口腔螺旋体的胶原结合蛋白
作者：李鸣宇 刘正 梅本利彦
单位：200011 上海第二医科大学口腔医学研究所(李鸣宇、刘正)；日本朝日大学口腔细菌学教研室(梅本利彦)
关键词：螺旋体属；细菌粘附；胶原
中华口腔医学杂志/990312 【摘要】 目的 研究口腔螺旋体胶原结合蛋白的致病作用。方法 用免疫印迹、免疫金标电镜和体外粘附实验等方法分析了口腔螺旋体胶原结合蛋白的性质及其在菌细胞表面的定位。结果 Treponema denticola菌(简称Td)细胞外膜上有27 000Ⅴ型，Treponema socranskii菌(简称Ts) 有95 000Ⅳ型和110 000Ⅰ型，Treponema medium(简称Tm)有95 000 Ⅳ型胶原结合蛋白；Td 和Ts 可粘附于Ⅳ型胶原表面，而Tm很少粘附；Td和 Tm可粘附于无胶原蛋白涂布的薄片表面。结论 胶原结合蛋白可介导螺旋体对胶原较丰富的靶器官的粘附。
, 百拇医药
Collagen -binding proteins of human oral spirochetes LI Mingyu*, LIU Zheng，UMEMOTO Toshihiro. * Research Institute of Stomatology, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200011
【Abstract】 Objective To evaluate pathogenic effect of the collagen-binding proteins(CBP) of human oral spirochetes. Methods Immunoblot analysis, immunoelectron microscopy and other experiments had been used. Results It was showed that: type Ⅰ,Ⅳ and Ⅴ CBP were detected in heated and unheated preparations from Treponema denticola(Td) ATCC 33520 and Treponema socranskii (Ts) ATCC 35534. Few CBP, however, were detected in heated and unheated preparations from a recently characterized isloate, Treponema medium(Tm) strain G7201. 27 000 type Ⅴ CBP of Td, 110 000 typeⅠof Ts and 95 000 type Ⅳ of Tm were located on the envelopes of the individual cells. The adherence of Td to the collagen-coated surface was significantly greater than that of Tm. Conclusion The CBP on the oral spirochetal cells play an important role in their adherence to collagen-rich connective tissues of the host.
, 百拇医药
【Key words】 Spirochaeta Bacterial adhesion Collagen
口腔螺旋体是一群细长、呈弯曲螺旋状、高度厌氧的病菌。与健康牙龈状态比较，在牙龈炎和各型牙周炎时局部螺旋体比例增大。在非患病部位比例为0%～4%，但在成人牙周炎可高达总数的56%，从而提示螺旋体是牙周病的重要病源微生物[1]。一般认为螺旋体在牙周病中的作用机制是通过表面粘附性蛋白粘附于靶器官，并产生胶原酶、蛋白酶破坏作用和降低宿主的免疫防御功能等，具体的粘附机制尚不清楚。我们用免疫印迹和免疫金标等方法分析了口腔螺旋体的胶原结合蛋白(collagen-binding proteins, CBP)的性质及其在菌细胞表面的定位。
材料与方法
1.菌株和培养： 采用国际标准菌株，Treponema denticola(简称Td)ATCC33520，Treponema socranskii (简称Ts)ATCC35534和1997 年新鉴定的菌种Treponema medium(以前称G7201，简称Tm)。采用TYGVS培养基，Ts采用改良的Ts培养基，37℃连续厌氧培养4～5天。离心(7 700g×5 min),用PBS(pH值为7.2)洗3次，以相同PBS制备成适当浓度的菌悬液，备用。
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2.SDS-PAGE电泳：采用Laemmli法SDS-PAGE电泳系统，浓缩胶和分离胶浓度分别为3% 和 10%。上述菌悬液与样品缓冲液混合100℃加热5 min(此为加热组)，取上样(20 μg/样品池)。同样方法作一非加热组。电泳后以考马斯亮兰染色。
3.免疫印迹分析：为确定加热和非加热3种螺旋体的CBP，经SDS-PAGE分离后的多肽转移至硝酸纤维膜上，用胎盘Ⅰ、Ⅳ或Ⅴ型胶原处理该膜，再用相对应的兔抗人胎盘胶原的抗血清处理，最后用羊抗兔IgG辣根过氧化酶标记的抗血清处理。
4.抗血清制备：经过免疫印迹确定了加热和非加热3种螺旋体的CBP。它们是Td的27 000Ⅴ型，Ts的95 000 Ⅳ型、110 000Ⅰ型和Tm 95 000 Ⅳ型等CBP。再次进行SDS-PAGE电泳，各种CBP凝胶条带作为抗原，常规免疫方法制备兔的多克隆抗血清。
5.免疫电镜分析：为对CBP(Td的27 000,Ts 95 000和110 000,Tm的95 000)进行定位，作了免疫电镜分析。将10 ml菌悬液与各自的抗血清(稀释度：1：10)室温孵育1小时, 用PBS离心洗细菌两次后与蛋白A-金复合物作用30 min。用蒸馏水洗细菌3次，将其置于有火棉胶的镍网上，1% 磷钨酸负染，透射电镜观察。
, 百拇医药
6.体外粘附实验：将5 μl人胎盘Ⅰ型，Ⅳ型或Ⅴ型胶原溶液涂布于直径6 mm结合了凝胶的塑料薄片表面，对照组用PBS涂布。将2 ml灭菌PBS放入直径6 mm的石碟内，各种薄片干燥后胶原面朝上放入其中。各石碟加入新鲜菌液达1011/L，放在摇床上35次/分，37℃水平摇动1小时。取下薄片洗3次，再次用蒸馏水摇洗2次，干燥，放于样品台上扫描电镜(JSM-36C，JEOL，日本产)观察、记数。
7.蛋白测定：样品中的蛋白含量用Lowry法测定，以牛血清蛋白为标准。
结果
1.加热和非加热螺旋体的CBP：经SDS-PAGE电泳，发现加热后的样品多肽条带发生了明显变化, 免疫印迹进一步证实加热和非加热螺旋体CBP的存在(表1)。
表1 加热和非加热螺旋体的胶原结合蛋白类型 螺旋体名称
, 百拇医药
加热
非加热
Treponema denticola
53 000 I型
50 000 I型、58 000 I型、76 000 I型、27 000IV型、58 000 IV型、70 000IV型
Treponema socranskii
53 000 I型、53 000 IV型、30 000 IV型
110 000 I型、53 000 IV型、30 000IV型、Treponama medium
95 000 IV型
, 百拇医药
2.螺旋体CBP的免疫电镜定位：结果显示Td 27 000Ⅴ型CBP(图1a)、Ts 110 000Ⅰ型CBP(图1b)和Tm 95 000 Ⅳ型CBP(图1c)位于螺旋体的菌细胞外膜上。Ts 95 000Ⅳ型CBP也位于螺旋体的菌细胞外膜上(结果未列)。
图1 免疫金标透射电镜显示胶原结合蛋白在螺旋体上的定位
1a Treponema denticola 27 000抗血清；
1b Treponema socranskii 110 000抗血清；
1c Treponema medium 95 000抗血清
3.螺旋体对胶原的粘附：扫描电镜发现Td和Ts可粘附于Ⅳ型胶原蛋白表面,而Tm很少粘附于Ⅳ型胶原蛋白表面。Td和Tm可粘附于无胶原蛋白涂布的薄片表面。通过某一固定区的粘附菌量计数，比较3种螺旋体对胶原蛋白表面的粘附(图2)。对无胶原蛋白涂布的薄片表面的粘附，3种螺旋体的粘附量几乎相似，Tm几乎不粘附于任何一种胶原蛋白涂布的薄片表面。相反，Td和Ts可粘附于胶原蛋白表面。Td比Ts更强烈地粘附于Ⅳ型和Ⅴ型胶原蛋白表面。
, 百拇医药
图2 螺旋体对各型胶原覆盖的薄片粘附比较
讨论
细菌对靶器官粘附的机制是非常特异而复杂的过程，其分子基础是一对一的粘结素-受体作用。目前，已提出的主要口腔细菌的粘结素和受体有：葡聚糖结合蛋白-葡聚糖(S. sobrinus), Ⅰ型菌毛-富脯蛋白(粘放菌), Ⅱ型菌毛-半乳糖残基(粘放菌)[2]。 近来的研究表明，细菌对胶原的亲合也是这种特异受体的作用。胶原是牙周组织的主要成分，至少有Ⅰ、Ⅲ～Ⅶ 6种类型的胶原，并以Ⅰ、Ⅲ型胶原为主[3]。牙骨质和牙本质也是富含胶原的物质，它们在酸性条件下脱矿后，胶原暴露出来而导致细菌粘附于牙齿表面[4]。牙体组织中的胶原主要是Ⅰ型胶原，也有少量Ⅲ型胶原。研究表明，变链菌、粘放菌和乳杆菌的许多菌株都对胶原有亲合力。
Umemoto 和Namikawa[5]曾报道Td 和Ts的相对分子质量为53 000的表面多肽分别是人Ⅰ型和Ⅳ型CBP。但本实验中发现加热的这两种菌无该多肽(表1)，取代它的是Td的58 000、50 000和70 000Ⅰ型CBP,及Ts Ⅳ型的CBP。加热和非加热的Td 和Ts CBP的分子大小发生改变的这种现象说明了螺旋体经过有可溶解缓冲液的加热处理，多肽分解谱发生了改变。在3种螺旋体未加热样品发现的14个CBP中，4个是在细菌外膜上，它们是Td 27 000Ⅴ型、Ts 110 000Ⅰ型、Tm 95 000 Ⅳ型和Ts 95 000 Ⅳ型CBP。其它CBP可能位于胞膜与胞壁之间的复合物上。
, 百拇医药
本研究比较了3种螺旋体对CBP的粘附，Td 和Ts 由于有CBP而发生粘附，而Tm有95 000 Ⅳ型CBP却没有因此促进粘附。产生这种现象的原因可能是由于胶原与CBP发生作用时的三维结合机制的某种影响。Td和Ts外膜有较多的多糖[6]，可能会影响CBP对靶器官的结合。
Kennett等[7]曾报道，Td的另一菌株ATCC35405不粘附于Ⅰ型牛血清胶原，而本实验中，Td ATCC33520粘附于Ⅰ型人胶原。加热和非加热的Td的ATCC 35405和ATCC 33520都有相似相对分子质量的Ⅰ型人胎盘CBP[5]，实验结果的不同可能是由于使用了不同的粘附系统。Nakatani等[8]报道在有Td 3 3520的53 000表面蛋白抗血清覆盖的粘附实验中，稀释抗血清减少了粘附，而53 000是CBP参与了螺旋体的特异粘附过程。为确认CBP参与粘附的特异性,尚需做更严密的粘附抑制实验。
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参考文献
[1] 李德懿.牙周病微生物学.第1版.天津：天津科技翻译出版公司,1994.108-110.
[2] 刘天佳.细菌对口腔组织的粘附.国外医学口腔医学分册,1991,18:257-261.
[3] 李成章.胶原与牙周病. 国外医学口腔医学分册,1995,22:70-72.
[4] 郭丽娟，刘天佳. 致龋菌对胶原的粘附.国外医学口腔医学分册,1997,24:283-287.
[5] Umemoto T, Namikawa I. Binding of host-associated treponeme proteins to collagens and laminin: a possible mechanism of spirochetal adherence to host tissues. Microbiol Immunol, 1994,38:655-663.
, http://www.100md.com
[6] Scott D, Klitorinos A, Chan,EC, et al. Visualization of an extracellular mucoid layer of Treponema denticola ATCC 35405 and surface sugar lectin analysis of some Treponema species. Oral Microbiol Immunol, 1997,12:121-125.
[7] Kennett CN, Cox SW, Eley BM. Histochemical and immuno-cytochemical localization of dipeptidyl peptidases Ⅱand Ⅳ in human gingiva. J Periodontol, 1996,67:846-852.
[8] Nakatani Y, Umemoto T, Nakamura Y, et al. Adherence of an oral spirochete Treponema denticola to glass surface in vitro. Jpn J Oral Biol, 1992,34:374-383.
(收稿:1998-06-19 修回:1999-01-26), 百拇医药
单位：200011 上海第二医科大学口腔医学研究所(李鸣宇、刘正)；日本朝日大学口腔细菌学教研室(梅本利彦)
关键词：螺旋体属；细菌粘附；胶原
中华口腔医学杂志/990312 【摘要】 目的 研究口腔螺旋体胶原结合蛋白的致病作用。方法 用免疫印迹、免疫金标电镜和体外粘附实验等方法分析了口腔螺旋体胶原结合蛋白的性质及其在菌细胞表面的定位。结果 Treponema denticola菌(简称Td)细胞外膜上有27 000Ⅴ型，Treponema socranskii菌(简称Ts) 有95 000Ⅳ型和110 000Ⅰ型，Treponema medium(简称Tm)有95 000 Ⅳ型胶原结合蛋白；Td 和Ts 可粘附于Ⅳ型胶原表面，而Tm很少粘附；Td和 Tm可粘附于无胶原蛋白涂布的薄片表面。结论 胶原结合蛋白可介导螺旋体对胶原较丰富的靶器官的粘附。
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Collagen -binding proteins of human oral spirochetes LI Mingyu*, LIU Zheng，UMEMOTO Toshihiro. * Research Institute of Stomatology, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200011
【Abstract】 Objective To evaluate pathogenic effect of the collagen-binding proteins(CBP) of human oral spirochetes. Methods Immunoblot analysis, immunoelectron microscopy and other experiments had been used. Results It was showed that: type Ⅰ,Ⅳ and Ⅴ CBP were detected in heated and unheated preparations from Treponema denticola(Td) ATCC 33520 and Treponema socranskii (Ts) ATCC 35534. Few CBP, however, were detected in heated and unheated preparations from a recently characterized isloate, Treponema medium(Tm) strain G7201. 27 000 type Ⅴ CBP of Td, 110 000 typeⅠof Ts and 95 000 type Ⅳ of Tm were located on the envelopes of the individual cells. The adherence of Td to the collagen-coated surface was significantly greater than that of Tm. Conclusion The CBP on the oral spirochetal cells play an important role in their adherence to collagen-rich connective tissues of the host.
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【Key words】 Spirochaeta Bacterial adhesion Collagen
口腔螺旋体是一群细长、呈弯曲螺旋状、高度厌氧的病菌。与健康牙龈状态比较，在牙龈炎和各型牙周炎时局部螺旋体比例增大。在非患病部位比例为0%～4%，但在成人牙周炎可高达总数的56%，从而提示螺旋体是牙周病的重要病源微生物[1]。一般认为螺旋体在牙周病中的作用机制是通过表面粘附性蛋白粘附于靶器官，并产生胶原酶、蛋白酶破坏作用和降低宿主的免疫防御功能等，具体的粘附机制尚不清楚。我们用免疫印迹和免疫金标等方法分析了口腔螺旋体的胶原结合蛋白(collagen-binding proteins, CBP)的性质及其在菌细胞表面的定位。
材料与方法
1.菌株和培养： 采用国际标准菌株，Treponema denticola(简称Td)ATCC33520，Treponema socranskii (简称Ts)ATCC35534和1997 年新鉴定的菌种Treponema medium(以前称G7201，简称Tm)。采用TYGVS培养基，Ts采用改良的Ts培养基，37℃连续厌氧培养4～5天。离心(7 700g×5 min),用PBS(pH值为7.2)洗3次，以相同PBS制备成适当浓度的菌悬液，备用。
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2.SDS-PAGE电泳：采用Laemmli法SDS-PAGE电泳系统，浓缩胶和分离胶浓度分别为3% 和 10%。上述菌悬液与样品缓冲液混合100℃加热5 min(此为加热组)，取上样(20 μg/样品池)。同样方法作一非加热组。电泳后以考马斯亮兰染色。
3.免疫印迹分析：为确定加热和非加热3种螺旋体的CBP，经SDS-PAGE分离后的多肽转移至硝酸纤维膜上，用胎盘Ⅰ、Ⅳ或Ⅴ型胶原处理该膜，再用相对应的兔抗人胎盘胶原的抗血清处理，最后用羊抗兔IgG辣根过氧化酶标记的抗血清处理。
4.抗血清制备：经过免疫印迹确定了加热和非加热3种螺旋体的CBP。它们是Td的27 000Ⅴ型，Ts的95 000 Ⅳ型、110 000Ⅰ型和Tm 95 000 Ⅳ型等CBP。再次进行SDS-PAGE电泳，各种CBP凝胶条带作为抗原，常规免疫方法制备兔的多克隆抗血清。
5.免疫电镜分析：为对CBP(Td的27 000,Ts 95 000和110 000,Tm的95 000)进行定位，作了免疫电镜分析。将10 ml菌悬液与各自的抗血清(稀释度：1：10)室温孵育1小时, 用PBS离心洗细菌两次后与蛋白A-金复合物作用30 min。用蒸馏水洗细菌3次，将其置于有火棉胶的镍网上，1% 磷钨酸负染，透射电镜观察。
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6.体外粘附实验：将5 μl人胎盘Ⅰ型，Ⅳ型或Ⅴ型胶原溶液涂布于直径6 mm结合了凝胶的塑料薄片表面，对照组用PBS涂布。将2 ml灭菌PBS放入直径6 mm的石碟内，各种薄片干燥后胶原面朝上放入其中。各石碟加入新鲜菌液达1011/L，放在摇床上35次/分，37℃水平摇动1小时。取下薄片洗3次，再次用蒸馏水摇洗2次，干燥，放于样品台上扫描电镜(JSM-36C，JEOL，日本产)观察、记数。
7.蛋白测定：样品中的蛋白含量用Lowry法测定，以牛血清蛋白为标准。
结果
1.加热和非加热螺旋体的CBP：经SDS-PAGE电泳，发现加热后的样品多肽条带发生了明显变化, 免疫印迹进一步证实加热和非加热螺旋体CBP的存在(表1)。
表1 加热和非加热螺旋体的胶原结合蛋白类型 螺旋体名称
, 百拇医药
加热
非加热
Treponema denticola
53 000 I型
50 000 I型、58 000 I型、76 000 I型、27 000IV型、58 000 IV型、70 000IV型
Treponema socranskii
53 000 I型、53 000 IV型、30 000 IV型
110 000 I型、53 000 IV型、30 000IV型、Treponama medium
95 000 IV型
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2.螺旋体CBP的免疫电镜定位：结果显示Td 27 000Ⅴ型CBP(图1a)、Ts 110 000Ⅰ型CBP(图1b)和Tm 95 000 Ⅳ型CBP(图1c)位于螺旋体的菌细胞外膜上。Ts 95 000Ⅳ型CBP也位于螺旋体的菌细胞外膜上(结果未列)。
图1 免疫金标透射电镜显示胶原结合蛋白在螺旋体上的定位
1a Treponema denticola 27 000抗血清；
1b Treponema socranskii 110 000抗血清；
1c Treponema medium 95 000抗血清
3.螺旋体对胶原的粘附：扫描电镜发现Td和Ts可粘附于Ⅳ型胶原蛋白表面,而Tm很少粘附于Ⅳ型胶原蛋白表面。Td和Tm可粘附于无胶原蛋白涂布的薄片表面。通过某一固定区的粘附菌量计数，比较3种螺旋体对胶原蛋白表面的粘附(图2)。对无胶原蛋白涂布的薄片表面的粘附，3种螺旋体的粘附量几乎相似，Tm几乎不粘附于任何一种胶原蛋白涂布的薄片表面。相反，Td和Ts可粘附于胶原蛋白表面。Td比Ts更强烈地粘附于Ⅳ型和Ⅴ型胶原蛋白表面。
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图2 螺旋体对各型胶原覆盖的薄片粘附比较
讨论
细菌对靶器官粘附的机制是非常特异而复杂的过程，其分子基础是一对一的粘结素-受体作用。目前，已提出的主要口腔细菌的粘结素和受体有：葡聚糖结合蛋白-葡聚糖(S. sobrinus), Ⅰ型菌毛-富脯蛋白(粘放菌), Ⅱ型菌毛-半乳糖残基(粘放菌)[2]。 近来的研究表明，细菌对胶原的亲合也是这种特异受体的作用。胶原是牙周组织的主要成分，至少有Ⅰ、Ⅲ～Ⅶ 6种类型的胶原，并以Ⅰ、Ⅲ型胶原为主[3]。牙骨质和牙本质也是富含胶原的物质，它们在酸性条件下脱矿后，胶原暴露出来而导致细菌粘附于牙齿表面[4]。牙体组织中的胶原主要是Ⅰ型胶原，也有少量Ⅲ型胶原。研究表明，变链菌、粘放菌和乳杆菌的许多菌株都对胶原有亲合力。
Umemoto 和Namikawa[5]曾报道Td 和Ts的相对分子质量为53 000的表面多肽分别是人Ⅰ型和Ⅳ型CBP。但本实验中发现加热的这两种菌无该多肽(表1)，取代它的是Td的58 000、50 000和70 000Ⅰ型CBP,及Ts Ⅳ型的CBP。加热和非加热的Td 和Ts CBP的分子大小发生改变的这种现象说明了螺旋体经过有可溶解缓冲液的加热处理，多肽分解谱发生了改变。在3种螺旋体未加热样品发现的14个CBP中，4个是在细菌外膜上，它们是Td 27 000Ⅴ型、Ts 110 000Ⅰ型、Tm 95 000 Ⅳ型和Ts 95 000 Ⅳ型CBP。其它CBP可能位于胞膜与胞壁之间的复合物上。
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本研究比较了3种螺旋体对CBP的粘附，Td 和Ts 由于有CBP而发生粘附，而Tm有95 000 Ⅳ型CBP却没有因此促进粘附。产生这种现象的原因可能是由于胶原与CBP发生作用时的三维结合机制的某种影响。Td和Ts外膜有较多的多糖[6]，可能会影响CBP对靶器官的结合。
Kennett等[7]曾报道，Td的另一菌株ATCC35405不粘附于Ⅰ型牛血清胶原，而本实验中，Td ATCC33520粘附于Ⅰ型人胶原。加热和非加热的Td的ATCC 35405和ATCC 33520都有相似相对分子质量的Ⅰ型人胎盘CBP[5]，实验结果的不同可能是由于使用了不同的粘附系统。Nakatani等[8]报道在有Td 3 3520的53 000表面蛋白抗血清覆盖的粘附实验中，稀释抗血清减少了粘附，而53 000是CBP参与了螺旋体的特异粘附过程。为确认CBP参与粘附的特异性,尚需做更严密的粘附抑制实验。
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参考文献
[1] 李德懿.牙周病微生物学.第1版.天津：天津科技翻译出版公司,1994.108-110.
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[3] 李成章.胶原与牙周病. 国外医学口腔医学分册,1995,22:70-72.
[4] 郭丽娟，刘天佳. 致龋菌对胶原的粘附.国外医学口腔医学分册,1997,24:283-287.
[5] Umemoto T, Namikawa I. Binding of host-associated treponeme proteins to collagens and laminin: a possible mechanism of spirochetal adherence to host tissues. Microbiol Immunol, 1994,38:655-663.
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[6] Scott D, Klitorinos A, Chan,EC, et al. Visualization of an extracellular mucoid layer of Treponema denticola ATCC 35405 and surface sugar lectin analysis of some Treponema species. Oral Microbiol Immunol, 1997,12:121-125.
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[8] Nakatani Y, Umemoto T, Nakamura Y, et al. Adherence of an oral spirochete Treponema denticola to glass surface in vitro. Jpn J Oral Biol, 1992,34:374-383.
(收稿:1998-06-19 修回:1999-01-26), 百拇医药