急性白血病相关基因 WIT-1 的克隆及临床意义
作者：于力 Michael A Caligiuri
单位：于力 解放军总医院血液科，中国北京 100853；Michael A Caligiuri 俄亥俄大学附属医院血液科，美国哥伦布市 43210
关键词：RLGS；DNA甲基化；WIT-1；基因；急性髓细胞白血病
急性白血病相关基因 WIT 摘要 目的：克隆白血病相关基因及探讨白血病相关基因甲基化的临床意义。方法：应用新的分子克隆技术RLGS及Southern Blot技术自急性髓细胞白血病(AML)骨髓标本中克隆白血病相关基因并对该基因的甲基化进行检测。结果：克隆到一个长度为 221 bp 因Not Ⅰ酶切位点甲基化所致异常的DNA片段，序列分析结果表明其来源于急性白血病相关基因(WIT-1 基因)第二外显子，WIT-1 基因甲基化发生率在原发难治性AML中 (7/8) 明显高于对化疗敏感的AML (7/21)。结论：RLGS技术对于发现白血病相关基因是一种有效的方法，WIT-1 基因甲基化检测对估价AML化疗效果具有一定的临床意义。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 R 733.71
Cloning of leukemia associated gene WIT-1 and aberrant DNA methylation in acute myeloid leukemia
Li Yu, Michael A Caligiuri (Department of Hematology, General Hospital of PLA, Beijing 100853)
Abstract Objective:The purpose of this paper is to clone leukemia associated gene and investigates aberrant DNA methylation of this gene in acute myeloid leukemia (AML). Methods:The Restriction landmark genomic scanning (RLGS) and Southern Blot were performed on genomic DNA from AML bone marrow (BM) samples. Results:An abnormal 221 bp fragment due to a distinct DNA methylation on NotI site was cloned. Sequence analysis showed that the fragment represented a portion of exon 2 of the WIT-1 gene. Seven of 21 (33.3%) chemosensitive AML and 7 of 8 (87.5%) primary refractory AML showed methylation of WIT-1 gene. The incidence of WIT-1 methylation in primary refractory AML was significantly higher than that noted in chemosensitive AML. Conclusion:The results indicate that RLGS is a effective method to find leukemia associated gene in AML and that WIT-1 gene methylation analysis is important to estimate therapeutic response in AML.
, 百拇医药
Key words RLGS; DNA methylation; WIT-1 gene; AML
急性髓细胞白血病具有多种细胞遗传学异常，通常这些异常可以发现基因的融合或缺失，但是仍有约半数患者在基因水平的异常无法通过细胞遗传学发现〔1〕。RLGS技术(restriction landmark genomic scanning)可用来分析肿瘤细胞基因重排、缺失、点突变及甲基化，经点克隆(spot cloning)技术可以得到RLGS异常点内所含的DNA片段及与此相关的基因〔2，3〕。本研究应用RLGS技术克隆白血病相关基因并对其临床意义进行探讨。
1 材料和方法
1.1 标本 来源于按FAB标准诊断的急性非淋巴细胞白血病患者的骨髓，DNA按文献介绍方法提取〔4〕。
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1.2 RLGS 按文献介绍方法〔5〕，用 20 U内切酶NotⅠ(Promega)消化基因组DNA；用同位素p 32 进行末端标记。标记的DNA再经 20 U EcoRV(Promega)酶切，取 1.5 μg行 0.8% 琼脂糖凝胶管状电泳(第一维分离)。用 750 U Hinf Ⅰ(Promega)再次酶解胶中DNA，然后，行 5% 聚丙烯酰胺凝胶电泳(第二维分离)。将凝胶干燥后放射自显影。
1.3 RLGS点克隆 按文献介绍方法〔3〕，NotⅠ及EcoRV双酶解 500 μg 来源于正常骨髓细胞的DNA，用NotⅠ酶切接头(Trapper)从DNA酶解产物中纯化、收集NotⅠ-EcoRV片段，取其中 1/5 做末端标记后与其余部分混合，行RLGS电泳。将异常的点从RLGS凝胶中切除、洗脱及溶解于TE缓冲液中，利用PCR方法扩增洗脱液中的DNA片段，PCR产物被克隆进TA克隆载体(invitrogen)及进行DNA序列分析。
, 百拇医药
1.4 Southern印记杂交 用 20 U 的限制性内切酶消化 5 μg 的基因组DNA， 0.8% 琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，转移DNA至尼龙膜，标记探针及杂交，放射自显影〔4〕。
2 结 果
对 1 例急性髓细胞白血病患者不同病期(初治、缓解、复发)的骨髓标本分别进行RLGS检测，每一标本有 1 284 个点可供分析，通过不同病期标本RLGS结果的比较发现 8 个异常点，这些点在初治和缓解标本中存在而复发标本中消失，图 1 示其中一个异常点 RP 18。我们用点克隆技术克隆了这个在复发标本中缺失的点，获得一个 221 bp 异常的NotⅠ-HinfI DNA片段，将DNA序列分析结果与人类基因库比较发现这一片段来源于急性白血病相关基因(WIT-1基因，编号 X69950)的第二外显子 577～798 bp 处〔6〕。
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图1 RLGS结果
箭头示异常点RP18，此点在初治和缓解标本中存在而复发标本中消失
用该DNA片段作为探针，用EcoRV单独及EcoRV与NotⅠ双酶解基因组DNA并进行Southern印记杂交分析。图 2 示WIT-1 基因印记杂交结果，在对照组PBL(正常人外周血单个核细胞)中，单酶解标本可见一条 25 kb 的杂交带而双酶解标本此带消失；在初始和缓解中，可见与对照组类似结果；而在复发组中见两条相同长度的带(甲基化敏感酶NotⅠ不能切断DNA)，结合DNA序列分析结果表明在复发标本中位于此处的NotⅠ酶切位点被甲基化。另外，还用EcoRI分别与 5 种甲基化敏感酶(NotⅠ、BssHⅠ、SmaⅠ、HpaⅡ、HhaⅠ)结合，对这例患者不同病期(初治，缓解及复发)骨髓细胞基因组DNA进行双酶解，然后行Southern印记杂交分析，确定了此甲基化范围在WIT-1 基因第一内含子和第二外显子之间(待另文发表)。
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图2 Southern印记杂交结果
在对照组PBL中，EcoRV单酶解标本可见一条 25 kb 的杂交带而EcoRV+NotⅠ双酶解标本此带消失，在初治和缓解组中，可见与对照组类似结果，而在复发组中见两条相同长度的带
我们用Southern印记杂交技术对 21 例化疗敏感的AML患者初治期骨髓标本WIT-1 基因甲基化的情况进行了检测(附表)，结果证明 7 例 (33.3%) WIT-1 基因发生甲基化；21 例中有 4 例有复发期骨髓标本患者，其WIT-1 基因均发生甲基化，而其对应的初治标本仅 1 例甲基化；对 8 例原发难治性AML初治骨髓标本进行检测， 7 例 (87.5%) WIT-1 基因甲基化，其发生率明显高于化疗敏感的AML患者(P＝0.014， Fisher′s exact test)。对化疗敏感AML初治标本WIT-1 基因甲基化与完全缓解(CR)期关系进行分析，WIT-1 基因甲基化患者CR期中位时间 5.1 个月，而非甲基化患者 6.3 个月，两组患者CR期无显著差异(P<0.83， Kaplan Meier分析)。 9 例正常骨髓标本WIT-1 基因均无甲基化。
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WIT-1 基因位于Wilm′s Tumor (WT1)抗癌基因上游约 2 kb 处〔6〕，我们用RT-PCR分析了这两个基因在初治、缓解及复发标本中的表达，WIT-1 基因在所有标本未检测到表达，而WT1 基因在复发标本表达明显高于初治及缓解标本(结果未示)。
附表 AML患者骨髓标本WIT-1 基因甲基化检测
标本
甲基化
甲基化率
(%)
+
-
合计
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正常
0
9
9
0
初治
7
14
21
33.3
复发
4
0
4
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100
难治
7
1
8
87.5
3 讨 论
本研究表明RLGS是一种有效的基因克隆技术，与其他以PCR为基础的基因克隆方法相比有以下优点〔7，8〕：① 绝大多数在 2 维胶中被标记的DNA片段来源于基因 5′ 端序列而不是随机地来源于基因组DNA。 ② 可同时检测DNA的重排、突变和甲基化。 ③ 可对来源于同一标本的 1 000～1 200 个DNA片段进行分析，效率高、重复性好。 ④ 由于重复性好，可以利用富含DNA的参照胶或基因组DNA库来进行点克隆。
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白血病复发目前认为是由于在诱导及巩固治疗中产生的对化疗耐药白血病细胞株再次增殖所致，原发难治白血病是指白血病细胞在治疗前就已对化疗药物具有耐药性，复发及原发难治白血病某种程度上在耐药方面具有共同的分子水平异常特征。笔者通过对AML患者骨髓标本DNA甲基化检测发现，初治化疗敏感的标本WIT-1 基因甲基化占 33.3%，原发难治AML甲基化占 87.5%， 4 例复发标本WIT-1 基因均被甲基化。WIT-1 基因甲基化在估价白血病疗效方面可能具有一定的临床意义，但仍需对更多的临床标本进行分析。
WIT-1 基因产物以及在正常发育和肿瘤形成中的作用尚不明确。WIT-1 基因位于 WT1 抗癌基因上游 2 kb 处，在肾脏正常发育及Wilm瘤形成过程中两基因具有协同作用。有文献报道这两个基因拥有共同的启动子，朝不同方向进行转录〔6〕，尽管它们在正常组织中表达水平很低，但 WT1 基因在AML中具有高表达〔9〕。WT1 基因反义核苷酸可以明显抑制白血病细胞增殖，表明 WT1 基因在白血病发生中具有重要意义〔10〕。白血病WT1 基因表达调控的机制目前尚未明确，WIT-1 基因与 WT1 基因在白血病中可能不是同步表达而是由于 WIT-1 基因甲基化后通过某种特殊调节机制引起 WT1 基因的高表达，我们正在做这方面的研究以证实这一假设。
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本研究应用新的基因克隆技术RLGS自 1 例白血病患者骨髓标本中克隆出一白血病相关基因WIT-1，经DNA序列分析及Southern印记杂交证实为DNA甲基化所致基因异常，其甲基化发生率在原发难治性及复发AML中明显高于对化疗敏感的初治AML。结果表明RLGS对于发现白血病相关基因是一种有效的技术，WIT-1 基因甲基化在估价AML化疗效果具有一定的临床意义。
参考文献
1 Caligiuri MA, Strout MP, Gilliand DG. Molecular biology of acute myeloid leukemia. Semin Oncol, 1997,24(1):32
2 Issa JPJ, Baylin SB, Herman JG. DNA methylation changes in hematologic malignancies: biologic and clinical implication. Leukemia, 1997, 11 (Suppl):S7
, 百拇医药
3 Costello J F, Plass C, Arap W. Cyclin dependent kinase 6 (CDK6) amplification in human glioblastomas identified using two-dimensional separation of genomic DNA. Cancer Res, 1997, 57(7):1250
4 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Clonnig: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Lab Press: Plainview NY, 1989
5 Okazaki Y. A linkage map of the mouse using an expanded production system of the restriction landmark genomic scanning (RLGS Ver 1.8). Biochem Biophys Res Comm, 1995, 205(3):1922
, 百拇医药
6 Gessler M, Bruns GAP. Sequence of the WT1 upstram region including the Wit-1 gene. Genomics, 1993, 17(2):499
7 Gonzalgo ML, Liang G, Spruck CH. Identification and characterization of differentially methylated regions of genomic DNA by methylation-sensitive arbitrarily primed PCR. Cancer Res, 1997,57(4):594
8 Ushijima T, Morimura K, Hosoya Y et al. Establishment of methylation-sensitive-representational differences analysis and isolation of hypo-and hypermethylated genomic fragments in mouse liver tumors. Proc Natl Acad Sci USA, 1997,94(6):2284
, 百拇医药
9 Inoue K, Ogawa H., Sonoda Y. Aberrant overexpression of the Wilms tumor gene (WT1) in human leukemia. Blood, 1997, 89(4):1405
10 Yamagami T, Sugiyama H, Inoue K. Growth inhibition of human leukemic cells by WT1 (Wilms tumor gene) antisense oligodeoxynucleotides: implications for the involvement of WT1 in leukemogenesis. Blood, 1996, 87(7):2878
(1999—01—04收稿，1999—02—10修回), http://www.100md.com
单位：于力 解放军总医院血液科，中国北京 100853；Michael A Caligiuri 俄亥俄大学附属医院血液科，美国哥伦布市 43210
关键词：RLGS；DNA甲基化；WIT-1；基因；急性髓细胞白血病
急性白血病相关基因 WIT 摘要 目的：克隆白血病相关基因及探讨白血病相关基因甲基化的临床意义。方法：应用新的分子克隆技术RLGS及Southern Blot技术自急性髓细胞白血病(AML)骨髓标本中克隆白血病相关基因并对该基因的甲基化进行检测。结果：克隆到一个长度为 221 bp 因Not Ⅰ酶切位点甲基化所致异常的DNA片段，序列分析结果表明其来源于急性白血病相关基因(WIT-1 基因)第二外显子，WIT-1 基因甲基化发生率在原发难治性AML中 (7/8) 明显高于对化疗敏感的AML (7/21)。结论：RLGS技术对于发现白血病相关基因是一种有效的方法，WIT-1 基因甲基化检测对估价AML化疗效果具有一定的临床意义。
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中国图书资料分类法分类号 R 733.71
Cloning of leukemia associated gene WIT-1 and aberrant DNA methylation in acute myeloid leukemia
Li Yu, Michael A Caligiuri (Department of Hematology, General Hospital of PLA, Beijing 100853)
Abstract Objective:The purpose of this paper is to clone leukemia associated gene and investigates aberrant DNA methylation of this gene in acute myeloid leukemia (AML). Methods:The Restriction landmark genomic scanning (RLGS) and Southern Blot were performed on genomic DNA from AML bone marrow (BM) samples. Results:An abnormal 221 bp fragment due to a distinct DNA methylation on NotI site was cloned. Sequence analysis showed that the fragment represented a portion of exon 2 of the WIT-1 gene. Seven of 21 (33.3%) chemosensitive AML and 7 of 8 (87.5%) primary refractory AML showed methylation of WIT-1 gene. The incidence of WIT-1 methylation in primary refractory AML was significantly higher than that noted in chemosensitive AML. Conclusion:The results indicate that RLGS is a effective method to find leukemia associated gene in AML and that WIT-1 gene methylation analysis is important to estimate therapeutic response in AML.
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Key words RLGS; DNA methylation; WIT-1 gene; AML
急性髓细胞白血病具有多种细胞遗传学异常，通常这些异常可以发现基因的融合或缺失，但是仍有约半数患者在基因水平的异常无法通过细胞遗传学发现〔1〕。RLGS技术(restriction landmark genomic scanning)可用来分析肿瘤细胞基因重排、缺失、点突变及甲基化，经点克隆(spot cloning)技术可以得到RLGS异常点内所含的DNA片段及与此相关的基因〔2，3〕。本研究应用RLGS技术克隆白血病相关基因并对其临床意义进行探讨。
1 材料和方法
1.1 标本 来源于按FAB标准诊断的急性非淋巴细胞白血病患者的骨髓，DNA按文献介绍方法提取〔4〕。
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1.2 RLGS 按文献介绍方法〔5〕，用 20 U内切酶NotⅠ(Promega)消化基因组DNA；用同位素p 32 进行末端标记。标记的DNA再经 20 U EcoRV(Promega)酶切，取 1.5 μg行 0.8% 琼脂糖凝胶管状电泳(第一维分离)。用 750 U Hinf Ⅰ(Promega)再次酶解胶中DNA，然后，行 5% 聚丙烯酰胺凝胶电泳(第二维分离)。将凝胶干燥后放射自显影。
1.3 RLGS点克隆 按文献介绍方法〔3〕，NotⅠ及EcoRV双酶解 500 μg 来源于正常骨髓细胞的DNA，用NotⅠ酶切接头(Trapper)从DNA酶解产物中纯化、收集NotⅠ-EcoRV片段，取其中 1/5 做末端标记后与其余部分混合，行RLGS电泳。将异常的点从RLGS凝胶中切除、洗脱及溶解于TE缓冲液中，利用PCR方法扩增洗脱液中的DNA片段，PCR产物被克隆进TA克隆载体(invitrogen)及进行DNA序列分析。
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1.4 Southern印记杂交 用 20 U 的限制性内切酶消化 5 μg 的基因组DNA， 0.8% 琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，转移DNA至尼龙膜，标记探针及杂交，放射自显影〔4〕。
2 结 果
对 1 例急性髓细胞白血病患者不同病期(初治、缓解、复发)的骨髓标本分别进行RLGS检测，每一标本有 1 284 个点可供分析，通过不同病期标本RLGS结果的比较发现 8 个异常点，这些点在初治和缓解标本中存在而复发标本中消失，图 1 示其中一个异常点 RP 18。我们用点克隆技术克隆了这个在复发标本中缺失的点，获得一个 221 bp 异常的NotⅠ-HinfI DNA片段，将DNA序列分析结果与人类基因库比较发现这一片段来源于急性白血病相关基因(WIT-1基因，编号 X69950)的第二外显子 577～798 bp 处〔6〕。
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图1 RLGS结果
箭头示异常点RP18，此点在初治和缓解标本中存在而复发标本中消失
用该DNA片段作为探针，用EcoRV单独及EcoRV与NotⅠ双酶解基因组DNA并进行Southern印记杂交分析。图 2 示WIT-1 基因印记杂交结果，在对照组PBL(正常人外周血单个核细胞)中，单酶解标本可见一条 25 kb 的杂交带而双酶解标本此带消失；在初始和缓解中，可见与对照组类似结果；而在复发组中见两条相同长度的带(甲基化敏感酶NotⅠ不能切断DNA)，结合DNA序列分析结果表明在复发标本中位于此处的NotⅠ酶切位点被甲基化。另外，还用EcoRI分别与 5 种甲基化敏感酶(NotⅠ、BssHⅠ、SmaⅠ、HpaⅡ、HhaⅠ)结合，对这例患者不同病期(初治，缓解及复发)骨髓细胞基因组DNA进行双酶解，然后行Southern印记杂交分析，确定了此甲基化范围在WIT-1 基因第一内含子和第二外显子之间(待另文发表)。
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图2 Southern印记杂交结果
在对照组PBL中，EcoRV单酶解标本可见一条 25 kb 的杂交带而EcoRV+NotⅠ双酶解标本此带消失，在初治和缓解组中，可见与对照组类似结果，而在复发组中见两条相同长度的带
我们用Southern印记杂交技术对 21 例化疗敏感的AML患者初治期骨髓标本WIT-1 基因甲基化的情况进行了检测(附表)，结果证明 7 例 (33.3%) WIT-1 基因发生甲基化；21 例中有 4 例有复发期骨髓标本患者，其WIT-1 基因均发生甲基化，而其对应的初治标本仅 1 例甲基化；对 8 例原发难治性AML初治骨髓标本进行检测， 7 例 (87.5%) WIT-1 基因甲基化，其发生率明显高于化疗敏感的AML患者(P＝0.014， Fisher′s exact test)。对化疗敏感AML初治标本WIT-1 基因甲基化与完全缓解(CR)期关系进行分析，WIT-1 基因甲基化患者CR期中位时间 5.1 个月，而非甲基化患者 6.3 个月，两组患者CR期无显著差异(P<0.83， Kaplan Meier分析)。 9 例正常骨髓标本WIT-1 基因均无甲基化。
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WIT-1 基因位于Wilm′s Tumor (WT1)抗癌基因上游约 2 kb 处〔6〕，我们用RT-PCR分析了这两个基因在初治、缓解及复发标本中的表达，WIT-1 基因在所有标本未检测到表达，而WT1 基因在复发标本表达明显高于初治及缓解标本(结果未示)。
附表 AML患者骨髓标本WIT-1 基因甲基化检测
标本
甲基化
甲基化率
(%)
+
-
合计
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正常
0
9
9
0
初治
7
14
21
33.3
复发
4
0
4
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100
难治
7
1
8
87.5
3 讨 论
本研究表明RLGS是一种有效的基因克隆技术，与其他以PCR为基础的基因克隆方法相比有以下优点〔7，8〕：① 绝大多数在 2 维胶中被标记的DNA片段来源于基因 5′ 端序列而不是随机地来源于基因组DNA。 ② 可同时检测DNA的重排、突变和甲基化。 ③ 可对来源于同一标本的 1 000～1 200 个DNA片段进行分析，效率高、重复性好。 ④ 由于重复性好，可以利用富含DNA的参照胶或基因组DNA库来进行点克隆。
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白血病复发目前认为是由于在诱导及巩固治疗中产生的对化疗耐药白血病细胞株再次增殖所致，原发难治白血病是指白血病细胞在治疗前就已对化疗药物具有耐药性，复发及原发难治白血病某种程度上在耐药方面具有共同的分子水平异常特征。笔者通过对AML患者骨髓标本DNA甲基化检测发现，初治化疗敏感的标本WIT-1 基因甲基化占 33.3%，原发难治AML甲基化占 87.5%， 4 例复发标本WIT-1 基因均被甲基化。WIT-1 基因甲基化在估价白血病疗效方面可能具有一定的临床意义，但仍需对更多的临床标本进行分析。
WIT-1 基因产物以及在正常发育和肿瘤形成中的作用尚不明确。WIT-1 基因位于 WT1 抗癌基因上游 2 kb 处，在肾脏正常发育及Wilm瘤形成过程中两基因具有协同作用。有文献报道这两个基因拥有共同的启动子，朝不同方向进行转录〔6〕，尽管它们在正常组织中表达水平很低，但 WT1 基因在AML中具有高表达〔9〕。WT1 基因反义核苷酸可以明显抑制白血病细胞增殖，表明 WT1 基因在白血病发生中具有重要意义〔10〕。白血病WT1 基因表达调控的机制目前尚未明确，WIT-1 基因与 WT1 基因在白血病中可能不是同步表达而是由于 WIT-1 基因甲基化后通过某种特殊调节机制引起 WT1 基因的高表达，我们正在做这方面的研究以证实这一假设。
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本研究应用新的基因克隆技术RLGS自 1 例白血病患者骨髓标本中克隆出一白血病相关基因WIT-1，经DNA序列分析及Southern印记杂交证实为DNA甲基化所致基因异常，其甲基化发生率在原发难治性及复发AML中明显高于对化疗敏感的初治AML。结果表明RLGS对于发现白血病相关基因是一种有效的技术，WIT-1 基因甲基化在估价AML化疗效果具有一定的临床意义。
参考文献
1 Caligiuri MA, Strout MP, Gilliand DG. Molecular biology of acute myeloid leukemia. Semin Oncol, 1997,24(1):32
2 Issa JPJ, Baylin SB, Herman JG. DNA methylation changes in hematologic malignancies: biologic and clinical implication. Leukemia, 1997, 11 (Suppl):S7
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3 Costello J F, Plass C, Arap W. Cyclin dependent kinase 6 (CDK6) amplification in human glioblastomas identified using two-dimensional separation of genomic DNA. Cancer Res, 1997, 57(7):1250
4 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Clonnig: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Lab Press: Plainview NY, 1989
5 Okazaki Y. A linkage map of the mouse using an expanded production system of the restriction landmark genomic scanning (RLGS Ver 1.8). Biochem Biophys Res Comm, 1995, 205(3):1922
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6 Gessler M, Bruns GAP. Sequence of the WT1 upstram region including the Wit-1 gene. Genomics, 1993, 17(2):499
7 Gonzalgo ML, Liang G, Spruck CH. Identification and characterization of differentially methylated regions of genomic DNA by methylation-sensitive arbitrarily primed PCR. Cancer Res, 1997,57(4):594
8 Ushijima T, Morimura K, Hosoya Y et al. Establishment of methylation-sensitive-representational differences analysis and isolation of hypo-and hypermethylated genomic fragments in mouse liver tumors. Proc Natl Acad Sci USA, 1997,94(6):2284
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9 Inoue K, Ogawa H., Sonoda Y. Aberrant overexpression of the Wilms tumor gene (WT1) in human leukemia. Blood, 1997, 89(4):1405
10 Yamagami T, Sugiyama H, Inoue K. Growth inhibition of human leukemic cells by WT1 (Wilms tumor gene) antisense oligodeoxynucleotides: implications for the involvement of WT1 in leukemogenesis. Blood, 1996, 87(7):2878
(1999—01—04收稿，1999—02—10修回), http://www.100md.com