反相高效液相色谱法测定胸腺肽中胸腺素α1
作者：刘莉 刘艳娟 周云久
单位：哈尔滨白天鹅制药厂
关键词：反相高效液相色谱法；胸腺肽；胸腺素a 1
反相高效液相色谱法测定胸腺肽中胸腺素α1
提要 采用反相高效液相色谱法测定胸腺肽中胸腺素a 1，色谱柱为Nova-Pak C18柱，以乙腈-三氟乙酸-水(20:0.02:80)为流动相，检测波长206nm。测定组分与其它组分的色谱峰达到基线分离。加样回收率平均值为98.7%，RSD为1.2%。为控制胸腺肽质量提供了新的测定指标和可靠的方法。
胸腺肽是一种有多种生物活性的多肽类特质，其组分中胸腺素a 1与胸腺肽有相同的生物活性，对免疫功能和细胞分裂起到重要的作用，因此，胸腺肽制剂中是否含有胸腺素a 1，可以直接反映该制剂的免疫活性和临床有效性[1]。我们采用反相高效液相色谱法测定了注射用胸腺肽中胸腺素a 1组分，为胸腺肽制剂的质量控制提供了新的测定指标与方法[2][3]。
, 百拇医药
1 实验部分
1.1 仪器和试药
Waters高效液相色谱仪(510型泵、486型紫外检测器、746型积分仪)；胸腺素a 1对照品为美国赛生药品股分国际有限公司(Sciclone Phamaceuticals Inc.)生产的日达仙(ZADAXIN)，每支含1.6mg胸腺素a 1；乙腈为色谱纯(天津四友公司)；水为Milli-Q超纯水；三氟乙酸为分析纯；样品为本厂生产注射用胸腺肽。
1.2 高效液相色谱条件
色谱柱为Nova-Pak C18柱(150mm×3.9mm)，流动相为乙腈-三氟乙酸-水(20:0.02:80)，检测波长206nm，流速为1.2ml/分，检测灵敏度为0.01/AUFS，柱温为室温。
, 百拇医药
2 结果与讨论
2.1 色谱条件
基于普遍适用性考虑，选择C18键合硅胶柱。采用较常用的乙腈做为有机部分，加入适量三氟乙酸调节pH值，并利用其离子对作用有利于肽类的保留[2]。
2.2 目标峰确定
由于胸腺素a 1在制剂中含量低(0.6%～1%)，且易受制剂中其它多肽的影响而发生峰位偏移，不宜采用外标法确定[2～4]。我们采用梯度叠加法，确定胸腺素a 1峰，并证明胸腺素a 1的含量与色谱峰面积呈较好的线性关系。将5批注射用胸腺肽和日达仙分别配成浓度为2mg/ml和0.1mg/ml的溶液，分别将胸腺肽20，15，10，5，0m l及日达仙0，5，10，15，20m l依次混合后进样，测定HPLC图谱。样品中胸腺素a 1与其它组分的色谱峰达到基线分离，见图1。以日达仙进样量与胸腺素a 1峰面积做统计回归计算，得回归方法为：Y=808676 X-132674，r=0.9976，加样回收率平均值为98.7%(n=5)，RSD为1.2%。
, 百拇医药
图1 胸腺素a 1色谱图
a.对照品 b.注射用胸腺肽样品 1.胸腺素a 1 2.杂质
2.3 样品的测定
精密量取适宜浓度样品溶液10μl注入液相色谱仪中，测定其中胸腺素a 1色谱峰的峰面积，根据所得回归方程，分别计算5批样品中胸腺素a 1的百分含量，结果见表1。
表1 注射用胸腺肽中胸腺素a 1的含量 样品号
峰面积(×10-5)
含量(%)
均值(%)
, 百拇医药
RSD(%)
1
4.09948
0.67
2
4.17226
0.680
3
4.18843
0.682
0.67
1.2
4
, http://www.100md.com
4.13991
0.676
5
4.02670
0.662
3 结论
以上实验结果表明，应用反相高效液相色谱法测定胸腺肽中胸腺素a 1含量的方法快速、简便，测定结果重现性好，变异系数均小于5%，可用于胸腺肽制剂的质量控制。
参考文献
1.周如真主骗.胸腺激素的研究与质量检验技术.北京:中国医药科技出版社,1994,1～3
2.Thomas F, Gabriel, Johannes. Meienhofer and Joseph Michalewsky.Isolation of thymosin a 1 from thymosin fraction 5 by high performance liquid chromatography. Journal of liquid chromatography,1983,6(4);647～654
, 百拇医药
3.Manhaz badamchian, M.Patricia strickler, M.Jude stone. Rapid micro isolation of thymosin a 1 from thymosin fraction 5 by reversedphased high performance liquid chromatography. Journal of liquid chromatography 1989,12(5);845～860
4.Francisco J.Franco, Cristina Diaz, et al. Thymosin a 1 is a nativepeptide in several tissues. Biochemica et biophysica Acta, 1992,1120;43～48
(1998-09-28收稿), 百拇医药
单位：哈尔滨白天鹅制药厂
关键词：反相高效液相色谱法；胸腺肽；胸腺素a 1
反相高效液相色谱法测定胸腺肽中胸腺素α1
提要 采用反相高效液相色谱法测定胸腺肽中胸腺素a 1，色谱柱为Nova-Pak C18柱，以乙腈-三氟乙酸-水(20:0.02:80)为流动相，检测波长206nm。测定组分与其它组分的色谱峰达到基线分离。加样回收率平均值为98.7%，RSD为1.2%。为控制胸腺肽质量提供了新的测定指标和可靠的方法。
胸腺肽是一种有多种生物活性的多肽类特质，其组分中胸腺素a 1与胸腺肽有相同的生物活性，对免疫功能和细胞分裂起到重要的作用，因此，胸腺肽制剂中是否含有胸腺素a 1，可以直接反映该制剂的免疫活性和临床有效性[1]。我们采用反相高效液相色谱法测定了注射用胸腺肽中胸腺素a 1组分，为胸腺肽制剂的质量控制提供了新的测定指标与方法[2][3]。
, 百拇医药
1 实验部分
1.1 仪器和试药
Waters高效液相色谱仪(510型泵、486型紫外检测器、746型积分仪)；胸腺素a 1对照品为美国赛生药品股分国际有限公司(Sciclone Phamaceuticals Inc.)生产的日达仙(ZADAXIN)，每支含1.6mg胸腺素a 1；乙腈为色谱纯(天津四友公司)；水为Milli-Q超纯水；三氟乙酸为分析纯；样品为本厂生产注射用胸腺肽。
1.2 高效液相色谱条件
色谱柱为Nova-Pak C18柱(150mm×3.9mm)，流动相为乙腈-三氟乙酸-水(20:0.02:80)，检测波长206nm，流速为1.2ml/分，检测灵敏度为0.01/AUFS，柱温为室温。
, 百拇医药
2 结果与讨论
2.1 色谱条件
基于普遍适用性考虑，选择C18键合硅胶柱。采用较常用的乙腈做为有机部分，加入适量三氟乙酸调节pH值，并利用其离子对作用有利于肽类的保留[2]。
2.2 目标峰确定
由于胸腺素a 1在制剂中含量低(0.6%～1%)，且易受制剂中其它多肽的影响而发生峰位偏移，不宜采用外标法确定[2～4]。我们采用梯度叠加法，确定胸腺素a 1峰，并证明胸腺素a 1的含量与色谱峰面积呈较好的线性关系。将5批注射用胸腺肽和日达仙分别配成浓度为2mg/ml和0.1mg/ml的溶液，分别将胸腺肽20，15，10，5，0m l及日达仙0，5，10，15，20m l依次混合后进样，测定HPLC图谱。样品中胸腺素a 1与其它组分的色谱峰达到基线分离，见图1。以日达仙进样量与胸腺素a 1峰面积做统计回归计算，得回归方法为：Y=808676 X-132674，r=0.9976，加样回收率平均值为98.7%(n=5)，RSD为1.2%。
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图1 胸腺素a 1色谱图
a.对照品 b.注射用胸腺肽样品 1.胸腺素a 1 2.杂质
2.3 样品的测定
精密量取适宜浓度样品溶液10μl注入液相色谱仪中，测定其中胸腺素a 1色谱峰的峰面积，根据所得回归方程，分别计算5批样品中胸腺素a 1的百分含量，结果见表1。
表1 注射用胸腺肽中胸腺素a 1的含量 样品号
峰面积(×10-5)
含量(%)
均值(%)
, 百拇医药
RSD(%)
1
4.09948
0.67
2
4.17226
0.680
3
4.18843
0.682
0.67
1.2
4
, http://www.100md.com
4.13991
0.676
5
4.02670
0.662
3 结论
以上实验结果表明，应用反相高效液相色谱法测定胸腺肽中胸腺素a 1含量的方法快速、简便，测定结果重现性好，变异系数均小于5%，可用于胸腺肽制剂的质量控制。
参考文献
1.周如真主骗.胸腺激素的研究与质量检验技术.北京:中国医药科技出版社,1994,1～3
2.Thomas F, Gabriel, Johannes. Meienhofer and Joseph Michalewsky.Isolation of thymosin a 1 from thymosin fraction 5 by high performance liquid chromatography. Journal of liquid chromatography,1983,6(4);647～654
, 百拇医药
3.Manhaz badamchian, M.Patricia strickler, M.Jude stone. Rapid micro isolation of thymosin a 1 from thymosin fraction 5 by reversedphased high performance liquid chromatography. Journal of liquid chromatography 1989,12(5);845～860
4.Francisco J.Franco, Cristina Diaz, et al. Thymosin a 1 is a nativepeptide in several tissues. Biochemica et biophysica Acta, 1992,1120;43～48
(1998-09-28收稿), 百拇医药