维拉帕米对兔视网膜色素上皮细胞增殖的抑制作用
作者：姜彩辉 张卯年 张鲲 黄靖香 顾铮
单位：姜彩辉 解放军总医院眼科研究生，北京 100853 张卯年 张鲲 黄靖香 解放军总医院眼科 顾铮 解放军总医院病理科
关键词：维拉帕米；药理学；视网膜色素上皮细胞；增殖性玻璃体视网膜病变；药物疗法
军医进修学院学报科学990322 摘要 目的：观察维拉帕米(Verapamil, Ver)对兔视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)细胞增殖的影响，寻找有效、安全、方便的药物以防治增殖性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy, PVR)。方法：分别将不同浓度的维拉帕米加入体外培养的兔RPE细胞，用噻唑蓝(MTT)比色法在自动酶标测定仪测 540 nm 处的吸光值A[旧称光密度(OD)]，计算出不同浓度条件下的细胞增殖抑制率及 50% 抑制浓度(fifty percent inhibitory concentration, IC50)，同时用 2% 台盼蓝染色，测定细胞活性。结果：Ver 在所设浓度范围内均明显抑制血清诱导的兔RPE细胞的增殖，抑制作用呈剂量依赖性，IC50为 16.7659 mg/L，超过 80 mg/L 细胞生存受到影响。结论：Ver 在较低浓度下即能明显抑制RPE细胞增殖，有希望成为防治PVR的药物之一。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 R 773
Inhibition effect of verapamil on surum-induced proliferation of rabbit retinal pigment epithelial cells in vitro
Jiang Caihui, Zhang Maonian, Zhang Kun, Huang Jingxiang, Gu Zheng (Department of Ophthalmology, the general Hospital of PLA, Beijing 100853)
Abstract Objective:To investigate the effect of verapamil on surum-induced proliferation of rabbit pigment epithelial (RPE) cells and to search for simple and effective medicine on PVR. Methods:The rabbit RPE cells (passage 2 to 5) were cultured with various concentrations of verapamil in DMEM. The rates of inhibition were respectively determined by MTT method, and the cell viability was estimated by trypan blue exclusion test. Results:Verapamil at all given concentrations significantly inhibited the serum-induced proliferation of RPE cells. At concentrations of 80 mg/L and lower, it had no effect on cell viability. The IC50 of verapamil was 16.7659 mg/L.Conclusion:Verapamil significantly inhibits RPE cell promising drug on PVR.
, 百拇医药
Key words verapamil; pharmacology; retinal pigment epithelial cell; proliferative vetreoretinopathy; drug therapy
增殖性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy, PVR)是视网膜脱离手术失败及视力丧失的主要原因。目前，玻璃体视网膜手术已取得长足进展，然而手术并不能有效阻止甚至可刺激细胞的迁移、增殖，导致PVR复发。因此探索药物防治PVR受到广泛关注。
视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)细胞的迁移及增殖是导致PVR的主要原因之一，我们应用噻唑蓝(MTT)比色法观察钙通道阻滞剂维拉帕米(Verapamil, Ver)对体外培养的兔RPE细胞增殖的抑制作用，旨在寻找新的防治PVR的药物。
, http://www.100md.com 1 材料和方法
1.1 药品、试剂与仪器 DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium)为美国GIBCO公司产品，胰蛋白酶(trypin)为美国DIFCO公司产品，MTT为美国Sigma公司产品，自动酶标测定仪(Reader 230 s, Austria)，倒置显微镜(OLYMPUS, Japan)，盐酸维拉帕米注射液(Knol AG. D-67008 Ludwigshafen. Germany/Alemania)。
1.2 兔RPE细胞的培养 在无菌条件下摘出青紫蓝幼兔(解放军总医院医学实验动物中心提供)的眼球，无菌Hank液浸泡，冲洗，自赤道环型剖开眼球，弃去眼前节、玻璃体及视网膜感觉部，后节眼杯经Hank液轻轻漂洗后，用 0.25% 胰酶消化 30 min，分离RPE细胞，经离心、漂洗后接种于含 15% 小牛血清、青霉素 200 U/ml、链霉素 100 U/ml 的DMEM培养液中，于 37 ℃ 5% CO2 孵箱中培养。 d 3 见单层细胞长出。实验所用细胞在 2～5 代之内。
, 百拇医药
1.3 维拉帕米对兔RPE细胞增殖抑制率的测定 在 96 孔细胞培养板按每孔 2×104/200 μL 接种RPE细胞，于 37 ℃、 5% CO2 孵箱中培养 24 h 后，换上含不同浓度维拉帕米的培养液，对照组也换培养液 1 次，每个浓度设 6 个孔，继续培养 48 h 后，加入MTT，终浓度为 500 mg/L， 4 h 后吸去培养液，每孔各加入二甲基亚砜 200 μL，混匀，半小时后在自动酶标测定仪上测 540 nm (参考波长 655 nm) 处吸光值A[旧称光密度(OD)]。
细胞增殖抑制率＝(对照组A值-实验组A值)/对照组A值×100%
1.4 细胞活性测定及形态学观察 将第三代的正常细胞接种于培养瓶中，细胞数为每瓶 2.5×105 个/6 ml，培养液中Ver的浓度分别是 0 mg/L、10 mg/L、 40 mg/L、 80 mg/L，每种浓度设两瓶。用倒置显微镜观察细胞生长状况及形态并摄片，用 2% 台盼蓝染色，测定细胞活性。
, 百拇医药
1.5 数据处理 对实验结果分别采用方差分析，t检验，直线相关检验及直线回归方程处理。
2 结 果
2.1 应用单克隆鼠抗人细胞角蛋白(cytokeratin, CK)对培养的细胞进行免疫细胞化学鉴定，结果证明，培养的细胞对CK呈阳性反应，光学显微镜下观察，胞浆呈棕黄色，表明培养的细胞为RPE细胞。
2.2 维拉帕米对RPE细胞增殖的抑制作用 应用MTT比色法测得不同浓度Ver组及对照组在 540 nm 处吸光值A及细胞增长抑制率见附表。
附表 不同浓度Ver对RPE细胞增殖的抑制作用 Ver浓度
(mg/L)
吸光值A
, http://www.100md.com
细胞增殖抑制率
(%)
t
P
0
0.8548±0.0734
2.5
0.7140±0.0631
16.4749
3.5646
<0.005 1
5
0.6178±0.0759
, http://www.100md.com
27.7147
5.4970
<0.000 3
10
0.5612±0.0851
34.3537
6.3987
<0.000 1
20
0.5283±0.0359
38.1946
9.7849
, http://www.100md.com
<0.000 1
40
0.3422±0.0246
59.9727
16.2185
<0.000 1
80
0.1022±0.0396
88.0484
22.1023
<0.000 1
160
, http://www.100md.com
0.0255±0.0167
97.0170
26.9838
<0.000 1
注：t值为各浓度与未加药组(0)相比较的值
方差分析(F＝154.98，P＝0.0001)证明Ver在不同的浓度对RPE细胞的增殖抑制作用是不同的，结合t检验，Ver在各浓度组均使细胞增殖率显著下降，其作用随浓度的增加而增大。
将药物浓度取常用对数后作横坐标(X)，用细胞增殖抑制率作纵坐标(Y)，绘出(X，Y)散点图，发现呈直线趋势，故可进行直线相关及回归分析。直线相关分析求得Pearson相关系数r=0.967 4，P＝0.000 4，说明药物浓度与细胞增殖抑制率呈非常显著的正相关关系。直线回归分析求得直线回归方程为：Y＝40.835 4，F＝318.869 0，P＝0.000 1，此直线回归方程是成立的。由此方程求得Ver 50% 抑制浓度为：IC50＝16.765 9 mg/L。
, 百拇医药
2.3 维拉帕米对RPE细胞形态及活性的影响 对照组细胞生长旺盛，形状不规则，呈扁平多角形，中央有一圆形透明区为细胞核，周围布满黑色素颗粒。随着细胞增殖，长梭形细胞逐渐增多，常彼此紧密连接成单层细胞片，黑色素颗粒逐渐减少。第 5 次传代以后，细胞形状类似于成纤维细胞，但略大。用药组随药物浓度升高，细胞形态变化逐渐明显，呈圆形，见大量细胞膜及核膜溶解，核固缩、肿胀、核仁消失，未见核分裂相。维拉帕米浓度低于 40 mg/L 时，RPE细胞的活性未受影响，细胞活性>90%。当浓度高于 80 mg/L 时，细胞活性<50%，细胞生存受到影响，细胞形态开始发生变化，胞体常缩成圆形，细胞相互间隙增大，形态轮廓明显。
3 讨 论
PVR是视网膜脱离后最严重的并发症，也是其视力丧失的主要原因。细胞迁移、增殖、收缩是形成PVR的关键病理过程，抑制这些病理过程的发展可防止PVR的形成。PVR是一种多细胞介导性疾病，如RPE细胞、神经胶质细胞、成纤维细胞和巨噬细胞等，其中RPE细胞是PVR的主要细胞成分，在PVR的发生、发展过程中起重要作用〔1〕，而且RPE细胞对维持视网膜的正常结构和功能具有极其重要的生物学作用。近年来，国内外学者对多种药物，如抗代谢类、激素类对成纤维细胞的抑制作用进行了研究，但对直接抑制RPE细胞的研究尚不多，所以我们选用体外培养的兔RPE细胞，观察维拉帕米对RPE细胞的影响。
, http://www.100md.com
钙通道阻滞剂是一类能够阻断慢钙通道，减少细胞外液钙离子内流的药物。体外培养手术取出的视网膜前膜及下膜，发现 0.25 mg/L 的维拉帕米即能抑制细胞生长〔2〕。李秋明等〔3〕研究发现维拉帕米对体外培养的巩膜成纤维细胞的增殖有抑制作用。
我们选用临床上应用广泛的钙通道阻滞剂-维拉帕米，观察其对兔RPE细胞增殖的抑制作用。实验结果证明维拉帕米对血清诱导的兔RPE细胞增殖有明显的抑制作用，且呈明显的剂量依赖性。Ver浓度与其细胞增殖抑制作用呈非常显著的正相关关系。用 2% 台盼蓝染色法测定RPE细胞活性发现维拉帕米浓度在 80 mg/L 以上时，细胞活性<50%，细胞生存受到影响。目前，维拉帕米抑制RPE细胞增殖的作用机制还不甚清楚，本实验通过应用维拉帕米抑制细胞外钙内流降低细胞内游离Ca2+而抑制RPE细胞增殖，可以推测细胞内游离Ca2+浓度的增高可能是RPE细胞迁移和增殖的机制之一。Hackett等〔4〕认为，cAMP与RPE细胞的趋化、迁移和增殖关系密切，凡能降低细胞内cAMP水平的因素均可促进RPE细胞的迁移和增殖。由于细胞内Ca2+和cAMP存在着相互拮抗的关系，即细胞内Ca2+浓度增高就会导致cAMP的降低。结合本实验结果，维拉帕米抑制细胞外钙内流降低细胞内游离Ca2+在从而间接导致cAMP增高，因而抑制RPE细胞的增殖。推测维拉帕米可能通过间接影响细胞内第二信使-cAMP浓度的变化抑制RPE细胞增殖。另外，Kataoka等〔5〕研究发现PDGF诱导细胞增殖与蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)的激活有关，我们推测，Ver抑制RPE细胞增殖，通过抑制PKC通路也是其可能的作用机制之一。
, 百拇医药
细胞存活和增殖通常用3H-TdR掺入法及细胞计数法，前者使用放射性同位素易污染环境，后者易受主观因素的影响，误差较大。Mosmann〔6〕根据细胞增殖需要大量的能量，而细胞能量代谢的水平可以间接反映细胞增殖情况，创立了MTT比色分析法。MTT是一种四氮唑化合物，其分子结构中的四氮唑环可在活细胞线粒体作用下而断裂，而死亡细胞、红细胞及培养液则无此作用，裂解产物为紫色结晶，其数量与活细胞数量成正比。MTT法可免去细胞脱壁、冲洗、收集等步骤，同时可排除pH效应对结果的影响，只需加试剂，在自动酶标测定仪上自动测定和打印数据，免去人为因素的影响，使实验结果更可靠。另外，该法还具有简便、快速等特点，应用十分广泛。
参考文献
1 Campochiaro PA. Pathogenic mechanisms in proliferative vitreoretinopathy. Arch Ophthalmol, 1997， 115(2):237
, 百拇医药
2 Richer D, Hatvani I, Toth A. Growth inhibition of intraocular proliferative explants under in vitro conditions by verapamil. Klin Monatsbl Augenheilkd, 1993，203(1):206
3 李秋明，宋绣雯，刘新华等.维拉帕米对人巩膜成纤维细胞增殖的实验研究.中华眼底病杂志，1996，12(1)：98
4 Hackett S, friedman Z, Peter A. Cyclic 3′,5′-adenosine monophosphate modulates retinal pigment epithelil cell migration in vitro. Arch Ophthalmol, 1986，104(8):1688
5 Kataoka S, Alam R, Dash PK, et al. Inhibition of PDGF-mediated proliferation of vascular smooth muscle cells by calcium antagonists. Stroke, 1997， 28(2):364
6 Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular grouth and surrival: Application to proliferation and cytotoxicityassay. J Immunal Methods, 1983， 65(1):55
(1999—01—24收稿，1999—03—17修回), 百拇医药
单位：姜彩辉 解放军总医院眼科研究生，北京 100853 张卯年 张鲲 黄靖香 解放军总医院眼科 顾铮 解放军总医院病理科
关键词：维拉帕米；药理学；视网膜色素上皮细胞；增殖性玻璃体视网膜病变；药物疗法
军医进修学院学报科学990322 摘要 目的：观察维拉帕米(Verapamil, Ver)对兔视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)细胞增殖的影响，寻找有效、安全、方便的药物以防治增殖性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy, PVR)。方法：分别将不同浓度的维拉帕米加入体外培养的兔RPE细胞，用噻唑蓝(MTT)比色法在自动酶标测定仪测 540 nm 处的吸光值A[旧称光密度(OD)]，计算出不同浓度条件下的细胞增殖抑制率及 50% 抑制浓度(fifty percent inhibitory concentration, IC50)，同时用 2% 台盼蓝染色，测定细胞活性。结果：Ver 在所设浓度范围内均明显抑制血清诱导的兔RPE细胞的增殖，抑制作用呈剂量依赖性，IC50为 16.7659 mg/L，超过 80 mg/L 细胞生存受到影响。结论：Ver 在较低浓度下即能明显抑制RPE细胞增殖，有希望成为防治PVR的药物之一。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 R 773
Inhibition effect of verapamil on surum-induced proliferation of rabbit retinal pigment epithelial cells in vitro
Jiang Caihui, Zhang Maonian, Zhang Kun, Huang Jingxiang, Gu Zheng (Department of Ophthalmology, the general Hospital of PLA, Beijing 100853)
Abstract Objective:To investigate the effect of verapamil on surum-induced proliferation of rabbit pigment epithelial (RPE) cells and to search for simple and effective medicine on PVR. Methods:The rabbit RPE cells (passage 2 to 5) were cultured with various concentrations of verapamil in DMEM. The rates of inhibition were respectively determined by MTT method, and the cell viability was estimated by trypan blue exclusion test. Results:Verapamil at all given concentrations significantly inhibited the serum-induced proliferation of RPE cells. At concentrations of 80 mg/L and lower, it had no effect on cell viability. The IC50 of verapamil was 16.7659 mg/L.Conclusion:Verapamil significantly inhibits RPE cell promising drug on PVR.
, 百拇医药
Key words verapamil; pharmacology; retinal pigment epithelial cell; proliferative vetreoretinopathy; drug therapy
增殖性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy, PVR)是视网膜脱离手术失败及视力丧失的主要原因。目前，玻璃体视网膜手术已取得长足进展，然而手术并不能有效阻止甚至可刺激细胞的迁移、增殖，导致PVR复发。因此探索药物防治PVR受到广泛关注。
视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)细胞的迁移及增殖是导致PVR的主要原因之一，我们应用噻唑蓝(MTT)比色法观察钙通道阻滞剂维拉帕米(Verapamil, Ver)对体外培养的兔RPE细胞增殖的抑制作用，旨在寻找新的防治PVR的药物。
, http://www.100md.com 1 材料和方法
1.1 药品、试剂与仪器 DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium)为美国GIBCO公司产品，胰蛋白酶(trypin)为美国DIFCO公司产品，MTT为美国Sigma公司产品，自动酶标测定仪(Reader 230 s, Austria)，倒置显微镜(OLYMPUS, Japan)，盐酸维拉帕米注射液(Knol AG. D-67008 Ludwigshafen. Germany/Alemania)。
1.2 兔RPE细胞的培养 在无菌条件下摘出青紫蓝幼兔(解放军总医院医学实验动物中心提供)的眼球，无菌Hank液浸泡，冲洗，自赤道环型剖开眼球，弃去眼前节、玻璃体及视网膜感觉部，后节眼杯经Hank液轻轻漂洗后，用 0.25% 胰酶消化 30 min，分离RPE细胞，经离心、漂洗后接种于含 15% 小牛血清、青霉素 200 U/ml、链霉素 100 U/ml 的DMEM培养液中，于 37 ℃ 5% CO2 孵箱中培养。 d 3 见单层细胞长出。实验所用细胞在 2～5 代之内。
, 百拇医药
1.3 维拉帕米对兔RPE细胞增殖抑制率的测定 在 96 孔细胞培养板按每孔 2×104/200 μL 接种RPE细胞，于 37 ℃、 5% CO2 孵箱中培养 24 h 后，换上含不同浓度维拉帕米的培养液，对照组也换培养液 1 次，每个浓度设 6 个孔，继续培养 48 h 后，加入MTT，终浓度为 500 mg/L， 4 h 后吸去培养液，每孔各加入二甲基亚砜 200 μL，混匀，半小时后在自动酶标测定仪上测 540 nm (参考波长 655 nm) 处吸光值A[旧称光密度(OD)]。
细胞增殖抑制率＝(对照组A值-实验组A值)/对照组A值×100%
1.4 细胞活性测定及形态学观察 将第三代的正常细胞接种于培养瓶中，细胞数为每瓶 2.5×105 个/6 ml，培养液中Ver的浓度分别是 0 mg/L、10 mg/L、 40 mg/L、 80 mg/L，每种浓度设两瓶。用倒置显微镜观察细胞生长状况及形态并摄片，用 2% 台盼蓝染色，测定细胞活性。
, 百拇医药
1.5 数据处理 对实验结果分别采用方差分析，t检验，直线相关检验及直线回归方程处理。
2 结 果
2.1 应用单克隆鼠抗人细胞角蛋白(cytokeratin, CK)对培养的细胞进行免疫细胞化学鉴定，结果证明，培养的细胞对CK呈阳性反应，光学显微镜下观察，胞浆呈棕黄色，表明培养的细胞为RPE细胞。
2.2 维拉帕米对RPE细胞增殖的抑制作用 应用MTT比色法测得不同浓度Ver组及对照组在 540 nm 处吸光值A及细胞增长抑制率见附表。
附表 不同浓度Ver对RPE细胞增殖的抑制作用 Ver浓度
(mg/L)
吸光值A
, http://www.100md.com
细胞增殖抑制率
(%)
t
P
0
0.8548±0.0734
2.5
0.7140±0.0631
16.4749
3.5646
<0.005 1
5
0.6178±0.0759
, http://www.100md.com
27.7147
5.4970
<0.000 3
10
0.5612±0.0851
34.3537
6.3987
<0.000 1
20
0.5283±0.0359
38.1946
9.7849
, http://www.100md.com
<0.000 1
40
0.3422±0.0246
59.9727
16.2185
<0.000 1
80
0.1022±0.0396
88.0484
22.1023
<0.000 1
160
, http://www.100md.com
0.0255±0.0167
97.0170
26.9838
<0.000 1
注：t值为各浓度与未加药组(0)相比较的值
方差分析(F＝154.98，P＝0.0001)证明Ver在不同的浓度对RPE细胞的增殖抑制作用是不同的，结合t检验，Ver在各浓度组均使细胞增殖率显著下降，其作用随浓度的增加而增大。
将药物浓度取常用对数后作横坐标(X)，用细胞增殖抑制率作纵坐标(Y)，绘出(X，Y)散点图，发现呈直线趋势，故可进行直线相关及回归分析。直线相关分析求得Pearson相关系数r=0.967 4，P＝0.000 4，说明药物浓度与细胞增殖抑制率呈非常显著的正相关关系。直线回归分析求得直线回归方程为：Y＝40.835 4，F＝318.869 0，P＝0.000 1，此直线回归方程是成立的。由此方程求得Ver 50% 抑制浓度为：IC50＝16.765 9 mg/L。
, 百拇医药
2.3 维拉帕米对RPE细胞形态及活性的影响 对照组细胞生长旺盛，形状不规则，呈扁平多角形，中央有一圆形透明区为细胞核，周围布满黑色素颗粒。随着细胞增殖，长梭形细胞逐渐增多，常彼此紧密连接成单层细胞片，黑色素颗粒逐渐减少。第 5 次传代以后，细胞形状类似于成纤维细胞，但略大。用药组随药物浓度升高，细胞形态变化逐渐明显，呈圆形，见大量细胞膜及核膜溶解，核固缩、肿胀、核仁消失，未见核分裂相。维拉帕米浓度低于 40 mg/L 时，RPE细胞的活性未受影响，细胞活性>90%。当浓度高于 80 mg/L 时，细胞活性<50%，细胞生存受到影响，细胞形态开始发生变化，胞体常缩成圆形，细胞相互间隙增大，形态轮廓明显。
3 讨 论
PVR是视网膜脱离后最严重的并发症，也是其视力丧失的主要原因。细胞迁移、增殖、收缩是形成PVR的关键病理过程，抑制这些病理过程的发展可防止PVR的形成。PVR是一种多细胞介导性疾病，如RPE细胞、神经胶质细胞、成纤维细胞和巨噬细胞等，其中RPE细胞是PVR的主要细胞成分，在PVR的发生、发展过程中起重要作用〔1〕，而且RPE细胞对维持视网膜的正常结构和功能具有极其重要的生物学作用。近年来，国内外学者对多种药物，如抗代谢类、激素类对成纤维细胞的抑制作用进行了研究，但对直接抑制RPE细胞的研究尚不多，所以我们选用体外培养的兔RPE细胞，观察维拉帕米对RPE细胞的影响。
, http://www.100md.com
钙通道阻滞剂是一类能够阻断慢钙通道，减少细胞外液钙离子内流的药物。体外培养手术取出的视网膜前膜及下膜，发现 0.25 mg/L 的维拉帕米即能抑制细胞生长〔2〕。李秋明等〔3〕研究发现维拉帕米对体外培养的巩膜成纤维细胞的增殖有抑制作用。
我们选用临床上应用广泛的钙通道阻滞剂-维拉帕米，观察其对兔RPE细胞增殖的抑制作用。实验结果证明维拉帕米对血清诱导的兔RPE细胞增殖有明显的抑制作用，且呈明显的剂量依赖性。Ver浓度与其细胞增殖抑制作用呈非常显著的正相关关系。用 2% 台盼蓝染色法测定RPE细胞活性发现维拉帕米浓度在 80 mg/L 以上时，细胞活性<50%，细胞生存受到影响。目前，维拉帕米抑制RPE细胞增殖的作用机制还不甚清楚，本实验通过应用维拉帕米抑制细胞外钙内流降低细胞内游离Ca2+而抑制RPE细胞增殖，可以推测细胞内游离Ca2+浓度的增高可能是RPE细胞迁移和增殖的机制之一。Hackett等〔4〕认为，cAMP与RPE细胞的趋化、迁移和增殖关系密切，凡能降低细胞内cAMP水平的因素均可促进RPE细胞的迁移和增殖。由于细胞内Ca2+和cAMP存在着相互拮抗的关系，即细胞内Ca2+浓度增高就会导致cAMP的降低。结合本实验结果，维拉帕米抑制细胞外钙内流降低细胞内游离Ca2+在从而间接导致cAMP增高，因而抑制RPE细胞的增殖。推测维拉帕米可能通过间接影响细胞内第二信使-cAMP浓度的变化抑制RPE细胞增殖。另外，Kataoka等〔5〕研究发现PDGF诱导细胞增殖与蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)的激活有关，我们推测，Ver抑制RPE细胞增殖，通过抑制PKC通路也是其可能的作用机制之一。
, 百拇医药
细胞存活和增殖通常用3H-TdR掺入法及细胞计数法，前者使用放射性同位素易污染环境，后者易受主观因素的影响，误差较大。Mosmann〔6〕根据细胞增殖需要大量的能量，而细胞能量代谢的水平可以间接反映细胞增殖情况，创立了MTT比色分析法。MTT是一种四氮唑化合物，其分子结构中的四氮唑环可在活细胞线粒体作用下而断裂，而死亡细胞、红细胞及培养液则无此作用，裂解产物为紫色结晶，其数量与活细胞数量成正比。MTT法可免去细胞脱壁、冲洗、收集等步骤，同时可排除pH效应对结果的影响，只需加试剂，在自动酶标测定仪上自动测定和打印数据，免去人为因素的影响，使实验结果更可靠。另外，该法还具有简便、快速等特点，应用十分广泛。
参考文献
1 Campochiaro PA. Pathogenic mechanisms in proliferative vitreoretinopathy. Arch Ophthalmol, 1997， 115(2):237
, 百拇医药
2 Richer D, Hatvani I, Toth A. Growth inhibition of intraocular proliferative explants under in vitro conditions by verapamil. Klin Monatsbl Augenheilkd, 1993，203(1):206
3 李秋明，宋绣雯，刘新华等.维拉帕米对人巩膜成纤维细胞增殖的实验研究.中华眼底病杂志，1996，12(1)：98
4 Hackett S, friedman Z, Peter A. Cyclic 3′,5′-adenosine monophosphate modulates retinal pigment epithelil cell migration in vitro. Arch Ophthalmol, 1986，104(8):1688
5 Kataoka S, Alam R, Dash PK, et al. Inhibition of PDGF-mediated proliferation of vascular smooth muscle cells by calcium antagonists. Stroke, 1997， 28(2):364
6 Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular grouth and surrival: Application to proliferation and cytotoxicityassay. J Immunal Methods, 1983， 65(1):55
(1999—01—24收稿，1999—03—17修回), 百拇医药