单克隆抗体对唾液凝集素介导的茸毛链球菌(S.sobrinus)聚集的影响

http://www.100md.com 《华西口腔医学杂志》 1999年第3期

     作者：张 平 樊明文 边 专 杜民权 李成章

    单位：湖北医科大学口腔医学院 430079

    关键词：单克隆抗体；茸毛链球菌；表面蛋白

    华西口腔医学杂志990308 摘要 目的:用制备的抗茸毛链球菌主要表面蛋白的单克隆抗体作用于茸毛链球菌,体外观察单克隆抗体对唾液凝集素介导的细菌聚集的影响。方法:于紫外分光光度计上通过光密度值检测1 h内的细菌凝集情况。结果:单克隆抗体对唾液凝集素介导的茸毛链球菌之间的聚集有一定程度的影响,但作用不明显。结论:该单克隆抗体可能不是对表面蛋白上与聚集作用有关的功能区直接作用。

    Effects of Monoclonal Antibody Against the Major Cell Surface Protein on Salivary Agglutinin Mediated Aggregation of Streptococcus sobrinus

    Zhang Ping, Fan Mingwen, Bian Zhuan, et al

    College of Stomatology, Hubei Medical University

    Abstract Objective:To investigate the effects of monoclonal antibody on salivary agglutinin-mediated aggregation of Streptococcus sobrinus in vitro.Methods: Bacterial aggregation inhibition was measured under OD₆₅₀ at 10 minutes intervals for 1 hour. Results: It showed that the McAb ZS2/286 raised against the PAg of S.sobrinus 6715 could inhibit the aggregation by some degree, but the effect was not significant. Conclusion: The McAb ZS2/286 might not bind directly to the functionally important region of PAg related to aggregation.

    Key words: monoclonal antibody aggregation Streptococcus sobrinus

    由于致龋菌对牙面的粘附能力是其主要的毒力因素,长期以来,人们普遍关注细菌与口腔中特定部位的相互作用,即细菌的粘附作用。但除了与宿主组织之间的作用外,口腔各菌系之间也有类似作用,即细菌的聚集作用。这两方面相互作用的结果决定细菌在口腔组织中的附着或定植水平。本实验用抗茸毛链球菌主要表面蛋白抗原PAg的单克隆抗体(简称单抗)作用于茸毛链球菌,观察单抗对唾液凝集素介导的细菌聚集的影响,以进一步探讨主要表面蛋白抗原的功能以及单抗在口内的作用方式。

    1 材料和方法

    1.1 单抗的准备

    采用经典的单抗制备方法,即将S.sobrinus6715活细胞免疫的BALB/C小鼠脾细胞与SP2/0-AG14融合,ELISA筛选,有限稀释法克隆化,得到稳定分泌抗PAg的杂交瘤细胞株ZS2/286,经双扩鉴定为IgG/IgG1亚类单抗,Western-blotting显示其在PAg相应位置呈一条带。将其所致小鼠腹水单抗用0.22 μm微孔滤膜过滤备用。

    1.2 唾液凝集素的制备^[1]

    将S.sobrinus 6715于TH培养基中培养18 h,4000 r/min离心10 min收集沉淀细胞,用KBPS洗涤两次后,调菌液浓度至OD₆₅₀=1.0。收集一健康男性成人非刺激性全唾液,4℃,10000 r/min离心收集唾液上清,与等体积细菌悬液及等体积KBPS混合,37℃旋转培养30 min,4000 r/min离心20 min,沉淀细胞用KBPS洗涤后再用含1 mmol/L EDTA的KPBS洗涤,离心,上清用PEG20000浓缩10倍,并用KBPS透析过夜,0.22 μm一次性滤器除菌,即为唾液凝集素。测蛋白质含量,-20℃冻存备用。

    1.3 单抗对唾液凝集素介导的细菌聚集的影响

    将S.sobrinus 6715于TH培养基中培养18 h,4000 r/min离心10 min收集沉淀细胞,用KBPS洗涤两次后,调菌液浓度至OD₆₅₀=1.0。取一系列试管,按表1依次加入各成分,每组一式3份。其中A组是为检测细菌在无唾液凝集素存在的情况下的自凝现象,其余各组凝集素介导的聚集均须去除该本底。

    表1 细菌聚集试验分组设计 组别

    凝集素

    (μl)

    0.1 mol/L

    CaCl₂(μl)

    单抗

    (μl)

    PBS

    (μl)

    菌液(μl)

    A

    0

    12

    0

    400

    800

    B

    100

    12

    0

    300

    800

    C

    100

    12

    50

    250

    800

    D

    100

    12

    100

    200

    800

    E

    100

    12

    200

    100

    800

    F

    100

    12

    300

    0

    800

    加样完毕后紫外分光光度计上测各管的OD₆₅₀值,然后于1 h内每隔10 min检测1次。细菌凝集率按下式计算:细菌凝集百分率=0 min OD₆₅₀-60 min OD₆₅₀/0 min OD₆₅₀×100%;单抗对细菌聚集的抑制率按下式计算:抑制率=无单抗的凝集率-有单抗的凝集率/无单抗的凝集率×100%。2 结 果

    2.1 唾液凝集素

    用紫外分光光度计测唾液凝集素中蛋白质含量。其OD₂₈₀=0.091,OD₂₆₀=0.111,根据经验公式蛋白质浓度(mg/ml)=1.48 OD₂₈₀-0.74 OD₂₆₀得出所制备的凝集素蛋白质浓度为49.81 μg/ml。

    2.2 单抗对唾液凝集素介导的细菌聚集的影响

    由表2可见,无唾液凝集素组于OD₆₅₀未见细菌有明显凝集现象(凝集率仅为10.5%),而加入唾液凝集素后,细菌可发生一定比例的凝集(凝集率为34.5%)。当加入单抗后,细菌凝集现象一定程度被抑制(抑制率5.8%～24.5%),但抑制程度与单抗浓度之间的关系不十分明确。图1显示的是各组细菌凝集及受抑情况。图中各点是按将0 min时OD₆₅₀值调整为0.693后的差值作等值移动后所得。

    表2 各组细菌凝集率及被抑制率 组别

    OD₆₅₀()

    细菌凝集率

    (%)

    单抗对细菌聚集

    的抑制率(%)

    0 min

    60 min

    A

    0.693

    0.620

    10.5

    B

    0.689

    0.451

    34.5

    C

    0.673

    0.450

    33.1

    5.8

    D

    0.689

    0.490

    28.9

    23.3

    E

    0.699

    0.494

    29.3

    21.7

    F

    0.674

    0.481

    28.6

    24.5

    图1 单抗对唾液凝集素介导的细菌聚集的作用

    (以60 min的OD₆₅₀值为准)

    3 讨 论

    唾液中存在有许多能与口腔细菌发生作用的有效成分,如粘蛋白、富脯蛋白、富酪蛋白、硫酸糖蛋白、溶菌酶、纤维连接蛋白和分泌型IgA等,其中类似于粘蛋白的高分子量糖蛋白,又叫唾液凝集素(salivary agglutinin)被认为可与多种口腔链球菌的主要表面蛋白抗原或类似蛋白发生相似作用^[2～4]。这种相似作用存在有两种方式:一种是细菌与牙面上固定的唾液凝集素作用,在口内表现为细菌对牙面的粘附机制;另一种为细菌与唾液中游离的唾液凝集素作用,在口内表现为细菌间的聚集机制。这两种作用方式相互影响,决定了细菌在宿主口内的命运,即细菌是粘附于牙面,还是易于被口腔自洁作用清除。

    变形链球菌主要表面蛋白的主要功能是介导细菌对牙面获得性膜的粘附,同时可促进细菌之间的聚集。有学者研究发现,主要表面蛋白分子上从第816位到1161位氨基酸残基与细菌的粘附作用有关^[5,6]。而主要表面蛋白的氨基末端,包括重复的富含丙氨酸序列可能对细菌的聚集起作用^[4]。有一部分序列可能同时参与细菌的粘附和聚集作用。但关于主要表面蛋白上与唾液凝集素作用的功能区目前尚属未知。研究标明,表面蛋白上与固相唾液凝集素作用的功能区和其与液相唾液凝集素作用的功能区是不一样的。同时,两种状态的凝集素分子暴露的与细菌作用的功能区也不一致。

    本实验研究了抗茸毛链球菌主要表面蛋白抗原PAg的单抗ZS2/286对唾液凝集素介导的细菌聚集的影响,结果显示该单抗对细菌聚集的抑制作用不明显(小于25%),揭示该单抗可能不是与PAg上和聚集作用有关的功能区直接作用。

    Brady等^[4]用覆盖主要表面蛋白全序列的单抗作用于变形链球菌显示,某些单抗只能阻止变形链球菌的粘附,而另一些单抗又只能阻止变形链球菌的聚集。他们推测,与细菌表面原位表面蛋白作用的抗体分子,若结合的部位越远,则结合得越紧密。抑制细菌聚集的单抗可能与相关重要的功能区直接接触,也可以间接地结合于和功能区空间邻近的非功能区,进一步研究表面蛋白的二级或三级结构有助于揭示问题的实质。

    可以推测,根据表面蛋白上与粘附作用有关的氨基酸序列人工合成一小片段多肽,局部运用于口腔,可使其阻碍致龋菌对牙面唾液成分的粘附,而又不干扰细菌聚集这种非免疫性清除机制。

    参考文献

    1 Rundegren JL, Arnold RR. Bacteria-agglutinating characteristics of secretory IgA and a salivary agglutinin. Adv Exp Med Biol, 1987, 216B:1005～1013

    2 Demuth Dr, Lammey MS, Huck M, et al. Comparison of streptococcus mutans and streptococcus sanguis receptors for human salivary agglutinin. Microb Pathog, 1990, 9(1):199～211

    3 Malamud D, Appelbaum B, Line R, et al. Bacterial aggregating activity in saliva comparisons of bacteria species and strains. Infect Immun, 1981, 31(3):1003～1006

    4 Brady LJ, Piacentini DA, Crowley PJ, et al. Differentiation of salivary agglutinin-mediated adherence and aggregation of mutans streptococci by use of monoclonal antibodies against the major surface adhesin P1. Infect Immun, 1992, 60(3):1008～1017

    5 Okahashi N, Sasakawa C, Yoshikawa M, et al. Molecular characterization of a surface protein antigen gene from serotype c streptococcus mutans, implicated in dental caries. Mol Microbiol, 1989, 3(2):673～678

    6 Ojier J, Wachsmann D, Schoeller M, et al. Molecular characterization of the gene sr of the saliva interacting protein from streptococcus mutans OMZ175. Arch Oral Biol, 1990, 35(suppl):25～31

    (1998-08-21收稿,1999-06-01修回)

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