柯萨奇病毒B组3型中国分离株VP1基因真核表达系统的克隆
作者：田 野 钟照华 赵铁强 黄建林 安 毅 唐 伟 沈景霞 钟学宽 孟繁超 黄永麟 鲁凤民 叶鸿瑁
单位：田野 赵铁强 安毅 沈景霞 孟繁超 黄永麟(哈尔滨医科大学第一临床医学院心内科，150001)；钟照华 黄建林 钟学宽(哈尔滨医科大学基础医学院，150086)；唐伟(哈尔滨工业大学，150001)；鲁凤民 叶鸿瑁(北京医科大学第三临床医学院，100083)
关键词：柯萨奇病毒B组3型；VP1基因；真核表达系统
中国地方病学杂志990304 【摘要】 目的 探讨构建柯萨奇病毒B组3型(CVB3)基因疫苗的可行性。方法 应用逆转录PCR技术扩增CVB3中国分离株VP1基因，通过TA克隆法构建pCR2.1-CVB3VP1,将CVB3VP1亚克隆至真核表达载体pCEP4,构建真核表达系统pCEP4-CVB3VP1,并进行酶切和测序鉴定。结果 发现CVB3的中国分离株与Nancy株的VP1基因基本一致，均编码293个氨基酸，其中有59处核苷酸存在变异,但仅改变了10处氨基酸编码，证实克隆的片段为CVB3VP1基因，表达载体为pCEP4。结论 实验成功地构建了CVB3中国分离株的真核表达系统pCEP4-CVB3VP1,为CVB3基因疫苗的研究奠定了基础。
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分类号：R373.23 文献标识码：A 论文编号：1000-4955(1999)03-0169-72
Clone of eukaryotic expression system for VP1 gene of Coxsackieviru s group B type 3 Chinese strain
TIAN Ye,ZHONG Zhaohua,ZHAO Tieqiang,et al.
Department of Cardiology,First Clinical Medical College of Harbin Me dical University,Harbin 150001
【Abstract】 Objective To construct the gene vaccine of Coxsackievirus group B type 3(CVB3).Methods The VP1 gene of CVB3 Chinese strain was amplifi ed by means of reverse transcript polymerase chain reaction (RT-PCR) and pCR2.1- CVB3VP1 was constructed by TA cloning strategy.The newly eukaryotic expression s ystem pCEP4-CVB3VP1 was constructed by subcloning,and confirmed by restrict anal ysis and sequencing.Results The VP1 gene of CVB3 Chinese strain has 59 base s differences from that of CVB3 Nancy strain,some of them cause only 10 amino acid changes and others are nonsense mutations.Conclusions Our results may be useful for research of C VB3 immunological characteristics.
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【Key words】 Coxsackievirus group B type3 VP1 gene Eukaryotic expression system
柯萨奇病毒B组(CVB)有6个血清型(CVB1～6)，是引起人类病毒性心肌炎、无菌性脑炎和新生儿全身性感染等疾病的主要病原，近年来的发病呈上升趋势，目前尚缺乏有效防治手段，基因疫苗(Gene vaccine)为病毒感染的防治开辟了新的途径[1]。本研究拟克隆编码CVB3中国分离株主要中和抗原的VP1基因[2]，构建其真核表达系统，为CVB基因疫苗的研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料 CVB3毒株为中国分离株，由哈尔滨医科大学微生物学教研室保存，病毒在Vero细胞传代，TCID50为10-8。TA克隆载体pCR2.1和真核表达载体pCEP4均为Invitrogen产品，宿主菌株为JM109。质粒提纯试剂为Promega公司的WizardM inipreps Plasmid Purification Kit。
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1.2 CVB3 VP1的扩增 按文献方法进行[3]。自行设计PCR引物，上游5′-AGG AAT TCA TGG AAG ACG CGA TAA C-3′，下游为5′-TGT CTA GAT GCGT TTG CCT AGT AGT G-3′。PCR循环：94℃30sec、60℃45sec、72℃1min,共35个循环，最后一次延伸7min。取10μl扩增产物上1%琼脂糖凝胶电泳。
1.3 pCR2.1-CVB3VP1的构建 电泳后回收0.83kb片段，取约0.1μg/μl VP1 DNA0.3μg与0.05μg线状pCR2.1在T4DNA连接酶作用下4℃反应16h。转化JM105，接种至含氨苄青霉素的SOB平板，37℃培养18～24小时。
1.4 pCR2.1-CVB3VP1的筛选和鉴定 从转化菌平板中任选20个菌落，接种于5ml含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃摇振培养6h，取1ml菌粗提质粒，电泳检查重组子的大小。培养经初步筛选的细菌，取1.5ml细胞提取质粒，参照Ausubel[3]等的方法略加修改。将提取的pCR2.1—CVB3VP1用XbaI和XbaI+EcoRI消化，电泳观察质粒的酶位点并判定片段插入方向。
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1.5 pCEP4-CVB3VP1的构建 将pCEP4-CVB3VP1和pCEP4分别用BamHI和XhoI酶切消化，获得两个互补粘端，取pCEP4-CVB3VP1/BamHI+XhoI3μl和pCEP4/BamHI+XhoI2μl加至0.5ml微量离心管中，参照文献Ausubel等[3]的方法进行连接反应和转化实验。
1.6 pCEP4-CVB3VP1的筛选和鉴定 粗提转化菌落，电泳观察重组质粒大小，选择可能转化的菌落提纯质粒。经EcoRI、XbaI等酶切，判断重组子酶切位点和目的基因插入方向。
1.7 DNA序列测定 小量提纯pCR2.1-CVB3VP1和pCEP4-CVB3VP1，两次酚：氯仿抽提，使A260/A280介于1.8至1.9间，将浓度调整至0.2μg/μl，测序委托美国CyberSyn公司进行。pCR2.1-CVB3VP1的测序引物选用M13forward primer(20)和M13 reverse primer,pCEP4的测序引物为5′-ACC TCC CCC TGA ACC TGA AA-3′,pCEP4-CVB3VP1测序目的是验证插入片段的序列和方向正确与否，因此只测一侧序列。
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2 结果
2.1 CVB3 VP1的扩增、克隆 VP1基因PCR扩增产物电泳结果见图1。在0.83kb处可见一条明亮的核酸区带，与理论预期值一致。
图1 CVB3VP1基因扩增结果
A：λDNA/HindⅢ
B：CVB3VP1(0.83kb)
2.2 pCR2.1-CVB3VP1的构建与鉴定 CVB3VP1片段与pCR2.1连接产物转化JM105后获得约300个菌落，JM105菌平板和线状pCR2.1转化平板均无细菌生长。结果表明pCR2.1-CVB3VP1转化子带有重组质粒。电泳检查发现重组质粒大小均在4.7kb左右。提纯质粒，pCR2.1-CVB3VP1用XbaI消化获得3.9kb和0.83kb两个片段，初步说明该质粒确为目的克隆。经XbaI+EcoRI酶消化后获得3.9kb、0.5kb、0.3kb三个片段，说明VP1插入方向为反向(见图2，3)。
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图2 pCR2.1-CVB3VP1经XbaI酶切后电泳图谱
A:ΦX174/HaeⅢ；
B：λDNA/EcoRI+HindⅢ；
C：pCR2.1-CVB3VP1/XbaI
图3 pCR2.1-CVB3VP1经EcoRI和XbaI酶切后电泳图谱
A:λDNA/EcoRI+HindⅢ；
B：ΦX174/HaeⅢ；
C：pCR2.1-CVB3VP1/EcoRI+XbaI
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2.3 pCEP4-CVB3VP1的构建与鉴定 pCEP4-CVB3VP1转化JM109经过夜培养后可见约150个菌落，而pCEP4未切质料转化JM109平板长满菌落，pCEP4/BamHI+XhoI转化和JM109感受态菌对照均无菌落，说明转化结果良好。粗提质粒，电泳观察重组质粒大小约11kb，与理论预期值一致。进一步提纯质粒，经EcoRI酶消化可切成4.88kb、2.48kb、2.48kb、0.60kb、0.39kb、0.30kb六个片段。经XbaI消化可切成10.0kb、0.83kb、0.46kb三个片段。初步证明重组质粒为携带CVB3VP1片段的pCEP4，且插入方向正确(见图4)。
图4 pCEP4-CVB3VP1用EcoRI,XbaI酶切结果
A：λDNA/EcoRI+HindⅢ；
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B：pCEP4-CVB3VP1/EcoRI；
C：pCEP4-CVB3VP1/XbaI；
D：pCR2.1-CVB3VP1/XbaI；
E:pCEP4未切质粒
2.4 DNA序列测定 测序结果经PlasmidPrimier2.02软件分析。pCR2.1-CVB3VP1测序结果显示克隆的基因确为VP1基因，CVB3中国分离株VP1与CVB3Nancy株VP1之间存在59处核苷酸变异,大多数都发生在三联密码的第三个碱基，未影响到氨基酸的编码，只有10处氨基酸编码发生了变异。pCEP4-CVB3VP1测序目的是验证插入片段的序列和方向，因此只测一侧序列。结果证明CVB3VP1以正确的方向克隆在pCEP4上。
3 讨论
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本研究所用的CVB3VP1引物是根据Klump等[4]报道的CVB3Nancy株基因序列设计的，经实验证明该引物具有很好的特异性。TaqDNA聚合酶在扩增结束时一般在末端加A，利用这个特性，将扩增片段克隆到pCR2.1载体的TA克隆位点上。
序列资料显示的CVB3中国株VP1基因与Klump等[4]报道的CVB3Nancy株VP1基因基本一致，均编码293个氨基酸，但二者间存在变异,比较二者发现有59个碱基不一致，其中10处发生了氨基酸编码的改变。不同作者报道的CVB3基因组核苷酸全序列均存在差异[2，4，5]，原因可能是病毒RNA的扩增差异、测序错误、遗传漂变。在我国曾有克隆和原核表达CVB3VP1基因的报道[6]，采用的是CVB3Nancy株。本研究所用的CVB3毒株是中国分离株，迄今国内外尚未见其基因组序列报道。
将CVB3VP1亚克隆至真核表达载体pCEP4上，通过酶切分析和测序证明VP1基因以正确的方向克隆在pCPE4上，这就为该基因在体外和体内的表达提供了条件，至于其能否诱导机体免疫应答及免疫保护作用还需进一步实验验证。本研究构建的真核表达系统可作为候选的CVB3基因疫苗。
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基金来源：国家自然科学基金(39570744)；黑龙江省自然科学基金(D-9602)
作者简介：田野，男，1966年生，讲师，博士
4 参考文献
[1]Tang DC,Devit M and Johnston SA.Genetic immunization is a simp le method for eliciting an immune response[J].Nature,1992;356:152～154
[2]Tracy S,Lium HL and Chapman NM.Coxsackievirus B3:Primary struc ture of the 5' noncoding and capsid protein-coding regions of the genome[J]. Virus Res,1985,3:263～270
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[3]Ausubel FM,Brent R,Kingston RE,et al.Short protocols in molecu lar biology[J].Third edition,John Wiley & Sons,Inc,1995
[4]Klump WM,Bergmann I,Muller BC,et al.Complete nucleotide sequen ce of infectious Coxsackievirus B3 cDNA:two initial 5' uridine residue are regai ned during plus-strand RNA synthesis[J].J Virol,1990,64(4):1573～1583
[5]Lindberg AM,Stalhandske POK and Pettersson U.Genome of Coxsack ievirus B3[J].Virology,1987,156:50～63
[6]刘哲伟，冯燕玲，张霆，等.柯萨奇B3病毒VP1基因在大肠杆菌中的表达[J].病毒学报，1996，12(1)：35～41
*收稿日期：1998-12-15, 百拇医药
单位：田野 赵铁强 安毅 沈景霞 孟繁超 黄永麟(哈尔滨医科大学第一临床医学院心内科，150001)；钟照华 黄建林 钟学宽(哈尔滨医科大学基础医学院，150086)；唐伟(哈尔滨工业大学，150001)；鲁凤民 叶鸿瑁(北京医科大学第三临床医学院，100083)
关键词：柯萨奇病毒B组3型；VP1基因；真核表达系统
中国地方病学杂志990304 【摘要】 目的 探讨构建柯萨奇病毒B组3型(CVB3)基因疫苗的可行性。方法 应用逆转录PCR技术扩增CVB3中国分离株VP1基因，通过TA克隆法构建pCR2.1-CVB3VP1,将CVB3VP1亚克隆至真核表达载体pCEP4,构建真核表达系统pCEP4-CVB3VP1,并进行酶切和测序鉴定。结果 发现CVB3的中国分离株与Nancy株的VP1基因基本一致，均编码293个氨基酸，其中有59处核苷酸存在变异,但仅改变了10处氨基酸编码，证实克隆的片段为CVB3VP1基因，表达载体为pCEP4。结论 实验成功地构建了CVB3中国分离株的真核表达系统pCEP4-CVB3VP1,为CVB3基因疫苗的研究奠定了基础。
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分类号：R373.23 文献标识码：A 论文编号：1000-4955(1999)03-0169-72
Clone of eukaryotic expression system for VP1 gene of Coxsackieviru s group B type 3 Chinese strain
TIAN Ye,ZHONG Zhaohua,ZHAO Tieqiang,et al.
Department of Cardiology,First Clinical Medical College of Harbin Me dical University,Harbin 150001
【Abstract】 Objective To construct the gene vaccine of Coxsackievirus group B type 3(CVB3).Methods The VP1 gene of CVB3 Chinese strain was amplifi ed by means of reverse transcript polymerase chain reaction (RT-PCR) and pCR2.1- CVB3VP1 was constructed by TA cloning strategy.The newly eukaryotic expression s ystem pCEP4-CVB3VP1 was constructed by subcloning,and confirmed by restrict anal ysis and sequencing.Results The VP1 gene of CVB3 Chinese strain has 59 base s differences from that of CVB3 Nancy strain,some of them cause only 10 amino acid changes and others are nonsense mutations.Conclusions Our results may be useful for research of C VB3 immunological characteristics.
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【Key words】 Coxsackievirus group B type3 VP1 gene Eukaryotic expression system
柯萨奇病毒B组(CVB)有6个血清型(CVB1～6)，是引起人类病毒性心肌炎、无菌性脑炎和新生儿全身性感染等疾病的主要病原，近年来的发病呈上升趋势，目前尚缺乏有效防治手段，基因疫苗(Gene vaccine)为病毒感染的防治开辟了新的途径[1]。本研究拟克隆编码CVB3中国分离株主要中和抗原的VP1基因[2]，构建其真核表达系统，为CVB基因疫苗的研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料 CVB3毒株为中国分离株，由哈尔滨医科大学微生物学教研室保存，病毒在Vero细胞传代，TCID50为10-8。TA克隆载体pCR2.1和真核表达载体pCEP4均为Invitrogen产品，宿主菌株为JM109。质粒提纯试剂为Promega公司的WizardM inipreps Plasmid Purification Kit。
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1.2 CVB3 VP1的扩增 按文献方法进行[3]。自行设计PCR引物，上游5′-AGG AAT TCA TGG AAG ACG CGA TAA C-3′，下游为5′-TGT CTA GAT GCGT TTG CCT AGT AGT G-3′。PCR循环：94℃30sec、60℃45sec、72℃1min,共35个循环，最后一次延伸7min。取10μl扩增产物上1%琼脂糖凝胶电泳。
1.3 pCR2.1-CVB3VP1的构建 电泳后回收0.83kb片段，取约0.1μg/μl VP1 DNA0.3μg与0.05μg线状pCR2.1在T4DNA连接酶作用下4℃反应16h。转化JM105，接种至含氨苄青霉素的SOB平板，37℃培养18～24小时。
1.4 pCR2.1-CVB3VP1的筛选和鉴定 从转化菌平板中任选20个菌落，接种于5ml含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃摇振培养6h，取1ml菌粗提质粒，电泳检查重组子的大小。培养经初步筛选的细菌，取1.5ml细胞提取质粒，参照Ausubel[3]等的方法略加修改。将提取的pCR2.1—CVB3VP1用XbaI和XbaI+EcoRI消化，电泳观察质粒的酶位点并判定片段插入方向。
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1.5 pCEP4-CVB3VP1的构建 将pCEP4-CVB3VP1和pCEP4分别用BamHI和XhoI酶切消化，获得两个互补粘端，取pCEP4-CVB3VP1/BamHI+XhoI3μl和pCEP4/BamHI+XhoI2μl加至0.5ml微量离心管中，参照文献Ausubel等[3]的方法进行连接反应和转化实验。
1.6 pCEP4-CVB3VP1的筛选和鉴定 粗提转化菌落，电泳观察重组质粒大小，选择可能转化的菌落提纯质粒。经EcoRI、XbaI等酶切，判断重组子酶切位点和目的基因插入方向。
1.7 DNA序列测定 小量提纯pCR2.1-CVB3VP1和pCEP4-CVB3VP1，两次酚：氯仿抽提，使A260/A280介于1.8至1.9间，将浓度调整至0.2μg/μl，测序委托美国CyberSyn公司进行。pCR2.1-CVB3VP1的测序引物选用M13forward primer(20)和M13 reverse primer,pCEP4的测序引物为5′-ACC TCC CCC TGA ACC TGA AA-3′,pCEP4-CVB3VP1测序目的是验证插入片段的序列和方向正确与否，因此只测一侧序列。
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2 结果
2.1 CVB3 VP1的扩增、克隆 VP1基因PCR扩增产物电泳结果见图1。在0.83kb处可见一条明亮的核酸区带，与理论预期值一致。
图1 CVB3VP1基因扩增结果
A：λDNA/HindⅢ
B：CVB3VP1(0.83kb)
2.2 pCR2.1-CVB3VP1的构建与鉴定 CVB3VP1片段与pCR2.1连接产物转化JM105后获得约300个菌落，JM105菌平板和线状pCR2.1转化平板均无细菌生长。结果表明pCR2.1-CVB3VP1转化子带有重组质粒。电泳检查发现重组质粒大小均在4.7kb左右。提纯质粒，pCR2.1-CVB3VP1用XbaI消化获得3.9kb和0.83kb两个片段，初步说明该质粒确为目的克隆。经XbaI+EcoRI酶消化后获得3.9kb、0.5kb、0.3kb三个片段，说明VP1插入方向为反向(见图2，3)。
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图2 pCR2.1-CVB3VP1经XbaI酶切后电泳图谱
A:ΦX174/HaeⅢ；
B：λDNA/EcoRI+HindⅢ；
C：pCR2.1-CVB3VP1/XbaI
图3 pCR2.1-CVB3VP1经EcoRI和XbaI酶切后电泳图谱
A:λDNA/EcoRI+HindⅢ；
B：ΦX174/HaeⅢ；
C：pCR2.1-CVB3VP1/EcoRI+XbaI
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2.3 pCEP4-CVB3VP1的构建与鉴定 pCEP4-CVB3VP1转化JM109经过夜培养后可见约150个菌落，而pCEP4未切质料转化JM109平板长满菌落，pCEP4/BamHI+XhoI转化和JM109感受态菌对照均无菌落，说明转化结果良好。粗提质粒，电泳观察重组质粒大小约11kb，与理论预期值一致。进一步提纯质粒，经EcoRI酶消化可切成4.88kb、2.48kb、2.48kb、0.60kb、0.39kb、0.30kb六个片段。经XbaI消化可切成10.0kb、0.83kb、0.46kb三个片段。初步证明重组质粒为携带CVB3VP1片段的pCEP4，且插入方向正确(见图4)。
图4 pCEP4-CVB3VP1用EcoRI,XbaI酶切结果
A：λDNA/EcoRI+HindⅢ；
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B：pCEP4-CVB3VP1/EcoRI；
C：pCEP4-CVB3VP1/XbaI；
D：pCR2.1-CVB3VP1/XbaI；
E:pCEP4未切质粒
2.4 DNA序列测定 测序结果经PlasmidPrimier2.02软件分析。pCR2.1-CVB3VP1测序结果显示克隆的基因确为VP1基因，CVB3中国分离株VP1与CVB3Nancy株VP1之间存在59处核苷酸变异,大多数都发生在三联密码的第三个碱基，未影响到氨基酸的编码，只有10处氨基酸编码发生了变异。pCEP4-CVB3VP1测序目的是验证插入片段的序列和方向，因此只测一侧序列。结果证明CVB3VP1以正确的方向克隆在pCEP4上。
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本研究所用的CVB3VP1引物是根据Klump等[4]报道的CVB3Nancy株基因序列设计的，经实验证明该引物具有很好的特异性。TaqDNA聚合酶在扩增结束时一般在末端加A，利用这个特性，将扩增片段克隆到pCR2.1载体的TA克隆位点上。
序列资料显示的CVB3中国株VP1基因与Klump等[4]报道的CVB3Nancy株VP1基因基本一致，均编码293个氨基酸，但二者间存在变异,比较二者发现有59个碱基不一致，其中10处发生了氨基酸编码的改变。不同作者报道的CVB3基因组核苷酸全序列均存在差异[2，4，5]，原因可能是病毒RNA的扩增差异、测序错误、遗传漂变。在我国曾有克隆和原核表达CVB3VP1基因的报道[6]，采用的是CVB3Nancy株。本研究所用的CVB3毒株是中国分离株，迄今国内外尚未见其基因组序列报道。
将CVB3VP1亚克隆至真核表达载体pCEP4上，通过酶切分析和测序证明VP1基因以正确的方向克隆在pCPE4上，这就为该基因在体外和体内的表达提供了条件，至于其能否诱导机体免疫应答及免疫保护作用还需进一步实验验证。本研究构建的真核表达系统可作为候选的CVB3基因疫苗。
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基金来源：国家自然科学基金(39570744)；黑龙江省自然科学基金(D-9602)
作者简介：田野，男，1966年生，讲师，博士
4 参考文献
[1]Tang DC,Devit M and Johnston SA.Genetic immunization is a simp le method for eliciting an immune response[J].Nature,1992;356:152～154
[2]Tracy S,Lium HL and Chapman NM.Coxsackievirus B3:Primary struc ture of the 5' noncoding and capsid protein-coding regions of the genome[J]. Virus Res,1985,3:263～270
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[3]Ausubel FM,Brent R,Kingston RE,et al.Short protocols in molecu lar biology[J].Third edition,John Wiley & Sons,Inc,1995
[4]Klump WM,Bergmann I,Muller BC,et al.Complete nucleotide sequen ce of infectious Coxsackievirus B3 cDNA:two initial 5' uridine residue are regai ned during plus-strand RNA synthesis[J].J Virol,1990,64(4):1573～1583
[5]Lindberg AM,Stalhandske POK and Pettersson U.Genome of Coxsack ievirus B3[J].Virology,1987,156:50～63
[6]刘哲伟，冯燕玲，张霆，等.柯萨奇B3病毒VP1基因在大肠杆菌中的表达[J].病毒学报，1996，12(1)：35～41
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