影响血链球菌粘附因素的研究
作者：宋晓波 潘亚萍 孔庆华 康白
单位：116027 大连医科大学微生态研究所(宋晓波、康白)；中国医科大学附属口腔医院(潘亚萍)；大连市口腔医院(孔庆华)
关键词：链球菌，血；细菌粘附；氢离子浓度；钙
中华口腔医学杂志/990314 【摘要】 目的 探讨pH值、钙离子对血链球菌粘附至血清，包被羟磷灰石的影响。方法 采用Clark创立的体外粘附实验模型，以[3H]胸腺嘧啶核苷为标记对血链球菌的粘附进行定量观察。结果 不同pH值组测得的放射性测量计数率(counts per minute，cpm)差异有显著性；其中pH值为6.0～7.5时cpm值最高，pH值小于5.5时cpm值则明显降低。不同钙离子浓度的实验组cpm值均显著高于对照组，当钙离子浓度为1.25～3.75 mmol/L时cpm值最高。 结论 pH值、钙离子对血链球菌的粘附作用有显著影响，调节牙周局部pH值及钙离子浓度可影响血链球菌在牙周环境的定植。
, http://www.100md.com
Regulation of adherence to serum-coated hydroxyapatite by Streptococcus sanguis SONG Xiaobo*, PAN Yaping, KONG Qinghua, et al.*Institute for Microecology, Dalian Medical University, Dalian 116027
【Abstract】 Objective To investigate the effects of pH and calcium iron on adhesion of Streptococcus sanguis to serum-coated hydroxyapatite. Methods The adhesion model in vitro established by Clark W.B. in 1977 was used to quantify adsorptive cells through [3H] thymidine labelling. Results The cpm values between different pH groups showed significant differences. Also, there were significant differences of cpm values between calcium groups and control group. Conclusion Either pH or calcium iron has obvious effect on adherence of Stroptococcus sanguis to serum-coated hydroxyapatite. The findings suggest that regulating pH and concentration of calcium iron can help to change colonization on teeth surfaces by Streptococcus sanguis in periodontal circumstance.
, 百拇医药
【Key words】 Streptococcus sanguis Bacterial adhesion Hydrogen-ion concentration Calcium
血链球菌(Streptococcus sanguis)属于甲型溶血性链球菌(α-Hemolytic Streptococcus) ，是人类口腔中固有的主要微生物之一。健康龈沟的菌斑标本中含有大量血链球菌，而牙周病患者活跃性损害部位的菌斑中血链球菌比例却明显减少，甚至难以查出[1]。研究发现血链球菌与牙周可疑致病菌之间有较强的拮抗作用[2]，因此，维持和重建以血链球菌为代表的牙周健康菌群已成为牙周病防治的重要内容。我们探讨了影响血链球菌粘附至牙面的作用因素，以期为血链球菌在牙周环境的定植提供实验依据。
材料和方法
一、 实验材料
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血链球菌JFr参考株(Forsyth Dental Center, USA)、胰酶水解物大豆培养基(成品)、[3H]胸腺嘧啶核苷([3H]thymidine，37 MBq，中国原子能科学研究所 )、二氧六环闪烁液(中国医科大学核医学教研室配置)、羟磷灰石小珠(hydroxyapatite，HA，新津龙马化工
厂)、灭活小牛血清(大连旅顺生物制品厂)、液体闪烁计数器(Burkman LB-8501，USA)。
二、实验方法
1.血链球菌复苏、增菌及保种。
2.建立A值-菌浓度标准曲线，见图1。
图1 A值-菌浓度标准曲线
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3.[3H]胸腺嘧啶核苷掺入实验：将[3H]胸腺嘧啶核苷加入血链球菌培养液中达111×1012Bq/L,经孵育、离心、PBS液冲洗3次[3]。对应A值-菌浓度标准曲线，配成浓度为6×1012 CFU/L的PBS菌液。
4.灭活小牛血清包被羟磷灰石小珠(serum-coated hydroxyapatite，SeHA)：40 mg无菌HA与1 ml灭活小牛血清混合，在室温下孵育2小时，每隔30 min震荡1次。置于4℃冰箱12小时。次日弃去未吸附血清，冲洗、干燥[4]。
5.粘附实验：①不同pH值菌液分组及粘附实验。用1 mol/L HCl溶液与1 mol/L NaOH溶液调节PBS菌液，配成pH值分别为4.0～4.5、5.0～5.5、6.0～6.5、7.0～7.5及8.0～8.5的5个实验组。每组菌液各取1 ml加入SeHA中充分混合2小时，4℃冰箱12小时。次日弃去上清液，PBS液冲洗3次后转移至闪烁液中，测量cpm值。②不同钙离子浓度菌液分组及粘附实验。以PBS菌液为对照组；用1 mol/L CaCl2 溶液调节PBS菌液，使之成为钙离子浓度分别为1.25 mmol/L、2.5 mmol/L、3.75 mmol/L、5 mmol/L的4个实验组。测量对照组与实验组菌液的pH值范围为6.9～7.2。将5组菌液各取1 ml加入SeHA充分混合2小时，4℃冰箱12小时。次日弃去上清液，冲洗3次后转移至闪烁液中，测量cpm值[3]。
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结果
一、 pH值对血链球菌粘附的影响
5个pH值组经粘附实验后测得的cpm值加减标准误依次为：1 062.40±72.00(pH值4.0～
4.5)、1 053.50±71.50(pH值5.0～5.5)、3 500.20±265.34(pH值6.0～6.5)、3 423.00±459.60(pH值7.0～7.5)、3 256.50±219.07(pH值8.0～8.5)，5个组的实验例数均为10例。经成组设计方差分析得：F=217.62，P<0.001。故5个pH值组测得的cpm值差异有显著性。经各组测得cpm值平均数间的两两比较发现，pH值为6.0～6.5及7.0～7.5组测得的cpm值最高且差异无显著性；当pH值小于5.5时测得的cpm值骤减。
二、 钙离子浓度对粘附的影响
, 百拇医药
1个对照组与不同钙离子浓度的4个实验组经粘附实验后测得的cpm值见表1。经1个对照组与多个实验组均数间的两两比较发现：P值均小于0.001，故4个实验组与对照组测得的cpm值差异均有显著性，各实验组的cpm值均高于对照组；经进一步样品均数间的两两比较：钙离子浓度为1.25 mmol/L、2.50 mmol/L、3.75 mmol/L时测得的cpm值差异无显著性，均高于钙离子浓度为5.00 mmol/L时测得的cpm值。
表1 不同钙离子浓度组的放射性测量计数率值(
±
) 组别
实验例数
钙离子浓度
(mmol/L)
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放射性测量计数率
对照
10
3 216.70±102.12
实验1
10
1.25
4 013.25±122.64
实验2
10
2.50
4 046.31±180.79
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实验3
10
3.75
4 051.20± 82.90
实验4
10
5.00
3 739.24±145.03
讨论
现代牙周病学观点认为，血链球菌、黄褐二氧化碳噬纤维菌和小韦荣菌可能是牙周原籍菌，这些细菌与牙周可疑致病菌之间的平衡是维持牙周健康的重要因素之一。因此，研究血链球菌对牙面的粘附、定植是维护牙周生态平衡的关键。资料表明，血链球菌对牙面有较强的粘附作用，并且该作用受环境因素的影响很显著[5]。
, 百拇医药
本实验结果显示，随着pH值的变化，血链球菌粘附至SeHA的数量差异有显著性, pH值为6.0～7.5时粘附细菌数量最多。资料表明，在pH值较低的环境中生长的菌细胞易形成长链状结构，这种结构不仅影响放射性物质的标记[6]，而且能导致细菌表面结构的改变[5]。此外，酸化作用可引起牙面接受器或细菌外泌蛋白的变性[7]，从而导致血链球菌粘附数量的降低。有实验发现，生长于pH值恒定为5.5环境中的血链球菌明显丧失了与普通血链球菌粘附竞争的能力；当pH值升至6.0～6.5时血链球菌粘附作用最强。另有实验发现, pH值为7.0时血链球菌粘附作用最强。
本实验结果显示，适当浓度的钙离子能增加血链球菌的粘附数量；当钙离子浓度为1.25～3.75 mmol/L时粘附细菌数量最多。早在1976年，Rolla[8]就曾提出钙桥学说，认为细菌对牙面的粘附是通过钙离子将菌体表面的负电基团(如脂磷壁酸的终末磷酸基)与牙面获得性膜上负电基团(如磺酰基或羧基)键合而致。
, 百拇医药
综上所述，在今后的牙周病治疗过程中，不仅需要进行控制牙菌斑、去除牙石、平整根面及调整咬合创伤、开展牙周手术等经典治疗，还应从整体观念上调整牙周环境(pH值、钙离子浓度等)，使之有利于牙周正常菌的粘附与定植，从而恢复牙周生态环境的平衡与健康。
参考文献
[1] 潘亚萍，张蕴惠，章锦才，等. 牙周炎患者健康部位与病变部位龈下部位龈下菌群细菌学研究.牙体牙髓牙周病学杂志，1994, 4：206-208.
[2] Hillman JD, Socransky SS, Shivers M. The relationships between streptococcal species and periodontopathic bacteria in human dental plaque. Arch Oral Biol, 1985, 30:791-795.
, 百拇医药
[3] Clark WB,Bammann LL,Gibbons RJ.Comparative estimates of bacteria affinities and adsorption sites on hydroxyapatite surfaces. Infect Immun, 1978, 19:846-853.
[4] Singh U, Grenier D, McBridge BC. Bacteroides gingivalis vesicles mediate attachment of streptococci to serum coated hydroxyapatite. Oral Microbiol Immunol, 1989, 4:199-203.
[5] Rosan B, Appelbaum B, Campbell LK, et al. Chemostat studies of the effect of enviromental control on Streptococcus sanguis adherence to hydroxyapatite. Infect Immun, 1982,35:64-70.
, http://www.100md.com
[6] Benjamin A, Ellis G, Standey H, et al. In vitro studies of dental plaque formation: adsorption of oral streptococci to hydroxyapatite. Infect Immun, 1979, 25:717-728.
[7] Knox KW, Hardy LN, Markevics LJ, et al. Comparative studies on the effect of growth conditions on adhesion,hydrophobicity and extracellular protein profile of Streptococcus sanguis G9B. Infect Immun, 1985, 50:545-554.
[8] Rolla G.Inhibition of adsorption-general considerations. In:stiles M, eds. Microbial aspects of dental caries. Vol I. 1st ed. Washington: Information Retrieval, 1976. 309-332.
(收稿：1997-09-12 修回：1998-12-22), 百拇医药
单位：116027 大连医科大学微生态研究所(宋晓波、康白)；中国医科大学附属口腔医院(潘亚萍)；大连市口腔医院(孔庆华)
关键词：链球菌，血；细菌粘附；氢离子浓度；钙
中华口腔医学杂志/990314 【摘要】 目的 探讨pH值、钙离子对血链球菌粘附至血清，包被羟磷灰石的影响。方法 采用Clark创立的体外粘附实验模型，以[3H]胸腺嘧啶核苷为标记对血链球菌的粘附进行定量观察。结果 不同pH值组测得的放射性测量计数率(counts per minute，cpm)差异有显著性；其中pH值为6.0～7.5时cpm值最高，pH值小于5.5时cpm值则明显降低。不同钙离子浓度的实验组cpm值均显著高于对照组，当钙离子浓度为1.25～3.75 mmol/L时cpm值最高。 结论 pH值、钙离子对血链球菌的粘附作用有显著影响，调节牙周局部pH值及钙离子浓度可影响血链球菌在牙周环境的定植。
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Regulation of adherence to serum-coated hydroxyapatite by Streptococcus sanguis SONG Xiaobo*, PAN Yaping, KONG Qinghua, et al.*Institute for Microecology, Dalian Medical University, Dalian 116027
【Abstract】 Objective To investigate the effects of pH and calcium iron on adhesion of Streptococcus sanguis to serum-coated hydroxyapatite. Methods The adhesion model in vitro established by Clark W.B. in 1977 was used to quantify adsorptive cells through [3H] thymidine labelling. Results The cpm values between different pH groups showed significant differences. Also, there were significant differences of cpm values between calcium groups and control group. Conclusion Either pH or calcium iron has obvious effect on adherence of Stroptococcus sanguis to serum-coated hydroxyapatite. The findings suggest that regulating pH and concentration of calcium iron can help to change colonization on teeth surfaces by Streptococcus sanguis in periodontal circumstance.
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【Key words】 Streptococcus sanguis Bacterial adhesion Hydrogen-ion concentration Calcium
血链球菌(Streptococcus sanguis)属于甲型溶血性链球菌(α-Hemolytic Streptococcus) ，是人类口腔中固有的主要微生物之一。健康龈沟的菌斑标本中含有大量血链球菌，而牙周病患者活跃性损害部位的菌斑中血链球菌比例却明显减少，甚至难以查出[1]。研究发现血链球菌与牙周可疑致病菌之间有较强的拮抗作用[2]，因此，维持和重建以血链球菌为代表的牙周健康菌群已成为牙周病防治的重要内容。我们探讨了影响血链球菌粘附至牙面的作用因素，以期为血链球菌在牙周环境的定植提供实验依据。
材料和方法
一、 实验材料
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血链球菌JFr参考株(Forsyth Dental Center, USA)、胰酶水解物大豆培养基(成品)、[3H]胸腺嘧啶核苷([3H]thymidine，37 MBq，中国原子能科学研究所 )、二氧六环闪烁液(中国医科大学核医学教研室配置)、羟磷灰石小珠(hydroxyapatite，HA，新津龙马化工
厂)、灭活小牛血清(大连旅顺生物制品厂)、液体闪烁计数器(Burkman LB-8501，USA)。
二、实验方法
1.血链球菌复苏、增菌及保种。
2.建立A值-菌浓度标准曲线，见图1。
图1 A值-菌浓度标准曲线
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3.[3H]胸腺嘧啶核苷掺入实验：将[3H]胸腺嘧啶核苷加入血链球菌培养液中达111×1012Bq/L,经孵育、离心、PBS液冲洗3次[3]。对应A值-菌浓度标准曲线，配成浓度为6×1012 CFU/L的PBS菌液。
4.灭活小牛血清包被羟磷灰石小珠(serum-coated hydroxyapatite，SeHA)：40 mg无菌HA与1 ml灭活小牛血清混合，在室温下孵育2小时，每隔30 min震荡1次。置于4℃冰箱12小时。次日弃去未吸附血清，冲洗、干燥[4]。
5.粘附实验：①不同pH值菌液分组及粘附实验。用1 mol/L HCl溶液与1 mol/L NaOH溶液调节PBS菌液，配成pH值分别为4.0～4.5、5.0～5.5、6.0～6.5、7.0～7.5及8.0～8.5的5个实验组。每组菌液各取1 ml加入SeHA中充分混合2小时，4℃冰箱12小时。次日弃去上清液，PBS液冲洗3次后转移至闪烁液中，测量cpm值。②不同钙离子浓度菌液分组及粘附实验。以PBS菌液为对照组；用1 mol/L CaCl2 溶液调节PBS菌液，使之成为钙离子浓度分别为1.25 mmol/L、2.5 mmol/L、3.75 mmol/L、5 mmol/L的4个实验组。测量对照组与实验组菌液的pH值范围为6.9～7.2。将5组菌液各取1 ml加入SeHA充分混合2小时，4℃冰箱12小时。次日弃去上清液，冲洗3次后转移至闪烁液中，测量cpm值[3]。
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结果
一、 pH值对血链球菌粘附的影响
5个pH值组经粘附实验后测得的cpm值加减标准误依次为：1 062.40±72.00(pH值4.0～
4.5)、1 053.50±71.50(pH值5.0～5.5)、3 500.20±265.34(pH值6.0～6.5)、3 423.00±459.60(pH值7.0～7.5)、3 256.50±219.07(pH值8.0～8.5)，5个组的实验例数均为10例。经成组设计方差分析得：F=217.62，P<0.001。故5个pH值组测得的cpm值差异有显著性。经各组测得cpm值平均数间的两两比较发现，pH值为6.0～6.5及7.0～7.5组测得的cpm值最高且差异无显著性；当pH值小于5.5时测得的cpm值骤减。
二、 钙离子浓度对粘附的影响
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1个对照组与不同钙离子浓度的4个实验组经粘附实验后测得的cpm值见表1。经1个对照组与多个实验组均数间的两两比较发现：P值均小于0.001，故4个实验组与对照组测得的cpm值差异均有显著性，各实验组的cpm值均高于对照组；经进一步样品均数间的两两比较：钙离子浓度为1.25 mmol/L、2.50 mmol/L、3.75 mmol/L时测得的cpm值差异无显著性，均高于钙离子浓度为5.00 mmol/L时测得的cpm值。
表1 不同钙离子浓度组的放射性测量计数率值(
±) 组别实验例数
钙离子浓度
(mmol/L)
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放射性测量计数率
对照
10
3 216.70±102.12
实验1
10
1.25
4 013.25±122.64
实验2
10
2.50
4 046.31±180.79
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实验3
10
3.75
4 051.20± 82.90
实验4
10
5.00
3 739.24±145.03
讨论
现代牙周病学观点认为，血链球菌、黄褐二氧化碳噬纤维菌和小韦荣菌可能是牙周原籍菌，这些细菌与牙周可疑致病菌之间的平衡是维持牙周健康的重要因素之一。因此，研究血链球菌对牙面的粘附、定植是维护牙周生态平衡的关键。资料表明，血链球菌对牙面有较强的粘附作用，并且该作用受环境因素的影响很显著[5]。
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本实验结果显示，随着pH值的变化，血链球菌粘附至SeHA的数量差异有显著性, pH值为6.0～7.5时粘附细菌数量最多。资料表明，在pH值较低的环境中生长的菌细胞易形成长链状结构，这种结构不仅影响放射性物质的标记[6]，而且能导致细菌表面结构的改变[5]。此外，酸化作用可引起牙面接受器或细菌外泌蛋白的变性[7]，从而导致血链球菌粘附数量的降低。有实验发现，生长于pH值恒定为5.5环境中的血链球菌明显丧失了与普通血链球菌粘附竞争的能力；当pH值升至6.0～6.5时血链球菌粘附作用最强。另有实验发现, pH值为7.0时血链球菌粘附作用最强。
本实验结果显示，适当浓度的钙离子能增加血链球菌的粘附数量；当钙离子浓度为1.25～3.75 mmol/L时粘附细菌数量最多。早在1976年，Rolla[8]就曾提出钙桥学说，认为细菌对牙面的粘附是通过钙离子将菌体表面的负电基团(如脂磷壁酸的终末磷酸基)与牙面获得性膜上负电基团(如磺酰基或羧基)键合而致。
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综上所述，在今后的牙周病治疗过程中，不仅需要进行控制牙菌斑、去除牙石、平整根面及调整咬合创伤、开展牙周手术等经典治疗，还应从整体观念上调整牙周环境(pH值、钙离子浓度等)，使之有利于牙周正常菌的粘附与定植，从而恢复牙周生态环境的平衡与健康。
参考文献
[1] 潘亚萍，张蕴惠，章锦才，等. 牙周炎患者健康部位与病变部位龈下部位龈下菌群细菌学研究.牙体牙髓牙周病学杂志，1994, 4：206-208.
[2] Hillman JD, Socransky SS, Shivers M. The relationships between streptococcal species and periodontopathic bacteria in human dental plaque. Arch Oral Biol, 1985, 30:791-795.
, 百拇医药
[3] Clark WB,Bammann LL,Gibbons RJ.Comparative estimates of bacteria affinities and adsorption sites on hydroxyapatite surfaces. Infect Immun, 1978, 19:846-853.
[4] Singh U, Grenier D, McBridge BC. Bacteroides gingivalis vesicles mediate attachment of streptococci to serum coated hydroxyapatite. Oral Microbiol Immunol, 1989, 4:199-203.
[5] Rosan B, Appelbaum B, Campbell LK, et al. Chemostat studies of the effect of enviromental control on Streptococcus sanguis adherence to hydroxyapatite. Infect Immun, 1982,35:64-70.
, http://www.100md.com
[6] Benjamin A, Ellis G, Standey H, et al. In vitro studies of dental plaque formation: adsorption of oral streptococci to hydroxyapatite. Infect Immun, 1979, 25:717-728.
[7] Knox KW, Hardy LN, Markevics LJ, et al. Comparative studies on the effect of growth conditions on adhesion,hydrophobicity and extracellular protein profile of Streptococcus sanguis G9B. Infect Immun, 1985, 50:545-554.
[8] Rolla G.Inhibition of adsorption-general considerations. In:stiles M, eds. Microbial aspects of dental caries. Vol I. 1st ed. Washington: Information Retrieval, 1976. 309-332.
(收稿：1997-09-12 修回：1998-12-22), 百拇医药