未知人Na(+)-K(+)-Exchanging ATPase α1亚基基因第一内含子的获得及鉴定△

http://www.100md.com 《中国医学科学院学报》 1999年第3期

     作者：杨靖轩 张金三 卢圣栋

    单位：中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005

    关键词：Na(+)-K(+)-Exchanging；ATPase；α1；亚单位；聚合酶链反应；内含子；剪接；转录

    中国医学科学院学报990301 摘要 目的 研究人Na(+)-K(+)-Exchanging ATPase α1 亚单位基因胞外区约80～130位氨基酸编码序列的未知基因组结构。方法 采用聚合酶链反应(PCR)方法对人基因组DNA及cDNA文库进行扩增，限制性酶切分析扩增产物，并进行荧光测序，对测序结果进行同源性分析及剪接位点的搜索并对得到的核苷酸序列进行分析。结果 人基因组DNA和cDNA经扩增后分别得到833和195 bp两种不同大小的片段Fg，Fc。分析序列发现Fg与Fc相比在138～775 bp处含有一638 bp的插入片段，此片段与GenBank中的任何已知序列均无明显同源性。结论 本研究发现了一段全新未知的人Na(+)-K(+)-Exchanging ATPase α1 亚单位基因的内含子全序列，并得到了第一外显子同第二外显子之间的相对位置和序列，其在GenBank的基因检索号为L76938。序列分析表明该内含子可能具有潜在的调控基因表达的功能，并含有一个可能的编码序列。

    中图号 Q75 R394

    Acquirement and Identification of a Novel Intron 1 of Human Na(+)-K(+)-Exchanging ATPase α1 Subunit Gene

    Yang Jingxuan Zhang Jinsan Lu Shengdong

    (National Laboratory of Medical Molecular Biology,Institute of Basic Medical Sciences,CAMS and PUMC,Beijing 100005)

    Objective The unknown part genome structure of the α1 subunit of human Na(+)-K(+)-Exchanging ATPase gene which covers the 80～130 aa in its extracellular domain was studied.Methods By means of PCR，the targeted sequences was amplified by using two different templates：human Genome DNA and the muscle cDNA library; the PCR products were analyzed by restriction endonuclease digestion，then cloned into plasmid vector to perform the chemiluminescence Sequencing.The homologous search，splicing site detection and the analysis of the sequence were applied.Results Two different lengths of products，833 bp(Fg) and 195 bp(Fc) were acquired after PCR amplification with the human genome DNA and muscle cDNA library respectively.There was an insertion of a 638 bp fragment in Fg at its 138～775 bp.And there was not obviously known sequence homologous to the insertion sequence.Conclusions A novel sequence containing the complete human Na(+)-K(+)-Exchanging ATPase α1 subunit gene intron 1 was found，the exact splicing donor and receptor site within it were identified.The Accession No of this sequence is L76938.Analysis of this sequence showed that the intron 1 may function in the regulation of the gene expression and also had a potential coding sequence.

    Key words Na(+)-K(+)-Exchanging ATPase α1 subunit; polymerase chain reaction; intron; splice; transcription

    Na(+)-K(+)-Exchanging ATPase是一种普遍存在于高等生物体内的细胞膜蛋白，主要参与介导K⁺和Na⁺在细胞内外之间的逆浓度梯度的转运，并维持一定细胞内外的离子梯度，使胞内为高K⁺低Na⁺而胞外为高Na⁺低K^+[1,2]。Na(+)-K(+)-Exchanging ATPase是一种异源二聚体，其α亚基催化ATP水解并参与介导离子的转移，β亚基主要作用是将α亚基从内质网转运至细胞膜表面^[3]。目前已知至少有3种α亚基基因位于3条不同的染色体上^[4]。其中α1主要表达于肾脏中，氨基酸序列比较保守。其转录表达受到甲状腺素和儿茶酚胺等的调控，膜外区有乌本苷结合位点，生物活性可受到强心苷等药物的调控。近年来的研究表明，绵羊Na(+)-K(+)-Exchanging ATPase α亚基的膜外区及跨膜区上某些单个氨基酸的替换可改变其对乌本苷的敏感性^[5，6]。此外，在乌本苷抗性的人细胞株H1C1中也发现某些细胞中的Na(+)-K(+)-Exchanging ATPase α1 亚基cDNA多肽编码区的332位有一个G→A的突变，导致氨基酸水平上的突变C108Y，已证明其的确可以影响HeLa细胞对地高辛类药物的敏感性^[7]，此位点也位于胞外区。提示胞外区域对于调节Na(+)-K(+)-Exchanging ATPase的生物活性具有重要作用。但目前对人ATPase α1亚单位基因的研究大都仅限于cDNA水平上，在基因组水平上的研究甚少，只是将其定位于1号染色体的1p21——cen区域之间。本实验主要目的是对此基因区域的基因组结构进行分析研究。

    1 材料和方法

    实验材料 人基因组DNA样品，取自正常志愿者外周血，分离淋巴细胞后按标准方法提取基因组DNA。cDNA文库，为正常人肌肉组织cDNA Lamda噬菌体文库。扩增所用引物根据下列序列由Cybersyn公司合成，经RPC反向柱层析纯化所得。具体序列根据GenBank中已公布的人Na(+)-K(+)-Exchanging ATPase alpha subunit mRNA序列设计并经引物设计软件O1igo 5.0进一步检验确证而确定。其顺序分别为：

    上游引物 5′ CCA CTA CTC CTG AAT GGA T 3′ 1#

    下游引物 5′ ACT GGT TGC TTC TCC TAC T 3′ 2#

    PCR产物克隆载体 pGEM-T Vector，Promega公司产品，为线性化克隆载体，其两端各带有一个3′突出的-T，可提高对由于Taq酶添加的3′-A末端的PCR产物的克隆连接效率。PCR扩增所用Taq酶及dNTP购自上海Sangon公司；酶切鉴定的内切酶购自中国协和医科大学科技开发公司；大肠杆菌T4 DNA连接酶购自Promega公司，其他试剂均为国产分析纯试剂。纯化PCR产物所用二氧化硅由本实验室制备。

    目的片段的扩增 分别以人基因组DNA和人肌肉组织cDNA文库为模板，用1#～2#引物对进行PCR扩增。反应体系中含有：1×反应缓冲液，1.5 mmol/L Mg²⁺，0.8 μmol/L引物，各0.4mmol/L dNTP，2U Taq酶。反应体系总体积为50 μl。反应条件为：94℃预变性3 min后，进行如下循环反应：94℃ 30 s，54℃ 40 s，72℃ 1 min，共35个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。

    扩增产物的回收及纯化 将扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，在长波紫外灯下用洁净刀片切割相应条带，用自制的二氧化硅回收凝胶中的DNA片段。

    DNA片段的限制性酶切分析 取适量的DNA样品，分别加入适量的限制性内切酶及相应的反应缓冲液，在限制性内切酶最适宜的反应条件下温育3～4 h后电泳检测酶切结果。

    PCR产物的克隆测序 将回收后得到的PCR产物分别克隆至pGEM-T Vector PCR克隆载体中用于测序。具体的克隆方法与平端连接反应类似。得到的转化子经酶切鉴定正确后以载体上的M13双向通用引物对插入片段进行荧光序列分析。

    2 结果

    PCR扩增结果 以人基因组DNA样品为模板的扩增产物为一约800 bp(实为833 bp)的单一条带(Fg)，而以人肌肉组织 cDNA Lamda噬菌体文库为模板的扩增产物则为一约200 bp(实为195 bp)的单一条带(Fc)，两者均无可见的非特异性扩增条带(图1)。

    图1 Fg与Fc的酶切鉴定图谱

    Fig 1 Restriction analysis of the fragment Fg and Fc

    a.Restriction analysis with RsaⅠ;

    b.Restriction analysis with BclⅠ；

    c.Restriction analysis with XbaⅠ；The lanes in Figure B,C were the same as those in Figure A

    1.pBR322/BstNⅠ molecular weight marker; 2.Fc; 3.Fc after enzyme digestion; 4.Fg after enzyme digestion; 5.Fg

    限制性酶切分析结果 由人基因组DNA和人肌肉组织cDNA为模板得到的扩增产物(Fg，Fc)经Silica纯化后分别用RsaⅠ，BclⅠ及XbaⅠ酶切，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，结果Fc经RsaⅠ消化后产生一较小条带，约为150 bp左右(实为141 bp)，经BclⅠ及XbaⅠ酶切后无变化；而Fg经RsaⅠ消化后产生一约600 bp(实为608 bp)和一约略小于200 bp(实为171 bp)的条带，经BclⅠ和XbaⅠ酶切后分别得到类似的两条大小约为600和250 bp(实为260，573 bp和288，545 bp)的条带(图1)。

    测序结果 见图2，3。

    图2 Fg核苷酸序列

    图3 Fc核苷酸序列

    Fig 3 The nucleotide sequence of Fc

    The nucleotides underlined TC were the single base at either side of the border between the two adjacent exons separately

    3 讨论

    本实验的设计基础是基于已知的GenBank中公布的人Na(+)-K(+)-Exchanging ATPase α1亚单位cDNA全序列X04297^[8]，集中在编码序列约80～130位氨基酸处，相应为序列X04297的569～763 bp。在此区域内未发现有相应的基因组DNA序列的相关报道。一般认为此区域属于α1亚单位基因的第一外显子，故基因组序列应同cDNA序列一致。因此从基因组DNA和cDNA两种模板所得到的扩增产物应该同样大小，均为195 bp。但从得到的PCR扩增产物来看，两者的差别很大，Fg约有800 bp而Fc为200 bp左右，且均为单一条带，似乎可以排除由于扩增条件不严格而导致的非特异性扩增。据此推测在此区域范围内的基因组DNA中可能存在未被发现的插入序列，即内含子。

    为了确定扩增结果的特异性，根据对扩增片段的cDNA序列分析，决定采用RsaⅠ、BclⅠ和XbaⅠ分别进行酶切。酶切结果发现，以cDNA为模板的扩增产物Fc对XbaⅠ和BclⅠ无切点，而对RsaⅠ则可产生一条约为150 bp左右的条带，这些与已知的X04297中相应序列完全一致，即此195 bp的片段Fc可被RsaⅠ切出大小为54和141 bp两个小片段，说明此片段，即为所要扩增的cDNA片段。而对于由基因组DNA扩增出的大片段，含有RsaⅠ的切点，同时亦含有目的片段所不具有的BclⅠ及XbaⅠ的切点。说明其很可能含有其他插入片段，即内含子序列。但最终结果必须经过DNA序列测定而决定。

    为此本实验将这两种PCR扩增产物克隆至载体pGEM-T中后经荧光测序发现，cDNA扩增产物Fc长度为195 bp，其序列与GenBank中公布的cDNA序列X04297的569～763 bp核苷酸序列完全一致。而基因组DNA扩增产物Fg长度为833 bp。分析其DNA序列可知经RsaⅠ酶切后应产生54，171及608 bp片段。且Fg片段中确实存在有XbaⅠ和BclⅠ的酶切位点，酶切产物分别为288、545 bp和260、573 bp。这与酶切分析结果相吻合。将所得到的共833 bp的DNA序列送至http://www-hgc.lbl.gov/prohects/splice.html，使用剪接位点预测软件来预测此序列中可能存在的剪接位点。结果为Score值大于0.4的剪接供体位点和受体位点(外显子/内含子的边界用大字体标明)。

    预测的剪接受体位点为：

    Start

    End

    Score

    Exon

    Intron

    131

    145

    0.97

    cgataatgtgagttc

    可能的剪接受体为：

    根据分析结果可知，该序列中最可能的内含子的剪接供体和受体分别位于138和775 bp，其中1～137 bp和776～883 bp的DNA序列同cDNA序列X04297一致，而138～775 bp的DNA序列经GenBank进行同源性检索后未发现同源性序列。且此部分DNA序列的两端分别为GT-、-AG，完全符合真核生物的内含子序列的“GT...AG”规则，故此可认定此序列为未经发现的人Na(+)-K(+)-Exchanging ATPase α-亚单位基因中位于第一和第二外显子之间的内含子。此序列被送至GenBank中进行同源性检索后，未发现类似序列，其基因检索号(Accession No.)为L76938。

    目前的研究表明，许多真核生物的内含子，特别是第一和第二内含子，含有顺式转录调控元件，能参与调节基因的表达^[9，10]，而并不像以前人们通常想象的那样只是位于外显子之间的简单的非编码序列。对本实验得到的这段长度为638 bp的第一内含子序列进行潜在的真核转录因子识别位点的搜索分析表明，存在几种保守的转录因子结合位点，其中有多个转录因子的潜在识别位点序列，如CdxA、CP1、GAGA、GATA-1、Hb、myc-CF1、MyoD、NF-Atp、Nkx-2、SRY及core-binding-factor等。附表中列出的是几种已知对其他基因的表达有重要作用或推测可能对此基因的转录具有重要的激活或抑制作用的转录因子识别位点。此外，比较引人注目的是该内含子序列包括一个类似于MHC Ⅰ型PD1基因中发现的沉寂子(silencer)的保守序列。这些可能的结合位点是否真正参与Na(+)-K(+)-Exchanging ATPase α1亚单位基因的表达调控作用还需要进一步的实验证实。但这对该内含子序列在人Na(+)-K(+)-Exchanging ATPase α1亚单位基因的表达过程中可能的作用已经给出了一个很有意义的提示，这对于我们今后对该基因的表达调控机制进一步研究将很有帮助。附表 人Na(+)-K(+)-Exchanging ATPase α1 亚单位基因第一内含子中可能的DNA-蛋白结合位点的定位及核苷酸序列

    Table Location and sequence of DNA-protein binding sites in human Na(+)-K(+)-Exchanging ATPase α1 subunit intron 1 Recognition site

    Na(+)-K(+)-Exchanging ATPase α1 gene intron 1

    sequence

    Silencer binding site(PD1)

    ⁵⁵⁰TTTTAATA⁵⁴³

    CP1，GATA-1

    ²⁷⁷CACTGGAT²⁸⁴

    Hb

    ⁵⁵⁶TTTTTTATTC⁵⁶⁵

    MyoD

    ¹²⁷GAACAGCTGTTG¹¹⁶

    NF-Atp

    ⁵⁴GGAGAA<sup>49

    393</sup>GGAGAA³⁹⁸

    Nkx-2

    ⁴³⁹TCAAGTG⁴⁴⁵

    SRY

    ³⁸³AAACAAA³⁷⁷

    TATA box

    ³⁸⁷TATAAAA³⁸¹

    此外，该序列中含有两个较长的以ATG为起始的开放阅读框架(ORF)，分别以201位及119位开始，长度分别为85及82个氨基酸。此外，在副链的342 bp处，有一短的ORF更加引人注意，它虽只编码13个氨基酸，但其起始密码子附近的序列“AGAATGG”却符合Kozak提出的“ANNATGG”翻译起始位点序列规则^[11]。此外，就在该ORF的上游，即同在副链的380 bp处有一个典型的TATA盒“TATAAAA”。我们知道在真核生物基因组中基因的分布是很不均匀的，在分布稀少的区域内上百甚至上千个kb内可无一个基因，而在某些密集区域中却会发生基因重叠的现象，即一个基因的全部或部分内含子序列是另一个基因的编码序列。最近的研究表明，这种现象不仅在原核生物及啮齿类动物中存在^[12]，而且在人基因组中也有类似发现^[13]。尽管笔者在该ORF前发现了一个类似启动子的保守序列，但这个可能的ORF是否为真正意义上的编码序列，还有待于对该区域的进一步研究。

    △美国中华医学基金(CMB,96-657)资助

    卢圣栋为通讯作者

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    (1998-11-25收稿)

    百拇医药网 http://www.100md.com/html/analecta/1999/03/01/38/077.htm