乙型肝炎病毒全基因序列的测定
作者:郭亚兵 侯金林 戴 炜 骆抗先 P.Karayiannis
单位:郭亚兵 侯金林 骆抗先 南方医院传染病科,广州 510515;戴 炜 深圳东湖医院,广东深圳;P.Karayiannis 英国伦敦St.Mary′s医学院肝病实验室,英国伦敦
关键词:乙型肝炎病毒;基因;序列
中国病毒学/990303 摘 要 测定7例慢性HBV携带者HBV基因组全序列,经同源性比较,确定基因型。2例基因型为B型,余均为C型;血清型adr 4例,adw 3例。各序列间X基因差异最大。未见A1896、T1762A1764等重要位点的变异。结合已有的2株HBV中国流行株全基因序列,初步建立以中国流行株序列为基础的HBV标准序列,该标准序列与国外标准序列仅有22个位点的差异。
, http://www.100md.com Sequencing of the Whole Gene of Hepatitis B Virus
Guo Yabin Hou Jinlin Dai Wei et al
(Department of Infectious Disease, Nanfang Hospital, Guangzhou 510515)
Abstract Seven cases of chronic hepatitis B virus carriers were included for sequencing of whole gene sequences of hepatitis B virus (HBV). The serotype of 4 strains of HBV were adr, and 3 strains were adw. Two strains were classified to genotype B, and the other 5 strains to genotype C. No significant mutations, such as A1896, T1762A1764 were present. With other reported 2 complete sequences of HBV strains prevailing in mainland China, 7 strains of HBV whole sequences of genotype C from mainland China were analyzed to produce the consensus sequence of HBV of China. Comparing of the consensus sequence with that from Genbank, there were only 22 sites with different nucleotides.
, 百拇医药
Key words Hepatitis B virus, Gene, Sequence
我国是HBV高流行区,其流行株与欧、美和日本等低流行区应有区别。建立我国HBV流行株的基因库和标准序列,是HBV变异研究的基础工作。现存HBV标准序列多是用国外流行株全序列,而我国HBV基因全序列仅有少数几例。为此目的,测定了7例我国华南及东北地区的慢性HBV携带者HBV基因全序列。
1 材料与方法
1.1 研究对象 7例慢性HBV携带者,诊断符合1995年全国肝病会议修订诊断标准。男6例,女1例,年龄25~37岁。华南地区3例,东北地区4例。HBV血清标志物:HBsAg(+)、HBeAg(+)、HBcAg(+),余项阴性。另2株HBV全序列分别来自文献[1]和[2]。
1.2 PCR扩增血清的HBV DNA 常规方法抽提血清中HBV DNA,用4对引物扩增相互重叠的片段,片段f1:S1/Pol-3,f2:Reg1/Reg2, f3:M3/3C,f4:4Ca/BCS3。引物序列见表1。
, http://www.100md.com
1.3 PCR产物直接测序 用PCR产物直接测序试剂盒(T7 version 2, USB美国), 按产品说明书进行。取10 μL PCR产物37 ℃ 15 min处理引物及游离核苷酸,85 ℃ 10 min后置于冰中用于测序反应。用不同的测序引物(表1)对HBV正、负链进行测序。结果用DNASIS分析软件处理。
2 结果
2.1 序列同源性比较 基因型:所测7株中有2株基因型为B型序(株间同源性为98.0%);5株基因型为C型(同源性95.7%~97.5%);B和C型间序列同源性为90%~91.5%。血清型:根据S基因编码第122位氨基酸(d/y亚型决定簇)及第160位氨基酸(w/r亚型决定族)标准[3],3例为adw,余为adr。另文献报道的2例基因型为C型。
表1 PCR和序列分析引物序列
, 百拇医药 Table 1 Oligonucleotide sequence of primers for PCR and sequencing 引物 Primer
位置 Location
核苷酸序列 Nucleotide sequence (5′~3′)
S1B
nt 157~177
ATGGAGAACATCACATCAGGA
Pol-3
nt 1409~1395
AAGGATCCAGTTGGC
, http://www.100md.com
Pol-6a
nt 781~797
GTGAGTCCCTTTATACC
2C
nt 2308~2291
TTGGTGGTCTATAGGCTG
Reg1
nt 942~960
CTCGAGCTCTGCTTTAGAAAACTTCCT
Reg2'
nt 1876~1859
, http://www.100md.com
AGAAAGCTTAACTTGGAGGCTTGAACAGT
M3
nt 1781~1791
CTGGGAGGAGTTGGGGGA
3C
nt 2439~2460
CTAACATTGAGATTCCCGAGA
4Ca
nt 2220~2237
GGCTTACTTTTGGAAGAG
BCS3
, 百拇医药
nt 669~689
GGCACTAGTAAACTGAGCCA
Po1-1
nt 912~895
GCAAAGTTCCCCCAACTTC
X1
nt 1298~1319
GCTCGCAGCAGGTCTGGAGCA
Po3'a
nt 1676~1662
GGAGTCCCAAGAGTCC
, 百拇医药
P2
nt 1826~1806
CCGGAAAGCTTGAGCTCTTCAAAAAGTTGCATGGTGCTGG
Pol-9
nt 1628~1642
GCCCCATCAGATCCCTG
Prec/C2
nt 1890~1912
CTTTGGGGCATGGACATTGAC
Pol-8
nt 2683~2665
, 百拇医药
AGGATAGAATCTAGCAGGC
Pol-7
nt 2882~2865
AAGATTCGTCCCCATGCC
Pol-11
nt 3183~3200
CCACTGCATGGCCTGAGG
Pol-5
nt 3137~3152
CAATCGGCAGTCAGG
Pcl
, 百拇医药
nt 1811~1824
GCGTTGGATCCGCACCATGCAACTT
CAGCTC is recognition site of SacI, AAGCTT is recognition site of HindⅢ.表2 中国HBV流行株C型间及C与B型间各基因区核酸、氨基酸序列同源性比较
Table 2 Homology comparison of nucleotide and amino
acid sequences of four gene open read frames (ORF)
of hepatitis B virus prevail in China within genotype C
, 百拇医药
and between genotype C and B HBV
ORF
C—C
C—B
nt(%)
aa(%)
nt(%)
aa(%)
S
98.6
95.6
93.7
, 百拇医药
89.9
C
97.9
98.0
96.4
97.2
X
94.0
91.8
91.7
89.0
P
97.0
, http://www.100md.com
96.8
90.5
92.0
C—C: Strains within genotype C.
C—B: Strains between genotype C and B.
nt: nucleotide. aa: amino acid.
2.2 各株间HBV基因区的差异性比较 结果见表2。C型间的5个HBV序列各基因区核苷酸及氨基酸序列同源性比较见表2。S、C及P基因区差异性较小(同源性95%~98%),而X区差异性较大(同源性91.8%)。
2.3 标准序列初步拟定 比较7株C型HBV全序列,在每一位点有5株(5/7)是相同的核苷酸,即列为标准序列。由此而初步拟定中国人感染的HBV C型标准序列(图1)。该标准序列与根据GenBank中国外HBV全序列建立的标准序列相比,在个别位点上有些差异(表3)。
, 百拇医药
图1 初步拟定的中国HBV流行株基因C型标准序列
Fig.1 Consensus sequence of genotype C of complete gene of hepatitis B virus which was produced
from seven whole gene sequences of HBV from Mainland China.
表3 中国大陆HBV基因C型标准序列与国外标准序列差异
Table 3 Comparison of hepatitis B virus consensus sequences of mainland China with that from Genbank Position
51
, 百拇医药
855
903
912
961
1053
1139
1165
1329
1332
1371
China
T
A
, 百拇医药
C
G
A
A
A
C
A
C
T
GenBank
A
T
T
A
, http://www.100md.com
G
G
C
T
C
T
C
Position
1383
1503
1636
1652
1719
, 百拇医药 2059
2070
2549
2652
2682
2702
China
A
A
A
G
G
C
A
, 百拇医药
C
T
A
A
GenBank
C
G
T
A
T
A
C
A
C
, http://www.100md.com
G
T
Position of putative EcoRI site is defined as 1.
3 讨论
我国HBsAg的流行率约为10%,南方高于北方,广东为15%;无症状携带者(AsC)是我国HBV传播的最重要的传染源。婴幼儿期主要通过母婴传播,是形成人群AsC和HBV贮存库的重要原因[4]。因此,我国AsC机制多是因婴幼儿期HBV感染形成的特异性免疫耐受或免疫低下。在这种宿主中,HBV毒株受到的免疫压力小,在漫长的感染过程中相对变异发生率低,能较确实地反映我国HBV流行株存在情况。
现有的我国9株HBV全序列,其基因型为C和B型,相应血清型为adr和adw。近年来根据HBV全序列的积累及全序列比较,将HBV分为7个基因型(A~F),同一基因型中序列同源性大于92%(差异性小于8%)。基因型和血清型间的关系:从基因分型角度看,不同血清型间仅是S基因区2个位点上的差异。因此,同一基因型内可有不同的血清型存在,而同一血清型可存在于不同的基因型中。如基因型C中可有3种血清型(adr、adw、ayr),而adw型可存在于基因型A、B、C、E中[5],ayw仅在B、D型中。我国HBV血清型主要为adr和adw,而推测我国流行的HBV毒株基因型主要为C和B型,现有结果支持这一推测。
, 百拇医药
HBV标准序列的建立是基于HBV全基因测序的积累。HBV标准序列的具体确定方法为:每一位点的核苷酸选择标准必须与80%的已知HBV毒株序列上相应位点的核苷酸相同[6]。当前我国已收集了9例无症状携带者HBV全序列,地区分布为:东北地区4例、广东地区3例、上海和北京各1例。我国地域广阔,民族众多,HBV流行株分布可能也不尽一致。要明确我国各地区(华东、华南、华西、华北、东北等)汉族人感染的HBV流行株序列特点,还有待积累更多的各地区HBV全序列资料。
根据我国HBV流性株(C基因型7株)初步拟定的标准序列,与国外C基因标准序列比较,有22个位点的差异,差异率为0.68%。这些位点的差异在既往研究中可能被视为变异。
参考文献
1 甘人宝,储美瑾,沈绿萍等.克隆的adr亚型乙型肝炎病毒基因(PADR-1)的核苷酸顺序.生物化学与生物物理学报,1984,16(3):316~319
, 百拇医药
2 琦祖和,阎捃,熊伟军等.乙型肝炎病毒adr NC-1 DNA的全顺序测定.中国科学B辑,1988,12:1300~1304
3 Courouce AM, Soulier JP. Subtypes of HBsAg in Europe and Africa. Bibl Haematol (Basel), 1976,42:52~57
4 骆抗先.第十二章 流行率.流行环节.见:乙型肝炎—基础和临床.北京:人民卫生出版社,1997.158~161
5 Norder H. Molecular basis of hepatitis B virus serotype variations within the four major subtypes. J Gen Virol, 1992,73:3141~3150
6 Magnius LO, Norder H. Subtypes, genotypes and molecular epidemiology of the hepatitis B virus as reflected by sequence variability of the S-gene. Intervirology, 1995, 38:24~34, 百拇医药
单位:郭亚兵 侯金林 骆抗先 南方医院传染病科,广州 510515;戴 炜 深圳东湖医院,广东深圳;P.Karayiannis 英国伦敦St.Mary′s医学院肝病实验室,英国伦敦
关键词:乙型肝炎病毒;基因;序列
中国病毒学/990303 摘 要 测定7例慢性HBV携带者HBV基因组全序列,经同源性比较,确定基因型。2例基因型为B型,余均为C型;血清型adr 4例,adw 3例。各序列间X基因差异最大。未见A1896、T1762A1764等重要位点的变异。结合已有的2株HBV中国流行株全基因序列,初步建立以中国流行株序列为基础的HBV标准序列,该标准序列与国外标准序列仅有22个位点的差异。
, http://www.100md.com Sequencing of the Whole Gene of Hepatitis B Virus
Guo Yabin Hou Jinlin Dai Wei et al
(Department of Infectious Disease, Nanfang Hospital, Guangzhou 510515)
Abstract Seven cases of chronic hepatitis B virus carriers were included for sequencing of whole gene sequences of hepatitis B virus (HBV). The serotype of 4 strains of HBV were adr, and 3 strains were adw. Two strains were classified to genotype B, and the other 5 strains to genotype C. No significant mutations, such as A1896, T1762A1764 were present. With other reported 2 complete sequences of HBV strains prevailing in mainland China, 7 strains of HBV whole sequences of genotype C from mainland China were analyzed to produce the consensus sequence of HBV of China. Comparing of the consensus sequence with that from Genbank, there were only 22 sites with different nucleotides.
, 百拇医药
Key words Hepatitis B virus, Gene, Sequence
我国是HBV高流行区,其流行株与欧、美和日本等低流行区应有区别。建立我国HBV流行株的基因库和标准序列,是HBV变异研究的基础工作。现存HBV标准序列多是用国外流行株全序列,而我国HBV基因全序列仅有少数几例。为此目的,测定了7例我国华南及东北地区的慢性HBV携带者HBV基因全序列。
1 材料与方法
1.1 研究对象 7例慢性HBV携带者,诊断符合1995年全国肝病会议修订诊断标准。男6例,女1例,年龄25~37岁。华南地区3例,东北地区4例。HBV血清标志物:HBsAg(+)、HBeAg(+)、HBcAg(+),余项阴性。另2株HBV全序列分别来自文献[1]和[2]。
1.2 PCR扩增血清的HBV DNA 常规方法抽提血清中HBV DNA,用4对引物扩增相互重叠的片段,片段f1:S1/Pol-3,f2:Reg1/Reg2, f3:M3/3C,f4:4Ca/BCS3。引物序列见表1。
, http://www.100md.com
1.3 PCR产物直接测序 用PCR产物直接测序试剂盒(T7 version 2, USB美国), 按产品说明书进行。取10 μL PCR产物37 ℃ 15 min处理引物及游离核苷酸,85 ℃ 10 min后置于冰中用于测序反应。用不同的测序引物(表1)对HBV正、负链进行测序。结果用DNASIS分析软件处理。
2 结果
2.1 序列同源性比较 基因型:所测7株中有2株基因型为B型序(株间同源性为98.0%);5株基因型为C型(同源性95.7%~97.5%);B和C型间序列同源性为90%~91.5%。血清型:根据S基因编码第122位氨基酸(d/y亚型决定簇)及第160位氨基酸(w/r亚型决定族)标准[3],3例为adw,余为adr。另文献报道的2例基因型为C型。
表1 PCR和序列分析引物序列
, 百拇医药 Table 1 Oligonucleotide sequence of primers for PCR and sequencing 引物 Primer
位置 Location
核苷酸序列 Nucleotide sequence (5′~3′)
S1B
nt 157~177
ATGGAGAACATCACATCAGGA
Pol-3
nt 1409~1395
AAGGATCCAGTTGGC
, http://www.100md.com
Pol-6a
nt 781~797
GTGAGTCCCTTTATACC
2C
nt 2308~2291
TTGGTGGTCTATAGGCTG
Reg1
nt 942~960
CTCGAGCTCTGCTTTAGAAAACTTCCT
Reg2'
nt 1876~1859
, http://www.100md.com
AGAAAGCTTAACTTGGAGGCTTGAACAGT
M3
nt 1781~1791
CTGGGAGGAGTTGGGGGA
3C
nt 2439~2460
CTAACATTGAGATTCCCGAGA
4Ca
nt 2220~2237
GGCTTACTTTTGGAAGAG
BCS3
, 百拇医药
nt 669~689
GGCACTAGTAAACTGAGCCA
Po1-1
nt 912~895
GCAAAGTTCCCCCAACTTC
X1
nt 1298~1319
GCTCGCAGCAGGTCTGGAGCA
Po3'a
nt 1676~1662
GGAGTCCCAAGAGTCC
, 百拇医药
P2
nt 1826~1806
CCGGAAAGCTTGAGCTCTTCAAAAAGTTGCATGGTGCTGG
Pol-9
nt 1628~1642
GCCCCATCAGATCCCTG
Prec/C2
nt 1890~1912
CTTTGGGGCATGGACATTGAC
Pol-8
nt 2683~2665
, 百拇医药
AGGATAGAATCTAGCAGGC
Pol-7
nt 2882~2865
AAGATTCGTCCCCATGCC
Pol-11
nt 3183~3200
CCACTGCATGGCCTGAGG
Pol-5
nt 3137~3152
CAATCGGCAGTCAGG
Pcl
, 百拇医药
nt 1811~1824
GCGTTGGATCCGCACCATGCAACTT
CAGCTC is recognition site of SacI, AAGCTT is recognition site of HindⅢ.表2 中国HBV流行株C型间及C与B型间各基因区核酸、氨基酸序列同源性比较
Table 2 Homology comparison of nucleotide and amino
acid sequences of four gene open read frames (ORF)
of hepatitis B virus prevail in China within genotype C
, 百拇医药
and between genotype C and B HBV
ORF
C—C
C—B
nt(%)
aa(%)
nt(%)
aa(%)
S
98.6
95.6
93.7
, 百拇医药
89.9
C
97.9
98.0
96.4
97.2
X
94.0
91.8
91.7
89.0
P
97.0
, http://www.100md.com
96.8
90.5
92.0
C—C: Strains within genotype C.
C—B: Strains between genotype C and B.
nt: nucleotide. aa: amino acid.
2.2 各株间HBV基因区的差异性比较 结果见表2。C型间的5个HBV序列各基因区核苷酸及氨基酸序列同源性比较见表2。S、C及P基因区差异性较小(同源性95%~98%),而X区差异性较大(同源性91.8%)。
2.3 标准序列初步拟定 比较7株C型HBV全序列,在每一位点有5株(5/7)是相同的核苷酸,即列为标准序列。由此而初步拟定中国人感染的HBV C型标准序列(图1)。该标准序列与根据GenBank中国外HBV全序列建立的标准序列相比,在个别位点上有些差异(表3)。
, 百拇医药
图1 初步拟定的中国HBV流行株基因C型标准序列
Fig.1 Consensus sequence of genotype C of complete gene of hepatitis B virus which was produced
from seven whole gene sequences of HBV from Mainland China.
表3 中国大陆HBV基因C型标准序列与国外标准序列差异
Table 3 Comparison of hepatitis B virus consensus sequences of mainland China with that from Genbank Position
51
, 百拇医药
855
903
912
961
1053
1139
1165
1329
1332
1371
China
T
A
, 百拇医药
C
G
A
A
A
C
A
C
T
GenBank
A
T
T
A
, http://www.100md.com
G
G
C
T
C
T
C
Position
1383
1503
1636
1652
1719
, 百拇医药 2059
2070
2549
2652
2682
2702
China
A
A
A
G
G
C
A
, 百拇医药
C
T
A
A
GenBank
C
G
T
A
T
A
C
A
C
, http://www.100md.com
G
T
Position of putative EcoRI site is defined as 1.
3 讨论
我国HBsAg的流行率约为10%,南方高于北方,广东为15%;无症状携带者(AsC)是我国HBV传播的最重要的传染源。婴幼儿期主要通过母婴传播,是形成人群AsC和HBV贮存库的重要原因[4]。因此,我国AsC机制多是因婴幼儿期HBV感染形成的特异性免疫耐受或免疫低下。在这种宿主中,HBV毒株受到的免疫压力小,在漫长的感染过程中相对变异发生率低,能较确实地反映我国HBV流行株存在情况。
现有的我国9株HBV全序列,其基因型为C和B型,相应血清型为adr和adw。近年来根据HBV全序列的积累及全序列比较,将HBV分为7个基因型(A~F),同一基因型中序列同源性大于92%(差异性小于8%)。基因型和血清型间的关系:从基因分型角度看,不同血清型间仅是S基因区2个位点上的差异。因此,同一基因型内可有不同的血清型存在,而同一血清型可存在于不同的基因型中。如基因型C中可有3种血清型(adr、adw、ayr),而adw型可存在于基因型A、B、C、E中[5],ayw仅在B、D型中。我国HBV血清型主要为adr和adw,而推测我国流行的HBV毒株基因型主要为C和B型,现有结果支持这一推测。
, 百拇医药
HBV标准序列的建立是基于HBV全基因测序的积累。HBV标准序列的具体确定方法为:每一位点的核苷酸选择标准必须与80%的已知HBV毒株序列上相应位点的核苷酸相同[6]。当前我国已收集了9例无症状携带者HBV全序列,地区分布为:东北地区4例、广东地区3例、上海和北京各1例。我国地域广阔,民族众多,HBV流行株分布可能也不尽一致。要明确我国各地区(华东、华南、华西、华北、东北等)汉族人感染的HBV流行株序列特点,还有待积累更多的各地区HBV全序列资料。
根据我国HBV流性株(C基因型7株)初步拟定的标准序列,与国外C基因标准序列比较,有22个位点的差异,差异率为0.68%。这些位点的差异在既往研究中可能被视为变异。
参考文献
1 甘人宝,储美瑾,沈绿萍等.克隆的adr亚型乙型肝炎病毒基因(PADR-1)的核苷酸顺序.生物化学与生物物理学报,1984,16(3):316~319
, 百拇医药
2 琦祖和,阎捃,熊伟军等.乙型肝炎病毒adr NC-1 DNA的全顺序测定.中国科学B辑,1988,12:1300~1304
3 Courouce AM, Soulier JP. Subtypes of HBsAg in Europe and Africa. Bibl Haematol (Basel), 1976,42:52~57
4 骆抗先.第十二章 流行率.流行环节.见:乙型肝炎—基础和临床.北京:人民卫生出版社,1997.158~161
5 Norder H. Molecular basis of hepatitis B virus serotype variations within the four major subtypes. J Gen Virol, 1992,73:3141~3150
6 Magnius LO, Norder H. Subtypes, genotypes and molecular epidemiology of the hepatitis B virus as reflected by sequence variability of the S-gene. Intervirology, 1995, 38:24~34, 百拇医药