系
(n,%) 原发灶大小
n
CD44v6蛋白表达
合计
+～+++
+
++
+++
≤4cm
39
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3(7.7)
6(15.4)
0
23.1
>4cm
116
24(12.1)
16(13.8)
13(11.2)
37.1
表5 CD44v6蛋白表达与胃癌组织学类型和分化的关系
(n,%) 组织学类型/分化程度
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CD44v6蛋白表达+～+++
乳头状腺癌
9/24(37.5)
高分化管状腺癌
3/13(23.1)
中分化管状腺癌
12/30(40.0)
低分化腺癌
30/62(48.4)
未分化癌
4/15(26.7)
印戒细胞癌
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2/17(11.8)
粘液腺癌
5/8(62.5)
鳞状细胞癌
1/1(100.0)
合计
66/170(38.8)
3 讨论
细胞与细胞之间，细胞与细胞外间质之间粘附特性的异常是恶性肿瘤细胞最基本的生物学特征之一. 这种粘附特性的异常导致肿瘤细胞具有了从原发部位脱落并向周围正常组织侵袭的能力，而正是这种侵袭能力的大小决定了肿瘤恶性程度的高低. CD44是一个近年来倍受关注，在细胞恶性转化过程中其结构和功能均发生显著变化而影响转化后肿瘤细胞侵袭转移行为的典型的细胞表面粘附分子. CD44产物主要有两类，即标准型(CD44s)，也称血型(CD44H)，和变异型(CD44v). CD44s在生理状态下参与细胞的游走和运动. CD44v则主要出现在机体的病理过程，特别是肿瘤的发生发展过程中. CD44v的出现改变了肿瘤细胞表面粘附分子的构成和功能，使肿瘤细胞侵袭与转移的能力增强.
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正常胃粘膜是否表达CD44v目前仍不清楚. Heider et al[6]认为正常胃粘膜组织中有CD44v5/v6变异分子的表达. Harn et al[7]报告，在福尔马林固定，石蜡包埋的常规病理组织标本中，正常胃粘膜不表达CD44v3/v4,v5,v6,v7和v8-10. 最近，Mirecka et al[8]发现，利用微波抗原修复方法处理后，可在正常胃体腺的壁细胞中检出CD44v6的表达. 由于不同作者的研究报告基于不同处理的组织标本或采用不同的抗原修复方法，故难以将来自不同作者的结果直接进行比较. 与迄今其他相关报告不同，我们采用了一种非常简便有效的抗原修复方法，在降低背景非特异着色的基础上，提高了CD44v6的检出率，效果很好. 本结果表明，在远癌“正常”胃粘膜中未检出CD44v6，而在癌旁的非癌胃粘膜中，在腺颈部增殖区和再生粘膜的增生活跃区可见CD44v6呈弱阳性表达，但在表面粘液上皮细胞及胃体腺壁细胞中未见CD44v6表达. 在胃粘膜肠上皮化生区，可见CD44v6呈局灶性中度阳性表达，主要分布在肠化生粘膜隐窝部增殖区. 此结果与以往的报告相符[6]. CD44v6在远癌胃粘膜中不表达而在癌旁胃粘膜中和肠上皮化生中有一定程度表达这一现象，似乎提示：①CD44v6可能与胃粘膜上皮细胞的恶性转化有关；②胃癌细胞可以从胃粘膜和肠化生粘膜两种上皮细胞转化而来.
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胃癌的组织学类型以腺癌占大多数，可高达97%以上. Lauren根据胃癌组织学形态特征将其分为肠型胃癌和弥漫型胃癌两大类. 已发现肠型胃癌和弥漫型胃癌在病理生物学行为和流行病学特点等方面存在着显著差异. Heider曾报道，92.6%的肠型胃癌呈CD44v6阳性，而弥漫型胃癌仅有17.6%呈阳性[6]. Mirecka et al发现肠型和弥漫型胃癌CD44v6表达无统计学差异[7]. 我们发现，肠型胃癌CD44v6的表达率(44.8%)明显高于弥漫型胃癌(27.4%，P<0.05). 此结果提示：①CD44v6的表达与肠型胃癌发生发展的关系可能较与弥漫型胃癌更加密切；②肠型胃癌和弥漫型胃癌可能通过不同的基因调控途径发展而来. 关于肠化生和肠型胃癌之间的分子病理学联系尚需做进一步深入探讨.
Kerbel et al[9]报道，具有转移潜能的亚克隆瘤细胞在原发癌灶发生的早期即具有生长优势，这种生长优势是由于转移性亚克隆细胞群体可分泌某种特殊因子或对局部细胞生长因子具有特殊反应而呈现的选择性生长所决定的. 所以，检测原发肿瘤标本中某些肿瘤分子标志的水平有可能反应出整个肿瘤的一般转移特性. Mayer et al[10]报道，肿瘤的进展与CD44v6表达相关. Heider et al报道，当对原发癌灶和转移灶进行配对研究中发现，肿瘤的转移与CD44v6的表达相关，并因此推测在原发灶和淋巴结转移灶中均可检出CD44v6呈阳性的细胞克隆这一事实提示CD44v6在转移过程中起着重要作用. 在本组研究中，均匀一致的CD44v6强阳性表达仅存在于伴有淋巴结转移或伴肝脏转移的晚期胃癌病例，而早期和中期胃癌仅见CD44v6呈局灶性弱-中度阳性表达. 此外，85.7%(12/14)伴有淋巴结转移的胃癌，在其淋巴结转移灶中也可检出CD44v6的表达；3例伴肝脏转移的胃癌，于原发灶和转移灶中同时检出CD44v6的表达. 上述结果提示在早期胃癌原发灶中，CD44v6仅在转移性亚克隆细胞膜上表达，随着肿瘤的进展，表达CD44v6的亚克隆癌细胞因其与周围细胞和间质具有特殊的相互作用，即具有转移潜能而在生长中逐渐占居优势并发生转移. 据此，作者认为，CD44v6的检测在预测原发肿瘤的转移潜能方面具有较大实用价值. 本研究还发现，CD44v6阳性胃癌患者的术后生存期明显短于CD44v6阴性胃癌患者，提示CD44v6的表达与胃癌患者的预后密切相关，有望作为一个新的、可靠估计胃癌患者预后的病理生物学指标.
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作者简介：
辛彦，女，1956-09-26生，辽宁省沈阳市人，汉族. 1982年中国医科大学临床医学系毕业. 1987年中国医科大学硕士，1993年中国医科大学博士. 1994年和1996年两度赴英国和爱尔兰留学研修. 肿瘤病理学教授，博士生导师，享受国务院政府特殊津贴专家，第四研究室主任. 主要从事消化道肿瘤病理学研究，发表论文50篇，获辽宁省政府科技进步二等奖和国家教委科技进步三等奖. 1996年首批入选国家人事部百千万人才工程.
*国家自然科学基金资助，No.39370772.
通讯作者 辛彦教授，110001，中国医科大学肿瘤研究所第四研究室，辽宁省沈阳市和平区南京北街155号.
*Supported by the National Natural Science Foundation of China, Grant No.39370772.
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Correspondence to:Prof. XIN Yan, Fourth Laboratory, Cancer Institute, China Medical University, 155 Nanjing Beijie, Heping District, Shenyang 110001, Liaoning Province, China
Tel. +86.24.23863731 Ext. 6351, Fax. +86.24.23224417
4 参考文献
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[5] 李连第，鲁凤珠，张思维，牧人，孙秀娣，皇甫小梅. 中国恶性肿瘤亡率20年变化趋势和近期预测分析. 中华肿瘤杂志1997；19：3-9
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[9] Kerbel RS. Growth dominance of the metastatic cancer cell: cellular and molecular aspects. Adv Cancer Res, 1990;55:87-131
[10] Mayer B, Jauch KW, Gunthert U, Figdor CG, Schidberg FW, Funke I. De-novo expression of CD44 and survival in gastric cancer. Lancet, 1993;341:1019-1022
收稿日期 1998-07-07 修回日期 1998-11-22, http://www.100md.com