单层上皮细胞角蛋白在口腔粘膜癌变过程中的表达
作者：聂敏海 李秉琦 曾光明 何志秀 陈谦明 周 敏 罗 刚 曾 昕
单位：聂敏海 华西医科大学口腔医学院(现在泸州医学院口腔系) 610041
关键词：口腔；癌前病变；细胞角蛋白
华西口腔医学杂志990304 摘要 目的:探讨单层上皮细胞角蛋白CK18和CK19作为口腔癌前病变标志的可能性。方法:用LSAB免疫组化染色方法检测CK18和CK19在福尔马林固定、石蜡包埋的口腔正常粘膜、上皮单纯增生、轻度上皮异常增生、中度上皮异常增生、重度上皮异常增生和口腔鳞癌组织中的分布和表达强度,光镜观察染色切片,结果用秩和检验分析。结果:正常和异常的口腔粘膜均未检测到CK18;CK19可表达于正常非角化上皮的基底层细胞、异常增生上皮的基底上层细胞及口腔鳞状细胞癌中,阳性细胞数与上皮的异常增生程度及鳞癌的分化程度相关。结论:CK19表达于口腔上皮基底上层细胞可作为诊断口腔癌前病变和判断口腔鳞癌分化程度的候选辅助指标之一。
, 百拇医药
Changes of Simple Epithelial Cytokeratin During Oral Carcinogenesis
Nie Minhai, Li Bingqi, Zeng Guangming, et al
College of Stomatology, West China University of Medical Sciences
Abstract Objective:To investigate whether the simple epithelial cytokeratin CK18 and CK19 can be used as a marker of oral precancerous lesions.Methods: Formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections of normal oral mucosa,epithelial hyperplasia,mild epithelial dysplasia, moderate epithelial dysplasia,severe epithelial dysplasia and oral squamous cell carcinomas were stained with a CK18-specific antibody and CK19-specific antibody respectively by LSAB immunohistochemical method. The stained sections were observed under light microscopy. The results were described and analyzed with Rank Sum Test. Results: CK18 was not detected in normal and abnormal oral tissue sections. But in normal nonkeratinized mucosa, CK19 was detected in the basal cell layer dispersively. In epithelial dysplasia, CK19 was detected in the suprabasal cell layer and the number of CK19-positive cell layers was correlated with the dysplasia degree of epithelia. Furthermore, CK19 was detected in oral squamous cell carcinoma, especially in the poor-differentiated cancer cells. Conclusion: CK19 expression in suprabasal cell layer of oral mucosa can be used as a candidate marker for diagnosis of oral precancerous lesions and determination of the differentiation level of oral squamous cell carcinoma.
, 百拇医药
Key words: oral cavity precancerous lesion cytokeratin
口腔癌占全身恶性肿瘤的3%～5%,其中90%以上为口腔鳞癌,通常认为口腔鳞癌由口腔上皮癌前病变发展而来,早诊断、早治疗可提高患者的5年生存率。但目前尚缺乏客观和敏感的诊断口腔癌前病变的方法。细胞角蛋白(cytokeratin, CK)主要表达于上皮细胞,随细胞类型和分化程度不同而表达类型有差异,具有高度的细胞和组织特异性[1]。通常CK8/CK18和CK19表达于单层上皮,称为单层上皮细胞角蛋白,CK19还可散在表达于非角化复层上皮的基底层。尽管国外已有少数对单层上皮CK在口腔癌前病变中变化的研究,但结论不一致。作者采用免疫组化方法,研究了CK18和CK19在口腔癌前病变中的表达,以探讨单层上皮CK作为口腔癌前病变标志的可能性。
1 材料和方法
1.1 标本来源
, 百拇医药
正常粘膜取自尸检;病变粘膜来自半年内未用过激素类或维甲酸类药物的门诊患者,局麻下活检,组织经10%的中性福尔马林固定,石蜡包埋,5 μm连续切片用于HE染色作出病理诊断和免疫组化染色。
1.2 试剂
鼠抗人CK18单克隆抗体(DC-18)、鼠抗人CK19单克隆抗体(A53-B/A2)(ZYMED公司),LSAB试剂盒、DAB(DAKO公司)。
1.3 免疫组化方法
CK18抗体采用微波处理的LSAB法,用胆囊上皮作阳性对照;CK19抗体采用胰酶处理的LSAB法,用同一批切片中无角化的正常颊粘膜的基底细胞或腺上皮作阳性对照。两种抗体均采用PBS代替一抗作阴性对照。
1.4 分析方法
, 百拇医药 HE切片的诊断由两位有经验的病理医生盲法读片确认。免疫组化结果采用半定量法判定:阴性(-),阳性细胞在基底层或占基底上层的25%以下(±),阳性细胞占基底上层的25%～50%(+),阳性细胞占基底上层的50%～75%(++),阳性细胞占基底上层的75%以上(++),结果采用秩和检验分析。
2 结 果
2.1 临床病理资料
研究对象的临床病理资料见表1。
表1 研究对象的临床病理资料 病理诊断
平均
年龄
(岁)
n
, 百拇医药
部 位
颊
舌背
舌腹
口底
龈
正常粘膜
45
13
5
4
2
2
上纯
, 百拇医药
皮增
单生
无过度角化
55
13
5
5
2
1
有过度角化
50
18
7
7
, 百拇医药
3
1
轻度上皮异常增生
51
18
8
3
5
2
中度上皮异常增生
52
16
9
6
, 百拇医药
1
0
重度上皮异常增生
53
15
6
3
6
0
口腔鳞癌
48
14
5
1
, 百拇医药
7
1
2.2 免疫组化染色结果
口腔正常上皮、单纯增生上皮、口腔癌前病变和口腔鳞癌中均未检测到CK18;而CK19表达于上皮细胞的胞浆中,在不同阶段的病变组织中CK19表达有明显的差异。
正常粘膜 CK19散在表达于基底细胞层,基底上层不表达(图1)。正常牙龈、舌背粘膜上皮未检测到CK19的表达。
图 1 CK19表达于正常颊粘膜的基底层 ×10
上皮单纯增生 单纯增生无过度角化时,舌背和口底CK19表达阴性,而颊、舌腹和牙龈基底上层CK19表达阳性(+),仅1例舌腹标本基底层CK19散在表达,上皮单纯增生伴过度角化时,CK19表达阴性,仅1例舌背标本基底层散在阳性。与其它各组相比,CK19的表达具有显著性差异(P<0.05)。
, 百拇医药
上皮异常增生 ①轻度上皮异常增生:舌背过度不全角化时,CK19阴性,颊粘膜过度正角化时CK19阴性,颊、舌腹和牙龈粘膜过度不全角化时,基底上层CK19阳性(+),基底层阴性。②中度上皮异常增生:颊粘膜基底层阳性,颊和舌腹粘膜基底上层阳性(+++)(图2)。与轻度上皮异常增生组比较CK19的表达无显著性差异(P>0.05),而与重度异常增生组和口腔鳞癌组比较CK19的表达有显著性差异(P<0.05)。③重度上皮异常增生时,上皮全层CK19阳性(+++),与口腔鳞癌组比较,CK19的表达无显著性差异(P>0.05)。
图 2 CK19表达于中度上皮异常增生的基底上层和基底 ×20
口腔鳞癌 无论分化程度如何,CK19均在癌细胞胞浆中表达(图3),但有明显角化珠存在时,CK19表达较弱,与无角化珠存在时CK19强阳性有明显差异。
, http://www.100md.com
图 3 CK19表达于口腔癌癌细胞中 ×40
3 讨 论
1981年,Wu等[2]的研究显示,培养的口腔鳞癌和皮肤癌癌细胞中CK的早期变化为CK19的高水平表达,而培养的正常口腔上皮细胞和皮肤表皮细胞则不表达CK19,提示CK19至少可作为估计恶变的辅助指标。1992年,Coltrera等[3]在上皮单纯增生的基底上层发现CK19的表达,而上皮单纯增生伴过度角化时,尽管也存在单纯增生,但CK19不表达于基底上层,提示过度角化可抑制CK19的表达。但是,随异常增生程度加重,即使有过度角化存在,CK19表达于基底层的频率和表达于基底上层的强度增加,且具有统计学差异。但Coltrera等认为上皮单纯增生的基底上层与异常增生的上皮中CK19的阳性表达间无统计学差异,而本研究则认为CK19在二者中的表达有显著性差异,并认为CK19可以作为诊断口腔癌前病变的辅助指标。与Coltrera等[3]的结果相似。Linberg等[4]研究发现,单纯增生的上皮内CK19的表达与正常粘膜相同,而中、重度上皮异常增生与原位癌的基底层和基底上层细胞恒定表达CK19,认为CK19是与癌前病变有关的异型性细胞的标志;33%的口腔鳞癌不表达CK19,认为CK19基因在疾病晚期关闭所致,分化较好的癌CK19表达阴性。本研究中,所有口腔癌中均检测到CK19,且与癌分化程度有关,进一步证明表达CK19的细胞具有较强的分裂增殖能力。同时本研究显示,口腔鳞癌中如果没有明显的角化珠存在,则CK19呈强阳性表达;当有明显的角化珠存在时,CK19呈斑片状表达,提示CK19可以作为诊断口腔鳞癌分化程度的辅助指标。
, http://www.100md.com
CK8和CK18为单层上皮的标志角蛋白,通常不表达于成熟的复层上皮中,但有学者[5]在部分口腔白斑和口腔癌中检测到CK18的表达。作者在口腔正常上皮和病变上皮中未检测到CK18,而CK18在单层上皮(胆囊上皮)中却呈阳性表达,提示CK18不能作为判定口腔癌前病变的辅助标志。尽管在胎儿口腔上皮中检测到CK18的mRNA和CK18蛋白,但CK18蛋白分布较其mRNA分布范围窄[6],说明CK18存在翻译水平的调控机制,在成熟的复层上皮中,其翻译可能终止。
四川省卫生厅科学研究基金资助(编号 960040)
参考文献
1 Velden LAVD, Schaafsma HE, Mannii JJ, et al. Cytokeratin expression in normal and (pre)malignant head and neck epithelia:an overview. Head Neck, 1993, 15(2):133～146
, 百拇医药
2 Wu YJ, Rheinwald JG. A new small(40kD) keratin filament protein made by some cultured human squamous cell carcinomas. Cell, 1981, 25(3):627～635
3 Coltrera MD, Zarbo RJ, Sakr WA, et al. Markers for dysplasia of the upper aerodigestive tract: Suprabasal expression of PCNA, P53 and CK19 in alcohol-fixed embedded tissue. Am J Pathol, 1992, 141(4):817～825
4 Linberg K, Rheinwald JG. Suprabasal 40 kD keratin(K19) expression as an immunohistologic marker of premalignancy in oral epithelium. Am J Pathol, 1989, 134(1):89～98
, http://www.100md.com
5 Schulz J, Ermich T, Kasper M, et al. Cytokeratin pattern of clinically intact and pathologically changed oral mucosa. Int J Oral Maxillofac Surg, 1992, 21(1):35～39
6 Heikinheimo K, Sandberg M, Happonen RP, et al. Cytos- keletal gene expression in normal and neoplasm human odontogenic epithilia. Laboratory Investigation, 1991, 65(6):688～701
(1999-01-27收稿), 百拇医药
单位：聂敏海 华西医科大学口腔医学院(现在泸州医学院口腔系) 610041
关键词：口腔；癌前病变；细胞角蛋白
华西口腔医学杂志990304 摘要 目的:探讨单层上皮细胞角蛋白CK18和CK19作为口腔癌前病变标志的可能性。方法:用LSAB免疫组化染色方法检测CK18和CK19在福尔马林固定、石蜡包埋的口腔正常粘膜、上皮单纯增生、轻度上皮异常增生、中度上皮异常增生、重度上皮异常增生和口腔鳞癌组织中的分布和表达强度,光镜观察染色切片,结果用秩和检验分析。结果:正常和异常的口腔粘膜均未检测到CK18;CK19可表达于正常非角化上皮的基底层细胞、异常增生上皮的基底上层细胞及口腔鳞状细胞癌中,阳性细胞数与上皮的异常增生程度及鳞癌的分化程度相关。结论:CK19表达于口腔上皮基底上层细胞可作为诊断口腔癌前病变和判断口腔鳞癌分化程度的候选辅助指标之一。
, 百拇医药
Changes of Simple Epithelial Cytokeratin During Oral Carcinogenesis
Nie Minhai, Li Bingqi, Zeng Guangming, et al
College of Stomatology, West China University of Medical Sciences
Abstract Objective:To investigate whether the simple epithelial cytokeratin CK18 and CK19 can be used as a marker of oral precancerous lesions.Methods: Formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections of normal oral mucosa,epithelial hyperplasia,mild epithelial dysplasia, moderate epithelial dysplasia,severe epithelial dysplasia and oral squamous cell carcinomas were stained with a CK18-specific antibody and CK19-specific antibody respectively by LSAB immunohistochemical method. The stained sections were observed under light microscopy. The results were described and analyzed with Rank Sum Test. Results: CK18 was not detected in normal and abnormal oral tissue sections. But in normal nonkeratinized mucosa, CK19 was detected in the basal cell layer dispersively. In epithelial dysplasia, CK19 was detected in the suprabasal cell layer and the number of CK19-positive cell layers was correlated with the dysplasia degree of epithelia. Furthermore, CK19 was detected in oral squamous cell carcinoma, especially in the poor-differentiated cancer cells. Conclusion: CK19 expression in suprabasal cell layer of oral mucosa can be used as a candidate marker for diagnosis of oral precancerous lesions and determination of the differentiation level of oral squamous cell carcinoma.
, 百拇医药
Key words: oral cavity precancerous lesion cytokeratin
口腔癌占全身恶性肿瘤的3%～5%,其中90%以上为口腔鳞癌,通常认为口腔鳞癌由口腔上皮癌前病变发展而来,早诊断、早治疗可提高患者的5年生存率。但目前尚缺乏客观和敏感的诊断口腔癌前病变的方法。细胞角蛋白(cytokeratin, CK)主要表达于上皮细胞,随细胞类型和分化程度不同而表达类型有差异,具有高度的细胞和组织特异性[1]。通常CK8/CK18和CK19表达于单层上皮,称为单层上皮细胞角蛋白,CK19还可散在表达于非角化复层上皮的基底层。尽管国外已有少数对单层上皮CK在口腔癌前病变中变化的研究,但结论不一致。作者采用免疫组化方法,研究了CK18和CK19在口腔癌前病变中的表达,以探讨单层上皮CK作为口腔癌前病变标志的可能性。
1 材料和方法
1.1 标本来源
, 百拇医药
正常粘膜取自尸检;病变粘膜来自半年内未用过激素类或维甲酸类药物的门诊患者,局麻下活检,组织经10%的中性福尔马林固定,石蜡包埋,5 μm连续切片用于HE染色作出病理诊断和免疫组化染色。
1.2 试剂
鼠抗人CK18单克隆抗体(DC-18)、鼠抗人CK19单克隆抗体(A53-B/A2)(ZYMED公司),LSAB试剂盒、DAB(DAKO公司)。
1.3 免疫组化方法
CK18抗体采用微波处理的LSAB法,用胆囊上皮作阳性对照;CK19抗体采用胰酶处理的LSAB法,用同一批切片中无角化的正常颊粘膜的基底细胞或腺上皮作阳性对照。两种抗体均采用PBS代替一抗作阴性对照。
1.4 分析方法
, 百拇医药 HE切片的诊断由两位有经验的病理医生盲法读片确认。免疫组化结果采用半定量法判定:阴性(-),阳性细胞在基底层或占基底上层的25%以下(±),阳性细胞占基底上层的25%～50%(+),阳性细胞占基底上层的50%～75%(++),阳性细胞占基底上层的75%以上(++),结果采用秩和检验分析。
2 结 果
2.1 临床病理资料
研究对象的临床病理资料见表1。
表1 研究对象的临床病理资料 病理诊断
平均
年龄
(岁)
n
, 百拇医药
部 位
颊
舌背
舌腹
口底
龈
正常粘膜
45
13
5
4
2
2
上纯
, 百拇医药
皮增
单生
无过度角化
55
13
5
5
2
1
有过度角化
50
18
7
7
, 百拇医药
3
1
轻度上皮异常增生
51
18
8
3
5
2
中度上皮异常增生
52
16
9
6
, 百拇医药
1
0
重度上皮异常增生
53
15
6
3
6
0
口腔鳞癌
48
14
5
1
, 百拇医药
7
1
2.2 免疫组化染色结果
口腔正常上皮、单纯增生上皮、口腔癌前病变和口腔鳞癌中均未检测到CK18;而CK19表达于上皮细胞的胞浆中,在不同阶段的病变组织中CK19表达有明显的差异。
正常粘膜 CK19散在表达于基底细胞层,基底上层不表达(图1)。正常牙龈、舌背粘膜上皮未检测到CK19的表达。
图 1 CK19表达于正常颊粘膜的基底层 ×10
上皮单纯增生 单纯增生无过度角化时,舌背和口底CK19表达阴性,而颊、舌腹和牙龈基底上层CK19表达阳性(+),仅1例舌腹标本基底层CK19散在表达,上皮单纯增生伴过度角化时,CK19表达阴性,仅1例舌背标本基底层散在阳性。与其它各组相比,CK19的表达具有显著性差异(P<0.05)。
, 百拇医药
上皮异常增生 ①轻度上皮异常增生:舌背过度不全角化时,CK19阴性,颊粘膜过度正角化时CK19阴性,颊、舌腹和牙龈粘膜过度不全角化时,基底上层CK19阳性(+),基底层阴性。②中度上皮异常增生:颊粘膜基底层阳性,颊和舌腹粘膜基底上层阳性(+++)(图2)。与轻度上皮异常增生组比较CK19的表达无显著性差异(P>0.05),而与重度异常增生组和口腔鳞癌组比较CK19的表达有显著性差异(P<0.05)。③重度上皮异常增生时,上皮全层CK19阳性(+++),与口腔鳞癌组比较,CK19的表达无显著性差异(P>0.05)。
图 2 CK19表达于中度上皮异常增生的基底上层和基底 ×20
口腔鳞癌 无论分化程度如何,CK19均在癌细胞胞浆中表达(图3),但有明显角化珠存在时,CK19表达较弱,与无角化珠存在时CK19强阳性有明显差异。
, http://www.100md.com
图 3 CK19表达于口腔癌癌细胞中 ×40
3 讨 论
1981年,Wu等[2]的研究显示,培养的口腔鳞癌和皮肤癌癌细胞中CK的早期变化为CK19的高水平表达,而培养的正常口腔上皮细胞和皮肤表皮细胞则不表达CK19,提示CK19至少可作为估计恶变的辅助指标。1992年,Coltrera等[3]在上皮单纯增生的基底上层发现CK19的表达,而上皮单纯增生伴过度角化时,尽管也存在单纯增生,但CK19不表达于基底上层,提示过度角化可抑制CK19的表达。但是,随异常增生程度加重,即使有过度角化存在,CK19表达于基底层的频率和表达于基底上层的强度增加,且具有统计学差异。但Coltrera等认为上皮单纯增生的基底上层与异常增生的上皮中CK19的阳性表达间无统计学差异,而本研究则认为CK19在二者中的表达有显著性差异,并认为CK19可以作为诊断口腔癌前病变的辅助指标。与Coltrera等[3]的结果相似。Linberg等[4]研究发现,单纯增生的上皮内CK19的表达与正常粘膜相同,而中、重度上皮异常增生与原位癌的基底层和基底上层细胞恒定表达CK19,认为CK19是与癌前病变有关的异型性细胞的标志;33%的口腔鳞癌不表达CK19,认为CK19基因在疾病晚期关闭所致,分化较好的癌CK19表达阴性。本研究中,所有口腔癌中均检测到CK19,且与癌分化程度有关,进一步证明表达CK19的细胞具有较强的分裂增殖能力。同时本研究显示,口腔鳞癌中如果没有明显的角化珠存在,则CK19呈强阳性表达;当有明显的角化珠存在时,CK19呈斑片状表达,提示CK19可以作为诊断口腔鳞癌分化程度的辅助指标。
, http://www.100md.com
CK8和CK18为单层上皮的标志角蛋白,通常不表达于成熟的复层上皮中,但有学者[5]在部分口腔白斑和口腔癌中检测到CK18的表达。作者在口腔正常上皮和病变上皮中未检测到CK18,而CK18在单层上皮(胆囊上皮)中却呈阳性表达,提示CK18不能作为判定口腔癌前病变的辅助标志。尽管在胎儿口腔上皮中检测到CK18的mRNA和CK18蛋白,但CK18蛋白分布较其mRNA分布范围窄[6],说明CK18存在翻译水平的调控机制,在成熟的复层上皮中,其翻译可能终止。
四川省卫生厅科学研究基金资助(编号 960040)
参考文献
1 Velden LAVD, Schaafsma HE, Mannii JJ, et al. Cytokeratin expression in normal and (pre)malignant head and neck epithelia:an overview. Head Neck, 1993, 15(2):133～146
, 百拇医药
2 Wu YJ, Rheinwald JG. A new small(40kD) keratin filament protein made by some cultured human squamous cell carcinomas. Cell, 1981, 25(3):627～635
3 Coltrera MD, Zarbo RJ, Sakr WA, et al. Markers for dysplasia of the upper aerodigestive tract: Suprabasal expression of PCNA, P53 and CK19 in alcohol-fixed embedded tissue. Am J Pathol, 1992, 141(4):817～825
4 Linberg K, Rheinwald JG. Suprabasal 40 kD keratin(K19) expression as an immunohistologic marker of premalignancy in oral epithelium. Am J Pathol, 1989, 134(1):89～98
, http://www.100md.com
5 Schulz J, Ermich T, Kasper M, et al. Cytokeratin pattern of clinically intact and pathologically changed oral mucosa. Int J Oral Maxillofac Surg, 1992, 21(1):35～39
6 Heikinheimo K, Sandberg M, Happonen RP, et al. Cytos- keletal gene expression in normal and neoplasm human odontogenic epithilia. Laboratory Investigation, 1991, 65(6):688～701
(1999-01-27收稿), 百拇医药