逆转录-聚合酶链反应用于肾综合征出血热病毒基因分型诊断
作者：郑曲波 李灼亮 罗端德 曾令兰
单位：
关键词：
中华传染病杂志990318 目前，用于肾综合征出血热病毒(HFRSV)分型的方法主要是空斑减少中和试验(PRNT)。由于操作过于复杂与繁琐，仅用于实验研究。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)是以RNA为模板，联合RT与PCR，具有快速、简便、灵敏、特异等优点。近年来，国内外已有学者将其应用于HFRSV的分型研究并取得了良好的效果[1]。我们将临床HFRS患者的各种标本进行RT-PCR检测，以期建立一项有效的、适合于临床的基因分型诊断方法，现报道结果。
材料与方法
一、一般资料
(一) 标准病毒株 HTNV-114(Ⅰ型)由湖北医科大学病毒所杨占秋教授提供，湖北株(Ⅱ型)由本室曾令兰主任提供。两株病毒均分别采用Vero-E6细胞培养传代，以及鼠脑接种传代。双McAb夹心ELISA法检测抗原，PRNT法证实其型别。
, http://www.100md.com
(二) 临床标本来源 1995年11月至1996年1月采集于同济医科大学协和医院等五所医院。19例发病10日以内的HFRS患者，各种标本共30份，其中血浆19份，外周血单个核细胞(PBMC)7份，尿沉淀细胞4份。
二、实验方法
(一) 防止污染及RNA降解措施 所有标本立即用于RNA提取或短期冷藏(2～8℃)不超过48小时，与标本接触的仪器均经无菌处理或DEPC水浸泡，全过程严格无菌操作。
(二) 总RNA的提取 采用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法快速抽提细胞总RNA。
(三) 引物设计 两对引物PⅠ及PⅡ(见表1)分别互补于野鼠型(Ⅰ型)及家鼠型(Ⅱ型)HFRSV基因的M片段G1编码区[2]，华美公司合成。
表1 引物设计 名称
, 百拇医药
核苷酸位置
引物序列(5′～3′)
长度
意义
PⅠ-a
M30～49
CAATCAGCAACATGGGATA
19mer
(+)
PⅠ-b
M648～631
AATATCAAAGATCCCATG
, 百拇医药
18mer
(-)
PⅡ-a
M76～101
AGTTGGCCAAGGCTTTGCATT
21mer
(+)
PⅡ-b
M748～726
TTGCTGATGTGATGGCAGTCTCT
23mer
(-)
, 百拇医药
(四) RT及cDNA扩增 所有标本均一式两份同时用Ⅰ、Ⅱ型引物分别进行RT-PCR。
(五) 产物的限制性内切酶分析 将RT-PCR产物按产品说明加入限制性内切酶HincⅡ和HaeⅢ,1U/μl,37℃消化2小时，然后电泳观察结果。
结果
一、Vero-E6细胞传代的标准病毒株RT-PCR结果
对接种Ⅰ、Ⅱ型HFRSV及未接种任何病毒的Vero-E6细胞标本均分别用Ⅰ、Ⅱ型引物进行RT-PCR，结果接种Ⅰ型病毒的标本只能被Ⅰ型引物扩增出618bp条带，接种Ⅱ型病毒的标本只能被Ⅱ型引物扩增出670bp条带，未接种病毒的标本不被任何引物扩增，分型结果与理论一致(见表2)。
表2 Vero-E6细胞传代的标准病毒株RT-PCR结果 分 组
, 百拇医药
份数
Ⅰ型引物扩增阳性
Ⅱ型引物扩增阳性
接种HTNV-114
4
4
0
接种湖北株
4
0
4
未接种病毒
4
, 百拇医药
0
0
二、鼠脑传代的标准病毒株RT-PCR结果
鼠脑传代的2株病毒与细胞传代的检测结果一致(见表3)。
表3 鼠脑传代的标准病毒株RT-PCR结果 分 组
份数
Ⅰ型引物扩增阳性
Ⅱ型引物扩增阳性
接种HTNV-114
3
3
, 百拇医药 0
接种湖北株
3
0
3
未接种病毒
3
0
0
三、患者标本RT-PCR结果
19例早期HFRS患者的30份标本均呈Ⅰ型或/和Ⅱ型阳性，来自同一患者的不同标本扩增结果一致(见表4)。
表4 患者标本RT-PCR结果, 百拇医药
单位：
关键词：
中华传染病杂志990318 目前，用于肾综合征出血热病毒(HFRSV)分型的方法主要是空斑减少中和试验(PRNT)。由于操作过于复杂与繁琐，仅用于实验研究。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)是以RNA为模板，联合RT与PCR，具有快速、简便、灵敏、特异等优点。近年来，国内外已有学者将其应用于HFRSV的分型研究并取得了良好的效果[1]。我们将临床HFRS患者的各种标本进行RT-PCR检测，以期建立一项有效的、适合于临床的基因分型诊断方法，现报道结果。
材料与方法
一、一般资料
(一) 标准病毒株 HTNV-114(Ⅰ型)由湖北医科大学病毒所杨占秋教授提供，湖北株(Ⅱ型)由本室曾令兰主任提供。两株病毒均分别采用Vero-E6细胞培养传代，以及鼠脑接种传代。双McAb夹心ELISA法检测抗原，PRNT法证实其型别。
, http://www.100md.com
(二) 临床标本来源 1995年11月至1996年1月采集于同济医科大学协和医院等五所医院。19例发病10日以内的HFRS患者，各种标本共30份，其中血浆19份，外周血单个核细胞(PBMC)7份，尿沉淀细胞4份。
二、实验方法
(一) 防止污染及RNA降解措施 所有标本立即用于RNA提取或短期冷藏(2～8℃)不超过48小时，与标本接触的仪器均经无菌处理或DEPC水浸泡，全过程严格无菌操作。
(二) 总RNA的提取 采用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法快速抽提细胞总RNA。
(三) 引物设计 两对引物PⅠ及PⅡ(见表1)分别互补于野鼠型(Ⅰ型)及家鼠型(Ⅱ型)HFRSV基因的M片段G1编码区[2]，华美公司合成。
表1 引物设计 名称
, 百拇医药
核苷酸位置
引物序列(5′～3′)
长度
意义
PⅠ-a
M30～49
CAATCAGCAACATGGGATA
19mer
(+)
PⅠ-b
M648～631
AATATCAAAGATCCCATG
, 百拇医药
18mer
(-)
PⅡ-a
M76～101
AGTTGGCCAAGGCTTTGCATT
21mer
(+)
PⅡ-b
M748～726
TTGCTGATGTGATGGCAGTCTCT
23mer
(-)
, 百拇医药
(四) RT及cDNA扩增 所有标本均一式两份同时用Ⅰ、Ⅱ型引物分别进行RT-PCR。
(五) 产物的限制性内切酶分析 将RT-PCR产物按产品说明加入限制性内切酶HincⅡ和HaeⅢ,1U/μl,37℃消化2小时，然后电泳观察结果。
结果
一、Vero-E6细胞传代的标准病毒株RT-PCR结果
对接种Ⅰ、Ⅱ型HFRSV及未接种任何病毒的Vero-E6细胞标本均分别用Ⅰ、Ⅱ型引物进行RT-PCR，结果接种Ⅰ型病毒的标本只能被Ⅰ型引物扩增出618bp条带，接种Ⅱ型病毒的标本只能被Ⅱ型引物扩增出670bp条带，未接种病毒的标本不被任何引物扩增，分型结果与理论一致(见表2)。
表2 Vero-E6细胞传代的标准病毒株RT-PCR结果 分 组
, 百拇医药
份数
Ⅰ型引物扩增阳性
Ⅱ型引物扩增阳性
接种HTNV-114
4
4
0
接种湖北株
4
0
4
未接种病毒
4
, 百拇医药
0
0
二、鼠脑传代的标准病毒株RT-PCR结果
鼠脑传代的2株病毒与细胞传代的检测结果一致(见表3)。
表3 鼠脑传代的标准病毒株RT-PCR结果 分 组
份数
Ⅰ型引物扩增阳性
Ⅱ型引物扩增阳性
接种HTNV-114
3
3
, 百拇医药 0
接种湖北株
3
0
3
未接种病毒
3
0
0
三、患者标本RT-PCR结果
19例早期HFRS患者的30份标本均呈Ⅰ型或/和Ⅱ型阳性，来自同一患者的不同标本扩增结果一致(见表4)。
表4 患者标本RT-PCR结果, 百拇医药