ELISA法和免疫印迹法检测抗ENA抗体的比较
作者：黄文辉 陶怡
单位：广州医学院第二附属医院内科，广州 510260
关键词：抗ENA抗体；酶免疫法(ELISA)；免疫印迹法(IBT)
广州医学院学报990308
提要 目的：将目前国内新开展的两种检测ENA技术，即免疫印迹法(IBT)和酶免疫法(ELISA)进行对比、分析。方法：用IBT法及ELISA法同时检测130例各种结缔组织病、非结缔组织病人及健康人血清中的抗ENA抗体。结果：20例健康人，两法均为阴性；80例结缔组织病患者，两法检出抗Sm抗体的符合率为91.3%，检测抗RNP抗体的符合率为82.5%，以上抗体两法的敏感性无显著差异(P>0.05)。检测抗SSA抗体，IBT法检出率低。抗SSB抗体检出率两法亦无显著差异(P>0.05),符合率为87.50%，在12例SS的检测中符合率比较低，为50%。结论：两种方法在检测抗Sm、RNP、SSB抗体时，敏感性无显著差异，ELISA法检测抗SSA抗体优于IBT法。上述两种方法在临床应用于抗ENA抗体的检测中于可互相验证和补充。
, http://www.100md.com
中图分类号 R446.61
The Comparison Between Enzyme-linked Immunosorbent
Assay (ELISA) and Immunoblot Test (IBT) Method
in the Detection of Anti-ENA Antibodies
Huang Wenhui, Tao Yi
(Department of Internal Medicine,the Second
Affiliated Hospital,Guangzhou Medical
, 百拇医药 College,Guangzhou 510260)
Objective:To clarify and compare the sensitivity and specificity of twomethods with each other that are used for the detection of anti-ENA antibodies in routine laboratory work.Methods:Totally 130 serum samples, of which 80 from patients with different connective tissue diseases (CTD),30 from that with non-CTD diseases,and 20 from healthy volunteers,were collected and examined. All sera were tested for anti-Sm,anti-RNP,anti-SSA and anti-SSB antibodies by the methodsof enzyem-linked immunosorbent assay (ELISA) and immunoblot test (IBT). Results:the 20 samples of sera from healthy volunteers showed negative,and the coincidence rate ofthe two method in detecting anti-Sm antibody was 58.82%,whereas that in detecting anti-RNP antibody was 61.11%,with no statistically significant difference between the two rates (P>005).While IBT method was used to detect anti-SSA antibody,the detectable rate was low,and the reason for this was probably the application of rabbit thymus acetone powder as antigen,which led to the loss of some SSA antigen constituents. The detectable rates of anti-SSB antibody in groups of the two methods showed no statistically significant difference (P>0.05),but the coincidence rate was as low as 37.5%,and that in detecting serum samples from 12 cases of Sj
grens syndrome was 50%. Conclusion:The sensitivities of the two methods in detecting anti-Sm, anti-RNP and anti-SSB antibodies were with no statistically significant difference,and that of ELISA method in detecting anti-SSA antibody washigher than that of IBT method. The above two methods in clinical detection ofanti-ENA antibodies could be identified and replenished with each other.
, 百拇医药
Key words Anti-ENA antibody；Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)；Immunoblot test (IBT)
抗可提取核抗原抗体(抗ENA抗体)的检测对结缔组织病的诊断和鉴别诊断具有重要的意义，其检测方法在80年代多采用免疫双扩散法(ID)，该法虽是传统的较特异的检测技术，但敏感性较低[1]。90年代以来，随着分子生物学和酶联免疫技术的发展和应用，就较多地应用免疫印迹技术(IBT)及酶免疫测定法(ELISA)来检测抗ENA抗体，这两种新方法的敏感性均较ID法高，且检测的自身抗体种类也较ID法多，但其特异性仍有待进一步证实。鉴此，本文选择130例各种结缔组织病和非结缔组织病患者及正常人，用IBT法和ELISA法进行抗ENA抗体检测，通过横向比较，以评价其临床应用价值，报告如下。
1 材料和方法
, 百拇医药 1.1 材料来源 选择1996年～1997年本院门诊及住院的各种结缔组织病患者80例，其中系统性红斑狼疮(SLE)38例，多发性肌炎/皮肌炎(PM/DM)8例，系统性硬化症(SSC)6例，干燥综合征(SS)12例，混合性结缔组织病(MCTD)4例，类风湿关节炎(RA)12例，这些病例都符合国际诊断标准。另任意选择30例非结缔组织病患者和20例正常人作为对照组。均采集血清进行检测。
1.2 方法
1.2.1 免疫印迹法 按许以华等改良法[2]。酶标抗体采用生物素化羊抗人免疫球蛋白和辣根过氧化物酶标化亲和素系统，结果以硝酸纤维膜上显示的蛋白区带与标准分子量和阳性对照进行核对。凡具有28/29KD和(或)13.5KD条带的为抗Sm多肽抗体，具有70KD和(或)32、28、29、22KD条带为抗RNP抗体；52KD、60KD为抗SSA/RO多肽抗体，具有50、47、45KD者为抗SSB/La的多肽抗体。试剂盒由万孚生物技术有限公司提供。
, 百拇医药
1.2.2 固相酶免疫测定法 聚苯己烯反应板上微孔用Sm、RNP、SSA、SSB 4 种自身抗原包被后，加入血清标本和对照血清孵育反应，孵育期间样品中的抗体结合到固相中。洗涤后，再与稀释好的经辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG孵育反应，经抽吸和洗涤移去未结合的抗体，加入特殊色原，于酶联免疫检测仪波长450nm处测各孔OD值，以测出自身抗体。试剂盒及对照血清均由美国Zeus公司提供。
2 结果
2.1 本文经过两种检测方法对4种抗ENA抗体检出率的比较，结果表明20例正常人两法检测均为阴性，非结缔组织病患者30例中，IBT法检出4例(13.3%)，ELISA法检出3例(10%)。抗Sm抗体阳性在80例结缔组织病组的检出率,用IBT法为18.8%(15/80)，用ELISA法为15%(12/80)。两种方法共检出抗Sm抗体阳性的病人17例，除IBT法检出1例为肝炎外，余均为SLE患者。在38例SLE组中Sm抗体的阳性率，用IBT法为36.8%(14/38)，用ELISA法为31.6%(12/38)，经χ2检验，两法的敏感性无显著差异(P>0.05)。对80例各种结缔组织病患者，两种方法检出抗体的阳性与阴性符合率达91.3%(73/80)(见表1)
, 百拇医药
表1 两种方法检测80例结缔组织病患者的结果比较
Sm抗体
RNP抗体
IBT法(n=80)
IBT法(n=80)
阳性
阴性
阳性
阴性
ELISA法
(n=80)
阳性
, http://www.100md.com
10
2
22
8
阴性
5
63
6
44
2.2 在80例结缔组织病组患者中，对于抗RNP抗体，IBT法检出阳性者28例(35%)，用ELISA法检出阳性30例(37.5%)，见表1。其中38例SLE病人，IBT法阳性者22例(57.9%)。ELISA法阳性者26例(68.4%)，两法检测结果的符合率82.5%(66/80)。经χ2检验，两法的敏感性无显著差异(P>0.05)。另外，4例MCTD患者，两法检测抗RNP抗体均为阳性。
, http://www.100md.com
2.3 观察80例结缔组织病组患者的抗SSA抗体，IBT法检出12.5%(10/80)，ELISA法检出55%(55/80)，两者差异较大。经χ2检验，ELISA法敏感性明显高于IBT法(P<0.05)。IBT法测到的抗SSA抗体均为52KD的多肽抗体。
2.4 对抗SSB抗体的检测，80例结缔组织病患者，IBT法检出10.0%(8/80)，ELISA法检出17.5%(14/80)。经χ2检验两种方法检测的敏感性无显著差异(P>0.05)。两种方法共检出阳性者16例，两种方法符合率为87.50%(70/80)。在12例SS的检测中检出符合率为50%(6/12)。以IBT法检出的均为45、47KD多肽。
3 讨论
检测抗ENA抗体是多种结缔组织病的诊断标记，随着检测技术的发展，采用免疫印迹法和酶免疫法进行抗ENA抗体的检测是一大进步。本文对两种检测方法的结果进行比较，表明两法对检测抗Sm、抗RNP、抗SSB抗体的敏感性并无显著差异。只是在抗SSA抗体检测上有差异，其原因可能为市售的试剂盒是以兔胸腺丙酮粉为抗原，SSA抗原均为52KD，而60KD抗原缺失，因此有一部分抗SSA抗体在用IBT法时漏检，故ELISA法检测抗SSA抗体的敏感性明显高于IBT法，因而检测抗SSA抗体应以ELISA法为主。
, 百拇医药
IBT法与ELISA法虽然优于传统的ID法，但仍存在一些值得注意的问题。在IBT检测中，于一条硝酸纤维膜上有数种成份显示，尤其是28/29KD的Sm，32KD的ulRNP，38KD的rRNP等，数种条带相距很近，加上每次电泳时蛋白区带在凝胶中迁移的速率均有不同，以及蛋白区带在电泳时形成的斜率，都给识别这些条带带来一定困难，很容易造成判别误差和假阳性[4]，本文在IBT检测中也曾遇到过这样的问题。ELISA法操作简便，每种抗体检测均有标准血清做对照，而且是定量检测，敏感性与IBT法相当。但ELISA法的检测却非常依赖于抗原制品的纯度，抗原的纯化程度可影响其检测特异性[5]。两种方法检测抗Sm、抗SSA抗体和抗RNP抗体的符合率均>80%，但在SS患者中检测抗SSB抗体的符合率却较低，为50%。为了使抗ENA抗体的检测质量进一步提高，我们认为同时采用两种方法应可互相验证、互相补充。
参考文献
1 Tam E M. Antiunclear antibodies；diagnostic markers for autoimmune diesases and prober for cell biology. Adv Immunol,1989；44:93～151
, http://www.100md.com
2 许以华，陈顺乐，叶萍等.免疫印迹技术检测Sm.RNP及SSB多肽抗体的临床意义.中华内科杂志，1990；19：574～575
3 Mattioli M，Reichlin M.Characterization of soluble nuclear ribonucleo-protein antigen reactive with SLE sera.J Immunol,1971；107：1281～1290
4 甘晓丹，张霞，史艳萍等.抗ENA抗体检测方法的比较.风湿病学杂志，1996；1(3)：106～108
5 蒋明，陈永铭.风湿病学(上册).第一版，北京:科学出版社，1995:356～358
(收稿：1999-03-30), 百拇医药
单位：广州医学院第二附属医院内科，广州 510260
关键词：抗ENA抗体；酶免疫法(ELISA)；免疫印迹法(IBT)
广州医学院学报990308
提要 目的：将目前国内新开展的两种检测ENA技术，即免疫印迹法(IBT)和酶免疫法(ELISA)进行对比、分析。方法：用IBT法及ELISA法同时检测130例各种结缔组织病、非结缔组织病人及健康人血清中的抗ENA抗体。结果：20例健康人，两法均为阴性；80例结缔组织病患者，两法检出抗Sm抗体的符合率为91.3%，检测抗RNP抗体的符合率为82.5%，以上抗体两法的敏感性无显著差异(P>0.05)。检测抗SSA抗体，IBT法检出率低。抗SSB抗体检出率两法亦无显著差异(P>0.05),符合率为87.50%，在12例SS的检测中符合率比较低，为50%。结论：两种方法在检测抗Sm、RNP、SSB抗体时，敏感性无显著差异，ELISA法检测抗SSA抗体优于IBT法。上述两种方法在临床应用于抗ENA抗体的检测中于可互相验证和补充。
, http://www.100md.com
中图分类号 R446.61
The Comparison Between Enzyme-linked Immunosorbent
Assay (ELISA) and Immunoblot Test (IBT) Method
in the Detection of Anti-ENA Antibodies
Huang Wenhui, Tao Yi
(Department of Internal Medicine,the Second
Affiliated Hospital,Guangzhou Medical
, 百拇医药 College,Guangzhou 510260)
Objective:To clarify and compare the sensitivity and specificity of twomethods with each other that are used for the detection of anti-ENA antibodies in routine laboratory work.Methods:Totally 130 serum samples, of which 80 from patients with different connective tissue diseases (CTD),30 from that with non-CTD diseases,and 20 from healthy volunteers,were collected and examined. All sera were tested for anti-Sm,anti-RNP,anti-SSA and anti-SSB antibodies by the methodsof enzyem-linked immunosorbent assay (ELISA) and immunoblot test (IBT). Results:the 20 samples of sera from healthy volunteers showed negative,and the coincidence rate ofthe two method in detecting anti-Sm antibody was 58.82%,whereas that in detecting anti-RNP antibody was 61.11%,with no statistically significant difference between the two rates (P>005).While IBT method was used to detect anti-SSA antibody,the detectable rate was low,and the reason for this was probably the application of rabbit thymus acetone powder as antigen,which led to the loss of some SSA antigen constituents. The detectable rates of anti-SSB antibody in groups of the two methods showed no statistically significant difference (P>0.05),but the coincidence rate was as low as 37.5%,and that in detecting serum samples from 12 cases of Sj
grens syndrome was 50%. Conclusion:The sensitivities of the two methods in detecting anti-Sm, anti-RNP and anti-SSB antibodies were with no statistically significant difference,and that of ELISA method in detecting anti-SSA antibody washigher than that of IBT method. The above two methods in clinical detection ofanti-ENA antibodies could be identified and replenished with each other., 百拇医药
Key words Anti-ENA antibody；Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)；Immunoblot test (IBT)
抗可提取核抗原抗体(抗ENA抗体)的检测对结缔组织病的诊断和鉴别诊断具有重要的意义，其检测方法在80年代多采用免疫双扩散法(ID)，该法虽是传统的较特异的检测技术，但敏感性较低[1]。90年代以来，随着分子生物学和酶联免疫技术的发展和应用，就较多地应用免疫印迹技术(IBT)及酶免疫测定法(ELISA)来检测抗ENA抗体，这两种新方法的敏感性均较ID法高，且检测的自身抗体种类也较ID法多，但其特异性仍有待进一步证实。鉴此，本文选择130例各种结缔组织病和非结缔组织病患者及正常人，用IBT法和ELISA法进行抗ENA抗体检测，通过横向比较，以评价其临床应用价值，报告如下。
1 材料和方法
, 百拇医药 1.1 材料来源 选择1996年～1997年本院门诊及住院的各种结缔组织病患者80例，其中系统性红斑狼疮(SLE)38例，多发性肌炎/皮肌炎(PM/DM)8例，系统性硬化症(SSC)6例，干燥综合征(SS)12例，混合性结缔组织病(MCTD)4例，类风湿关节炎(RA)12例，这些病例都符合国际诊断标准。另任意选择30例非结缔组织病患者和20例正常人作为对照组。均采集血清进行检测。
1.2 方法
1.2.1 免疫印迹法 按许以华等改良法[2]。酶标抗体采用生物素化羊抗人免疫球蛋白和辣根过氧化物酶标化亲和素系统，结果以硝酸纤维膜上显示的蛋白区带与标准分子量和阳性对照进行核对。凡具有28/29KD和(或)13.5KD条带的为抗Sm多肽抗体，具有70KD和(或)32、28、29、22KD条带为抗RNP抗体；52KD、60KD为抗SSA/RO多肽抗体，具有50、47、45KD者为抗SSB/La的多肽抗体。试剂盒由万孚生物技术有限公司提供。
, 百拇医药
1.2.2 固相酶免疫测定法 聚苯己烯反应板上微孔用Sm、RNP、SSA、SSB 4 种自身抗原包被后，加入血清标本和对照血清孵育反应，孵育期间样品中的抗体结合到固相中。洗涤后，再与稀释好的经辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG孵育反应，经抽吸和洗涤移去未结合的抗体，加入特殊色原，于酶联免疫检测仪波长450nm处测各孔OD值，以测出自身抗体。试剂盒及对照血清均由美国Zeus公司提供。
2 结果
2.1 本文经过两种检测方法对4种抗ENA抗体检出率的比较，结果表明20例正常人两法检测均为阴性，非结缔组织病患者30例中，IBT法检出4例(13.3%)，ELISA法检出3例(10%)。抗Sm抗体阳性在80例结缔组织病组的检出率,用IBT法为18.8%(15/80)，用ELISA法为15%(12/80)。两种方法共检出抗Sm抗体阳性的病人17例，除IBT法检出1例为肝炎外，余均为SLE患者。在38例SLE组中Sm抗体的阳性率，用IBT法为36.8%(14/38)，用ELISA法为31.6%(12/38)，经χ2检验，两法的敏感性无显著差异(P>0.05)。对80例各种结缔组织病患者，两种方法检出抗体的阳性与阴性符合率达91.3%(73/80)(见表1)
, 百拇医药
表1 两种方法检测80例结缔组织病患者的结果比较
Sm抗体
RNP抗体
IBT法(n=80)
IBT法(n=80)
阳性
阴性
阳性
阴性
ELISA法
(n=80)
阳性
, http://www.100md.com
10
2
22
8
阴性
5
63
6
44
2.2 在80例结缔组织病组患者中，对于抗RNP抗体，IBT法检出阳性者28例(35%)，用ELISA法检出阳性30例(37.5%)，见表1。其中38例SLE病人，IBT法阳性者22例(57.9%)。ELISA法阳性者26例(68.4%)，两法检测结果的符合率82.5%(66/80)。经χ2检验，两法的敏感性无显著差异(P>0.05)。另外，4例MCTD患者，两法检测抗RNP抗体均为阳性。
, http://www.100md.com
2.3 观察80例结缔组织病组患者的抗SSA抗体，IBT法检出12.5%(10/80)，ELISA法检出55%(55/80)，两者差异较大。经χ2检验，ELISA法敏感性明显高于IBT法(P<0.05)。IBT法测到的抗SSA抗体均为52KD的多肽抗体。
2.4 对抗SSB抗体的检测，80例结缔组织病患者，IBT法检出10.0%(8/80)，ELISA法检出17.5%(14/80)。经χ2检验两种方法检测的敏感性无显著差异(P>0.05)。两种方法共检出阳性者16例，两种方法符合率为87.50%(70/80)。在12例SS的检测中检出符合率为50%(6/12)。以IBT法检出的均为45、47KD多肽。
3 讨论
检测抗ENA抗体是多种结缔组织病的诊断标记，随着检测技术的发展，采用免疫印迹法和酶免疫法进行抗ENA抗体的检测是一大进步。本文对两种检测方法的结果进行比较，表明两法对检测抗Sm、抗RNP、抗SSB抗体的敏感性并无显著差异。只是在抗SSA抗体检测上有差异，其原因可能为市售的试剂盒是以兔胸腺丙酮粉为抗原，SSA抗原均为52KD，而60KD抗原缺失，因此有一部分抗SSA抗体在用IBT法时漏检，故ELISA法检测抗SSA抗体的敏感性明显高于IBT法，因而检测抗SSA抗体应以ELISA法为主。
, 百拇医药
IBT法与ELISA法虽然优于传统的ID法，但仍存在一些值得注意的问题。在IBT检测中，于一条硝酸纤维膜上有数种成份显示，尤其是28/29KD的Sm，32KD的ulRNP，38KD的rRNP等，数种条带相距很近，加上每次电泳时蛋白区带在凝胶中迁移的速率均有不同，以及蛋白区带在电泳时形成的斜率，都给识别这些条带带来一定困难，很容易造成判别误差和假阳性[4]，本文在IBT检测中也曾遇到过这样的问题。ELISA法操作简便，每种抗体检测均有标准血清做对照，而且是定量检测，敏感性与IBT法相当。但ELISA法的检测却非常依赖于抗原制品的纯度，抗原的纯化程度可影响其检测特异性[5]。两种方法检测抗Sm、抗SSA抗体和抗RNP抗体的符合率均>80%，但在SS患者中检测抗SSB抗体的符合率却较低，为50%。为了使抗ENA抗体的检测质量进一步提高，我们认为同时采用两种方法应可互相验证、互相补充。
参考文献
1 Tam E M. Antiunclear antibodies；diagnostic markers for autoimmune diesases and prober for cell biology. Adv Immunol,1989；44:93～151
, http://www.100md.com
2 许以华，陈顺乐，叶萍等.免疫印迹技术检测Sm.RNP及SSB多肽抗体的临床意义.中华内科杂志，1990；19：574～575
3 Mattioli M，Reichlin M.Characterization of soluble nuclear ribonucleo-protein antigen reactive with SLE sera.J Immunol,1971；107：1281～1290
4 甘晓丹，张霞，史艳萍等.抗ENA抗体检测方法的比较.风湿病学杂志，1996；1(3)：106～108
5 蒋明，陈永铭.风湿病学(上册).第一版，北京:科学出版社，1995:356～358
(收稿：1999-03-30), 百拇医药