自体软骨移植的实验研究
作者：杨光成 司徒朴 刘春利 陈兵 张余光
单位：杨光成，刘春利 广州军区广州总医院整形外科 510010；司徒朴，陈兵，张余光 第一军医大学珠江医院整形外科
关键词：自体移植；聚乳酸；软骨
New Page 1【摘要】 目的 探索能促进自体移植软骨生长的新途径。方法 将兔耳软骨切割成大小为1.5 mm×1.5 mm的耳软骨片，均匀地涂布在具有三维空间结构的聚乳酸泡沫支架上，然后将此复合物埋植于兔背皮下，分别于移植后3、6个月取出标本，行大体观察及显微镜下检查。结果 3，6个月后所有植入块均有不同程度的软骨形成，软骨边缘可见有新生软骨，软骨细胞增生活跃，以6个月的软骨量较多。结论 软骨在聚乳酸泡沫上具有生长潜能。
Experimental study of cartilage autograft
, 百拇医药
Yang Guangcheng, Situ Pu, Liu Chunli,et al.
Department of Plastic Surgery,General Hospital of Guang Zhou Military Region ,Guang Zhou 510010
【Abstract】 Objective To investigate a new method to promote the growth potential of cartilage autograft.Methods Rabbit's auricular cartilage without perichondrium was cut into 1.5 mm×1.5 mm nieces, which were smeared on the three dimensional polylactic acid(PLA) foams, then implanted into subcutaneous pocket. The implants were taken out at 3rd and 6th month respectively, thespecimens were used for gross inspection and histological analysis.Result All implants showed variant degree of cartilage hyperplasia, especially at 6th month. New cartilage was formed around the original cartilage, and the cartilage cells became active.Conclusion Cartilage had great growth potential at PLA scaffolds.
, http://www.100md.com
【key words】 Autografts Polylactic acid Cartilage
软骨移植在临床上常用于隆鼻及小耳再造等，并取得了良好的效果。软骨移植后是否能生长一直是为众所关心。以往学者认为外伤后的软骨不具有增生能力，只是仍保持活性[1]。近年来有实验证实移植带有或不带有软骨膜的软骨，其原位与异位均有不同程度生长[3]，只是带有软骨膜的软骨比不带者有更显著的软骨增生[2]。本实验将去软骨膜的耳软骨片种植于聚乳酸(polylactic acid，PLA)支架上，软骨表现出很强的增生能力。
材料与方法
1.实验动物：新西兰大白兔12只，平均体重1.0～1.5 kg，平均兔龄5周。
2.PLA：广州中山大学高分子研究所提供，粘均分子量60 000 Da，为固体块状，无微孔结构。
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3.聚乳酸泡沫材料的制备：PLA与二氧六环按重量体积1∶9(g/ml)比例搅拌均匀，置于-70 ℃低温冷冻干燥机内干燥48小时，见PLA呈多孔状，质软，机械强度差。再将PLA置于70 ℃真空干燥箱内干燥，抽取全部有机溶剂，制成较为均匀的PLA泡沫，孔径大小平均为2 mm，孔隙率约为75 %，抗压强度大，质地较硬，韧性强。
4.手术方法：术前12 h以紫外线消毒PLA泡沫，备用[5]。2 %戊巴比妥钠30～40 mg/kg右耳缘静脉注射麻醉后，左耳备皮，消毒、铺巾。距两侧耳缘1 cm、近端3 cm、远端1 cm，作全层棱形切除，大小6 cm×3 cm，用眼科剪剃除离体耳组织皮肤、皮下组织及软骨膜，按照纵行条块状剪碎耳软骨，平均测量值为1.5 mm×1.5 mm，将软骨片均匀地涂布在PLA孔内。于背部皮下埋植。术后3日内，每日肌注青霉素40万u。
5.检查方法：分别于移植后3、6个月取出标本，先作大体观察。10 %福尔马林固定后的标本由于PLA支架的存在影响病理切片，将植入块用手术刀切成5 mm×5 mm大小，暴露横断面，用二氧六环有机溶剂溶解、软化PLA支架3分钟。待有机溶剂挥发后，标本脱水，石蜡包埋，HE染色，切成5 μm厚切片行光镜观察。
, 百拇医药
结果
1.大体观察：3个月PLA支架完整，质地硬。6个月PLA支架尚完整，泡沫空间结构维持良好，质地软，表面可见血管及新生软骨块，其横断面可见团块状新生软骨块。
2.显微镜下检查：3个月软骨保持活性，软骨断缘与表面细胞增生活跃，层次增加，可见细胞分裂，双核细胞，基质嗜酸性，细胞呈圆形，部分细胞增生呈舌状延伸至被包绕的纤维结缔组织内，细胞间距缩小。软骨附近可见孤立的、完全是增生的软骨组织，未见有软骨吸收、坏死征象。近PLA侧有软骨增生及幼稚细胞。6个月类似3个月所见上述征象，而细胞层次及成熟软骨细胞增加，出现陷窝，孤立的新增生软骨组织数量增加(图1，2)。
图1 3个月软骨边缘可见新生软骨组织，HE染色×150
, 百拇医药
图2 6个月软骨边缘可见新生软骨组织，数量增加，HE染色×150
讨论
本实验采用4～6周龄兔，发育生长已基本稳定，而幼龄兔尚处在生长发育过程中。软骨片去除软骨膜，因为临床上用自体软骨隆鼻、组织充填及全耳再造病例以青年人较多见，且取软骨时一般惯例均将软骨膜原位保留。现就以下问题进行讨论。
1.影响新生软骨形成的因素：基材上软骨形成并不均匀一致，可能与下列因素有关：①细胞聚合物不同部位的血供不同直接影响到软骨增生。在切取标本时见所有组织-PLA聚合物表面均覆盖一层纤维组织，有少量新生血管分布，可见血管及毛细血管丰富的部位软骨增生明显。Upton等[6]利用耳软骨膜修复关节软骨的动物实验中显示软骨形成的量和值并不确定，认为新生软骨受年龄、受区血供等影响，因为体外软骨细胞培养时，培养液中加入血清成分可促进软骨细胞增生。Ohlsen[4]将软骨膜移植到不同解剖部位，如肌肉、肝、脾下等，发现血供欠佳的部位很少有新生软骨形成，认为血供起决定性作用。日本学者Mutaf等[7]的实验表明，扩张后的皮肤血供明显增加，是移植的软骨出现不同程度增生的主要原因。②不均匀的PLA泡沫材料及软骨片涂布不均匀可导致不同部位软骨增生的不一致。
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2. 软骨生长方式：①软骨生长有两种独立的但又是同时进行的生长方式[8]：一种为软骨内生长，是依靠软骨细胞分化增生及分泌基质完成；另一种为软骨膜下生长，来自软骨膜下的软骨细胞增生软骨平行生长。本实验中移植软骨横断面与正常软骨横断面相比较，细胞层次无差异，厚度相近，平行于软骨表面的棱形细胞密度增加。促进了软骨面积的增加，提示无软骨膜的软骨表面同样具有软骨生长的潜能，软骨膜不是成软骨的必须因素。各软骨块锐利的横断缘在移植后3个月后开始变圆、光滑，软骨增生活跃，横断缘未见组织变性、坏死，软骨细胞的增生及其所分泌的间质增加导致了软骨断缘的生长。②周围间质细胞可能受到某些因素的影响而增生分化，逐渐移行为软骨细胞和软骨组织[9]。
3.软骨生长机理的初步探讨：成年兔耳软骨异位具有增生现象，显然移位移植并不改变其增生潜能。我们认为是：①PLA泡沫移植于动物体内后由于血供的变化、炎症反应等为软骨块提供了新的生存环境。②受锐利切割后的软骨断缘受到各种因素的激活，尤其是组织液中已存在的刺激因素或炎症介质[4]；断缘附近肉芽组织中成纤维细胞可受到软骨刺激而转化为软骨细胞[9]，PLA→中胚层C→成骨或软骨C转化。③软骨膜与软骨失去接触，解除了接触抑制，进而刺激了软骨表面有潜在生长能力的细胞[2]。对于软骨移植后的确切生长机理尚有待进一步研究。
, 百拇医药
本课题为国家自然科学基金资助项目
参考文献
1 Young F.Autogenous cartilage grafts:An experiments study.Surg,1941,14:7-19.
2 Dupertuis SM.Actual growth of young cartilage transplants in rabbits.Arch Surg,1941,41:32-62.
3 Stoll D,Furnas DW.The growth of cartilage transplants in baby rabbits.Plast Recontr Surg,1970,45:356-359.
4 Ohlsen L.Cartilage formation from free perichondrial grafts:An experimental study in rabbits.Br J Plast Reconstr Surg,1976:262.
, 百拇医药
5 Athanasiou KA,Niederauer GG.Sterilization,toxicity, biocompatibility and clinical applications of polylactic acid/polyglycolic acid copolymers. Biomaterials,1996,17:93-97.
6 Upton J,Sohn SA,Glowack J.Neocartilage derived from transplanted perichondrium: What is it? Plast Reconstr Surg,1981,68:166-172.
7 Mutaf M,Celebioglu S,Sensoz O.Growth potential of autogenous cartilage grafts in expanded skin:An experimental study in rabbits.Ann Plast Surg,1994, 32:126-131.
8 Eisemann ML.The growth potential of autograft cartilage:an experiment study.Arch Otolaryngol,1983,109:469-472.
9 布卢姆.W,福西特.D.W主编,(王绍仁译).组织学.第一版.北京：科学出版社,1984.227-239.
收稿：1998-09-30 修回：1999-07-28, 百拇医药
单位：杨光成，刘春利 广州军区广州总医院整形外科 510010；司徒朴，陈兵，张余光 第一军医大学珠江医院整形外科
关键词：自体移植；聚乳酸；软骨
New Page 1【摘要】 目的 探索能促进自体移植软骨生长的新途径。方法 将兔耳软骨切割成大小为1.5 mm×1.5 mm的耳软骨片，均匀地涂布在具有三维空间结构的聚乳酸泡沫支架上，然后将此复合物埋植于兔背皮下，分别于移植后3、6个月取出标本，行大体观察及显微镜下检查。结果 3，6个月后所有植入块均有不同程度的软骨形成，软骨边缘可见有新生软骨，软骨细胞增生活跃，以6个月的软骨量较多。结论 软骨在聚乳酸泡沫上具有生长潜能。
Experimental study of cartilage autograft
, 百拇医药
Yang Guangcheng, Situ Pu, Liu Chunli,et al.
Department of Plastic Surgery,General Hospital of Guang Zhou Military Region ,Guang Zhou 510010
【Abstract】 Objective To investigate a new method to promote the growth potential of cartilage autograft.Methods Rabbit's auricular cartilage without perichondrium was cut into 1.5 mm×1.5 mm nieces, which were smeared on the three dimensional polylactic acid(PLA) foams, then implanted into subcutaneous pocket. The implants were taken out at 3rd and 6th month respectively, thespecimens were used for gross inspection and histological analysis.Result All implants showed variant degree of cartilage hyperplasia, especially at 6th month. New cartilage was formed around the original cartilage, and the cartilage cells became active.Conclusion Cartilage had great growth potential at PLA scaffolds.
, http://www.100md.com
【key words】 Autografts Polylactic acid Cartilage
软骨移植在临床上常用于隆鼻及小耳再造等，并取得了良好的效果。软骨移植后是否能生长一直是为众所关心。以往学者认为外伤后的软骨不具有增生能力，只是仍保持活性[1]。近年来有实验证实移植带有或不带有软骨膜的软骨，其原位与异位均有不同程度生长[3]，只是带有软骨膜的软骨比不带者有更显著的软骨增生[2]。本实验将去软骨膜的耳软骨片种植于聚乳酸(polylactic acid，PLA)支架上，软骨表现出很强的增生能力。
材料与方法
1.实验动物：新西兰大白兔12只，平均体重1.0～1.5 kg，平均兔龄5周。
2.PLA：广州中山大学高分子研究所提供，粘均分子量60 000 Da，为固体块状，无微孔结构。
, http://www.100md.com
3.聚乳酸泡沫材料的制备：PLA与二氧六环按重量体积1∶9(g/ml)比例搅拌均匀，置于-70 ℃低温冷冻干燥机内干燥48小时，见PLA呈多孔状，质软，机械强度差。再将PLA置于70 ℃真空干燥箱内干燥，抽取全部有机溶剂，制成较为均匀的PLA泡沫，孔径大小平均为2 mm，孔隙率约为75 %，抗压强度大，质地较硬，韧性强。
4.手术方法：术前12 h以紫外线消毒PLA泡沫，备用[5]。2 %戊巴比妥钠30～40 mg/kg右耳缘静脉注射麻醉后，左耳备皮，消毒、铺巾。距两侧耳缘1 cm、近端3 cm、远端1 cm，作全层棱形切除，大小6 cm×3 cm，用眼科剪剃除离体耳组织皮肤、皮下组织及软骨膜，按照纵行条块状剪碎耳软骨，平均测量值为1.5 mm×1.5 mm，将软骨片均匀地涂布在PLA孔内。于背部皮下埋植。术后3日内，每日肌注青霉素40万u。
5.检查方法：分别于移植后3、6个月取出标本，先作大体观察。10 %福尔马林固定后的标本由于PLA支架的存在影响病理切片，将植入块用手术刀切成5 mm×5 mm大小，暴露横断面，用二氧六环有机溶剂溶解、软化PLA支架3分钟。待有机溶剂挥发后，标本脱水，石蜡包埋，HE染色，切成5 μm厚切片行光镜观察。
, 百拇医药
结果
1.大体观察：3个月PLA支架完整，质地硬。6个月PLA支架尚完整，泡沫空间结构维持良好，质地软，表面可见血管及新生软骨块，其横断面可见团块状新生软骨块。
2.显微镜下检查：3个月软骨保持活性，软骨断缘与表面细胞增生活跃，层次增加，可见细胞分裂，双核细胞，基质嗜酸性，细胞呈圆形，部分细胞增生呈舌状延伸至被包绕的纤维结缔组织内，细胞间距缩小。软骨附近可见孤立的、完全是增生的软骨组织，未见有软骨吸收、坏死征象。近PLA侧有软骨增生及幼稚细胞。6个月类似3个月所见上述征象，而细胞层次及成熟软骨细胞增加，出现陷窝，孤立的新增生软骨组织数量增加(图1，2)。
图1 3个月软骨边缘可见新生软骨组织，HE染色×150
, 百拇医药
图2 6个月软骨边缘可见新生软骨组织，数量增加，HE染色×150
讨论
本实验采用4～6周龄兔，发育生长已基本稳定，而幼龄兔尚处在生长发育过程中。软骨片去除软骨膜，因为临床上用自体软骨隆鼻、组织充填及全耳再造病例以青年人较多见，且取软骨时一般惯例均将软骨膜原位保留。现就以下问题进行讨论。
1.影响新生软骨形成的因素：基材上软骨形成并不均匀一致，可能与下列因素有关：①细胞聚合物不同部位的血供不同直接影响到软骨增生。在切取标本时见所有组织-PLA聚合物表面均覆盖一层纤维组织，有少量新生血管分布，可见血管及毛细血管丰富的部位软骨增生明显。Upton等[6]利用耳软骨膜修复关节软骨的动物实验中显示软骨形成的量和值并不确定，认为新生软骨受年龄、受区血供等影响，因为体外软骨细胞培养时，培养液中加入血清成分可促进软骨细胞增生。Ohlsen[4]将软骨膜移植到不同解剖部位，如肌肉、肝、脾下等，发现血供欠佳的部位很少有新生软骨形成，认为血供起决定性作用。日本学者Mutaf等[7]的实验表明，扩张后的皮肤血供明显增加，是移植的软骨出现不同程度增生的主要原因。②不均匀的PLA泡沫材料及软骨片涂布不均匀可导致不同部位软骨增生的不一致。
, http://www.100md.com
2. 软骨生长方式：①软骨生长有两种独立的但又是同时进行的生长方式[8]：一种为软骨内生长，是依靠软骨细胞分化增生及分泌基质完成；另一种为软骨膜下生长，来自软骨膜下的软骨细胞增生软骨平行生长。本实验中移植软骨横断面与正常软骨横断面相比较，细胞层次无差异，厚度相近，平行于软骨表面的棱形细胞密度增加。促进了软骨面积的增加，提示无软骨膜的软骨表面同样具有软骨生长的潜能，软骨膜不是成软骨的必须因素。各软骨块锐利的横断缘在移植后3个月后开始变圆、光滑，软骨增生活跃，横断缘未见组织变性、坏死，软骨细胞的增生及其所分泌的间质增加导致了软骨断缘的生长。②周围间质细胞可能受到某些因素的影响而增生分化，逐渐移行为软骨细胞和软骨组织[9]。
3.软骨生长机理的初步探讨：成年兔耳软骨异位具有增生现象，显然移位移植并不改变其增生潜能。我们认为是：①PLA泡沫移植于动物体内后由于血供的变化、炎症反应等为软骨块提供了新的生存环境。②受锐利切割后的软骨断缘受到各种因素的激活，尤其是组织液中已存在的刺激因素或炎症介质[4]；断缘附近肉芽组织中成纤维细胞可受到软骨刺激而转化为软骨细胞[9]，PLA→中胚层C→成骨或软骨C转化。③软骨膜与软骨失去接触，解除了接触抑制，进而刺激了软骨表面有潜在生长能力的细胞[2]。对于软骨移植后的确切生长机理尚有待进一步研究。
, 百拇医药
本课题为国家自然科学基金资助项目
参考文献
1 Young F.Autogenous cartilage grafts:An experiments study.Surg,1941,14:7-19.
2 Dupertuis SM.Actual growth of young cartilage transplants in rabbits.Arch Surg,1941,41:32-62.
3 Stoll D,Furnas DW.The growth of cartilage transplants in baby rabbits.Plast Recontr Surg,1970,45:356-359.
4 Ohlsen L.Cartilage formation from free perichondrial grafts:An experimental study in rabbits.Br J Plast Reconstr Surg,1976:262.
, 百拇医药
5 Athanasiou KA,Niederauer GG.Sterilization,toxicity, biocompatibility and clinical applications of polylactic acid/polyglycolic acid copolymers. Biomaterials,1996,17:93-97.
6 Upton J,Sohn SA,Glowack J.Neocartilage derived from transplanted perichondrium: What is it? Plast Reconstr Surg,1981,68:166-172.
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8 Eisemann ML.The growth potential of autograft cartilage:an experiment study.Arch Otolaryngol,1983,109:469-472.
9 布卢姆.W,福西特.D.W主编,(王绍仁译).组织学.第一版.北京：科学出版社,1984.227-239.
收稿：1998-09-30 修回：1999-07-28, 百拇医药