转化生长因子-β1对培养的人眼小梁细胞微丝肌动蛋白的影响
作者：钟丽春 李美玉
单位：100034 北京医科大学第一医院眼科
关键词：细胞；小梁；生长因子；肌动蛋白；青光眼；开角型
中华眼科杂志990308 【摘要】 目的 了解转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)对培养的人眼小梁细胞微丝肌动蛋白的影响,探讨房水引流阻力在原发性开角型青光眼(primary&127;open angle glaucoma,POAG)的病因和发病机制中的作用。方法 小梁网来源于除眼部疾患以外的各种原因死亡的6岁以下儿童,在24h内取材于34例68只正常眼球。用各相对质量浓度的TGF-β1及中和抗体进行人眼小梁细胞原代和传代培养，于光镜和电镜下观察培养的人眼小梁细胞。结果 根据培养细胞的生长特性和形态特征,以及细胞外基质染色特点等,确定培养的细胞为人眼小梁细胞。各浓度组与对照组比较,TGF-β1使张力纤维束增多,F-肌动蛋白含量增加,β-肌动蛋白mRNA表达增强;其上调作用呈时间依赖性;TGF-β1中和抗体可拮抗此作用。TGF-β1在高浓度、作用时间延长时,使汇合前的小梁细胞生长增殖抑制、细胞膜破裂及细胞脱落。结论 将逆转录-半定量多聚酶链式反应用于POAG研究领域,可加速、加强定量分析在基因水平上的POAG病因研究。TGF-β1在一定范围内上调培养的人眼小梁细胞微丝肌动蛋白,可加强小梁细胞收缩能力,有利于降低小梁网房水引流阻力。
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Influenceof transforming growth factor-β1 on actin in cultured human trabecular cells ZHONG Lichun, LI Meiyu. Department of Ophthalmology, First School of Clinical Medicine, Beijing Medical University, Beijing 100034
【Abstract】 Objective To understand transforming growth factor-β1 (TFG-β1) influencing microfilament actins in cultured human trabecular cells (HTCs) and approach to the effect of resistance of aqueous outflow in the pathogenesis and mechanism of primary open angle glaucoma (POAG). Methods Trabecular meshwork was collected from 68 eyeballs of 34 human donors under 6 years old within 24 hours after death. HTCs were primarily cultured and subcultured. Cultured cells were observed by light and electron microscopes. Laminin (LN) and IVcollagen (IVC) in extracellular matrix (ECM) were immunohistochemically stained by S-P method. Various doses (0, 1, 5 ng/ml) of TFG-β1 and 30 μg/ml neutralizing antibody of TFG-β1 were respectively added to the third passage cells before confluence and acted for 6, 12, 24 hours. Stress fibers stained with fluorescein isocyanate (FITC)-phalloidin were observed under light and electron microscopes. Various doses (0, 0.5, 1, 5 ng/ml) of TFG-β1 and 30 μg/ml neutralizing antibody of TFG-β1 were respectively added to the third passage cells after confluence for one week and acted for 6, 12, 24, 48 hours. The positive numbers of labeled F-actins were quantitatively evaluated by flow cytometry. Various doses (0, 0.5, 1, 5 ng/ml) of TFG-β1 and 30 μg/ml neutralizing antibody of TFG-β1 were respectively added to the third passage cells after confluence for one week and acted for 6, 12, 24, 36, 48 hours. The amount of β-actin mRNA expression was semi-quantitatively evaluated by densitometry with reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) using specific oligonucleotide primers for β-actin and glyceraldehyde-3-phophate dehydrogenase (G3PDH) as an internal standard. Results According to the growing characteristics and morphological features of the cultured cells, they were identified as HTCs. In comparison with the control group, TGF-β1 could increase the stress fibrous bundle, the contents of F-actins and the expression of β-actin mRNA; the effects of TFG-β1 appeared time dependent and were antagonized by neutralizing antibody of TFG-β1. When TFG-β1 was at higher concentration and longer acting time, cell proliferation was inhibited, cell membrane ruptured and cells peeled off in cultured HTCs before confluence. Conclusions Application of reverse transcription-semiquantitative PCR can promote the pathogenic research of POAG at genetic level, in a certain extent, TFG-β1 can obviously upregulate microfilament actins in the confluent HTCs, enhance the contractility of trabecular cells and decrease the resistance of aqueous outflow in trabecular meshwork.
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【Key words】 Cells, trabecular Growth factor Actin Glaucoma, open angle
原发性开角型青光眼(primary open angle glaucoma,POAG)是致盲的主要疾病之一,POAG的视神经损害是由于小梁网房水引流阻力增加使眼压升高所致。受各种因素调节的小梁细胞形态与功能异常使小梁网清除和吞噬能力下降,细胞外基质堆积等,以致引起房水引流阻力增加。细胞骨架微丝肌动蛋白是小梁细胞功能活动的主要结构基础,其数量与质量直接影响到小梁细胞的形态与功能。转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是活跃于眼部的多肽细胞生长因子,推测TGF-β1可能通过调节小梁细胞微丝肌动蛋白而参与小梁网房水引流活动。
材料与方法
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一、标本来源
小梁网来源于除眼部疾患以外的各种原因死亡的6岁以下儿童,在24h内取材于34例68只正常眼球。
二、人眼小梁细胞体外培养
在解剖显微镜下找到Schawlbe线和巩膜突的小梁网前、后界,用玻璃针插入Schlemm管内,在玻璃针与巩膜突之间环形切开Schlemm管,从Schwalbe线处分离下小梁网。小梁网组织块原代培养,胰蛋白酶消化传代培养,传3代细胞用于实验研究。
三、培养细胞光镜和电镜标本制备
传3代汇合前和汇合后的细胞铺片分别进行Wright-Giemsa染色、常规电镜标本制备及细胞外基质染色,包括层粘连蛋白(Laminin,LN)与Ⅳ型胶原(Ⅳ collagen,Ⅳ C)免疫组化S-P法染色;用相对质量浓度TGF-β1为0、1、5ng/ml和TGF-β1中和抗体为30μg/ml,作用于传3代汇合前的小梁细胞铺片6、12、24h,经异硫氰酸荧光素-鬼笔环肽(fluorescien isothiocyanate, FITC-phalloidin)染色;用光镜和电镜观察培养的细胞、细胞外基质及张力纤维束形态。
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四、流式细胞计测定
相对质量浓度TGF-β1为0、0.5、1、5ng/ml,TGF-β1中和抗体为30μg/ml,分别作用于传3代汇合后1周的小梁细胞6、12、24、48h，共20个样品经FITC-phalloidin染色,流式细胞仪定量测定F-肌动蛋白的相对荧光强度。
五、细胞总RNA提取和逆转录-多聚酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain,RT-PCR)
TGF-β1相对质量浓度为0、0.5、1、5ng/ml,分别作用于传3代汇合后1周的小梁细胞3、6、12、24、36、48h,共24个样品,每个样品细胞计数后用异硫氢酸胍、酚、氯仿等一步法抽提细胞总RNA[1]。每个样品在进行RT-PCR实验前RNA浓度调整为1μg/μl。人的β-肌动蛋白引物序列(460bp),上游:5′CAG AGC AAG AGA GGC ATC3′,下游:5′TGT CAC GCA CGA TTT CCC GC3′;内参照人的甘油醛-3-磷酸酯脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,G3PDH)引物序列(214bp),下游:5′CCA TCA CCA TCT TCC A3′,5′AGG CTG TTG TCA TAC TTC TC 3′。热循环RT-PCR仪条件设置:43℃，30min；94℃，1min；50℃，30s；72℃，1.5min；15～36个循环数。以PCR产物进行2%琼脂糖电泳,用可见紫外光检测仪观察与摄像,薄层光密度扫描仪半定量测定DNA电泳带光密度吸收值。
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六、统计学处理方法
选用方差分析的F检验、q检验及直线相关分析。
结果
一、培养细胞的细胞鉴定
原代培养6～28天细胞从组织块向外生长,6～8周细胞围绕在组织块周围形成单细胞层。传代培养24h后多数细胞已贴壁,2或3周细胞汇合形成单细胞层(图1)。汇合后的细胞均匀一致且数量衡定,细胞可稳定1或2个月,2个月后开始降解,可传至8或9代。光镜下见汇合前细胞形态呈三角形或梭形,汇合后细胞形成一单细胞层,胞突重叠,但胞体不重叠。扫描电镜下细胞表面有均匀分布的短状微绒毛和包涵体小囊突起。透射电镜下均可见各种细胞器丰富、核膜不明显,有黑色峰带状楔形异染色质位于核膜内侧。培养细胞的细胞外基质免疫组化S-P法染色显示LN和ⅣC阳性。综上所述,从培养细胞的生长特性、形态特征和LN、ⅣC阳性S-P法染色特点确定培养的细胞为人眼小梁细胞。
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图1 传代培养的人眼小梁细胞汇合形成单细胞层 ×100
二、TGF-β1对培养的人眼小梁细胞微丝肌动蛋白的影响
从张力纤维束形态、F-肌动蛋白含量及β-肌动蛋白mRNA表达强度3方面分析。张力纤维束构成微丝,F-肌动蛋白组成张力纤维束,β-肌动蛋白是F-肌动蛋白的基本成分。
1.张力纤维束形态:TGF-β1各浓度组与对照组比较,随着作用时间的延长而张力纤维束增多,各时间组随着浓度升高而不增多,加有中和抗体者不增多。高浓度、作用时间延长者汇合前细胞生长增殖抑制,细胞膜破裂,细胞脱落(图2～8)。
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图2 未加TGF-β1时的张力纤维束，纤维纤细，纵向分布 FITC-phalloidin染色×400
细胞,小梁 生长因子 肌动蛋白 青光眼,开角型
图3 TGF-β1为1ng/ml，作用6小时，张力纤维束增多、增粗 FITC-phalloidin染色 ×400
图4 TGF-β1为1ng/ml，作用12小时，张力纤维束增多、增粗，纵横交错；同一浓度的TGF-β1作用时间延长，其张力纤维束增多明显 FITC-phalloidin染色×400
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图5 TGF-β1为1ng/ml，作用12小时，张力纤维束增多、增粗，纵横交错；同一作用时间，浓度升高时张力纤维束增多不明显，可见细胞生长增殖抑制,细胞膜破裂,细胞脱落 FITC-phalloidin染色×400
图6 未加TGF-β1的张力纤维束，纤维纤细，纵向分布 透射电镜×27000
图7 TGF-β1为1ng/ml，作用24小时，张力纤维束增多、增粗 透射电镜×27000
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图8 TGF-β1为1ng/ml，加TGF-β1中和抗体为30μg/ml，作用24小时，张力纤维束纤维纤细，纵向分布，与未加TGF-β1时的张力纤维束形态相似 透射电镜×40000
2.F-肌动蛋白含量:流式细胞计检测每个样品的相对荧光强度，即为一定细胞数所含F-肌动蛋白的含量(表1)。经统计学处理,各浓度组与对照组的F-肌动蛋白含量比较,差异均有显著性(P<0.01);各浓度组随着作用时间的延长含量增加(r=0.889,P<0.05);而各时间组随着浓度升高含量不增加(r=0.675,P>0.05);加有TGF-β1中和抗体者含量不增加(P>0.05)。
表1 TGF-β1各相对质量浓度中20个样品不同时间的细胞数和相对荧光强度参数 TGF-β1
, 百拇医药 相对质量浓度
(ng/ml)
6h
12h
24h
48h
细胞数
荧光强度参数
(
±s)
细胞数
荧光强度参数
, 百拇医药
(±s)
细胞数
荧光强度参数
(±s)
细胞数
荧光强度参数
(±s)
, 百拇医药
0
7032
38.70±2.90
6204
41.34±2.50
4990
37.88±2.14
2813
38.99±3.01
0.5
7717
100.58±2.50
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6365
123.38±2.24
7670
132.63±2.85
6139
158.86±2.30
1
6615
120.20±2.66
5341
155.13±2.47
5666
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161.37±2.12
7417
171.43±2.03
5
6549
159.86±2.75
4658
183.93±2.00
7570
194.21±3.05
4999
206.71±3.41
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1+Ab
6521
40.12±2.89
5300
39.88±2.10
7083
40.10±2.70
6720
36.12±2.98
3.β-肌动蛋白mRNA表达强度:每个样品的细胞计数和RNA提取实验重复4次取其平均值。24个样品细胞数平均为3107万个,细胞RNA含量平均为81.43μg(表2)。每个样品的RNA电泳带清晰,OD值均为1.9。在进行RT-半定量PCR实验之前,首先确定β-肌动蛋白和内参照G3PDH二者PCR产量的对数增长期。在RNA相对质量浓度为2.25μg/μl、30循环数以前为β-肌动蛋白的PCR产量的对数增长期;在RNA相对质量浓度为2.25μg/ul、33循环数以前为G3PDH的PCR产量的对数增长期;在RNA相对质量浓度为2.25μg/μl、30循环数以前均为β-肌动蛋白和G3PDH的PCR产量的对数增长期。因此,选择RNA相对质量浓度为2.25μg/μl、28循环数进行RT-半定量PCR实验(表3)。24个样品每次实验均为同批实验品，重复3次,但重复实验时可能由于非同批实验品造成的差异性,使每个样品在3次实验中的β-肌动蛋白和G3PDH的PCR产量各不相同，但3次实验中β-肌动蛋白/G3PDH的PCR产量的比值一致性达到0.1。24个无RNA的阴性对照样品重复3次均为阴性(图8，9)(表4)。
, 百拇医药
表2 TGF-β1各相对质量浓度中24个样品不同时间的细胞数和RNA含量 TGF-β1
相对质量浓度
(ng/ml)
3h
6h
12h
24h
36h
48h
细胞数
(104)
, 百拇医药
RNA
(μg)
细胞数
(104)
RNA
(μg)
细胞数
(104)
RNA
(μg)
细胞数
(104)
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RNA
(μg)
细胞数
(104)
RNA
(μg)
细胞数
(104)
RNA
(μg)
0
3036
79.6
, 百拇医药
3175
83.2
3103
81.3
3085
80.9
2982
78.2
3175
83.2
0.5
3047
79.7
, 百拇医药
3129
82.0
3126
81.9
3017
79.1
3255
85.3
3049
79.9
1
3164
82.9
, 百拇医药
3082
80.8
3122
81.8
3035
79.6
3055
80.1
3083
80.8
5
3209
84.1
, 百拇医药
3095
81.1
3217
84.3
2990
78.4
3085
80.9
3244
85.0
表3 不同RNA浓度各循环数的PCR产量参数(μg/μl) RNA浓度
(μg/μl)
, 百拇医药
各循环数的PCR产量参数
15
18
21
24
27
30
33
36
β-肌动蛋白
18
0.286
0.582
, 百拇医药
1.168
2.322
4.140
4.620
4.638
4.641
2.25
0.208
0.290
0.581
1.166
2.321
4.638
, 百拇医药
4.620
4.637
1.15
-
0.210
0.300
0.586
1.167
2.322
4.640
4.638
G3PDH
18
, 百拇医药
0.204
0.282
0.578
1.162
2.326
4.640
4.639
4.642
2.25
-
0.209
0.292
0.582
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1.168
2.322
4.642
4.639
1.15
-
-
0.212
0.301
0.581
1.168
2.318
4.640
, 百拇医药
2.25
0.212
0.294
0.584
1.164
2.324
4.640
4.639
4.642
β-肌动蛋白+
G3PDH
-
0.210
, 百拇医药
0.293
0.584
1.170
2.324
4.640
4.638
注：“-”示未取得数据
图9 左：从下向上依次为：1示PGEM7Zf(+)DNAmarker，从左向右为657、458、434、267、174、142、102、80bp。2示无RNA,28循环数阴性对照。3～10示RNA浓度为2.25μg/μl,在15、18、21、24、27、30、33、36循环数的β-肌动蛋白(460bp,左侧电泳带)和G3PDH(214bp,右侧电泳带)的PCR产物电泳图
, 百拇医药
图9 中：从下向上依次为：1示PGEM7Zf(+)DNAmarker，从左向右为657、458、434、267、174、142、102、80bp。2～13示左侧电泳带为β-肌动蛋白(460bp)和右侧电泳带为G3PDH(214bp)。2～5示TGF-β1依次为0、0.5、1、5ng/ml,作用3小时。6～9示TGF-β1依次为0、0.5、1、5ng/ml,作用6小时。10～13示TGF-β1依次为0、0.5、1、5ng/ml,作用12小时
图9 右：从下向上依次为：1示PGEM7Zf(+)DNAmarker,从左向右为657、458、434、267、174、142、102、80bp。2～13示左侧电泳带为β-肌动蛋白460bp和右侧电泳带为G3PDH214bp。2～5示TGF-β1依次为0、0.5、1、5ng/ml，作用24小时。6～9示TGF-β1依次为0、0.5、1、5ng/ml,作用36小时。10～13示TGF-β1依次为0、0.5、1、5ng/ml，作用48小时
, 百拇医药
表4 TGF-β124个样品细胞数β-肌动蛋白/G3PDH比值参数 TGF-β1
相对质量
浓度(ng/ml)
不同时间的β-肌动蛋白/G3PDH比值参数
3h
6h
12h
24h
36h
48h
0
, 百拇医药
1.3175
1.2678
1.2725
1.2768
1.2762
1.2980
0.5
1.8410
1.8471
3.0654
3.6724
4.1172
, 百拇医药 4.2804
1
2.8154
2.8292
4.0947
4.1943
4.2692
4.4324
5
2.8328
2.9286
4.3951
4.4504
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4.5141
4.8402
经统计学处理,各浓度组与对照组的β-肌动蛋白mRNA表达强度比较,差异均有显著性(P<0.001);各浓度组随着作用时间的延长表达增强(r=882,P<0.001);各时间组随着浓度的升高表达不增强(r=0.672,P=0.05)。TGF-β1对转录水平β-肌动蛋白mRNA表达增强的影响与对蛋白水平F-肌动蛋白含量增加的影响结果一致。
讨论
一、RT-半定量PCR技术在POAG病因研究中的应用
RT-PCR技术是从少量细胞中提取总RNA,扩增大量特异性DNA序列。Tripathi等[2]于1993年首次选用RT-PCR技术,从有限的培养小梁细胞中提取总RNA,通过扩增特异性DNA序列以了解小梁细胞是否表达TGF-β1的mRNA等。本组设立内参照和测定PCR产量电泳带光密度吸收值等,对RT-PCR产量进行半定量分析,以了解TGF-β1对β-肌动蛋白mRNA表达的影响,将定量研究引入POAG病因研究中,为这一研究领域提供了一种有效实用的研究手段。
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二、TGF-β1对微丝肌动蛋白的正调节效应
本组研究结果表明,TGF-β1使培养的人眼小梁细胞张力纤维束增多,F-肌动蛋白含量增加,β-肌动蛋白mRNA增强，其转录水平和翻译水平结果一致;与TGF-β1对其他非肌肉细胞微丝肌动蛋白的影响也一致[3]。Tamm等[4]发现,TGF-β1对培养的人和猴眼小梁细胞α-肌动蛋白mRNA表达增强,使小梁细胞向肌成纤维细胞方向转化。这表明TGF-β1对小梁细胞微丝肌动蛋白正调节效应为多方面。此种正调节机制尚不清楚,可能发生在转录水平。
三、TGF-β1对房水引流的调节
有资料表明，培养的猪眼小梁细胞可产生TGF-β1、β2,其细胞膜上存在有与之相结合的受体[2,5-7]。TGF-β1参与小梁网房水引流的功能活动,可能通过增加小梁网细胞外基质堆积等使房水引流阻力增加;也可能通过加强小梁细胞的收缩与运动功能,使房水引流阻力降低。在一定范围内,TGF-β1上调培养的小梁细胞微丝肌动蛋白,使细胞收缩与运动能力适当增强,利于房水引流;如果细胞收缩与运动能力过度增强,使小梁网挛缩,失去弹性,孔闭锁等，则不利于房水引流。因此,TGF-β1必须使小梁细胞的收缩和运动功能与小梁网房水引流功能相协调,才能调节眼内压在正常范围。反之则可能使眼压升高,导致POAG发生。
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四、TGF-β1在高浓度、作用时间延长时对培养的人眼小梁细胞形态与生长增殖的影响
TGF-β1在高浓度、作用时间延长时,使汇合前的细胞生长增殖抑制,细胞膜破裂,细胞脱落;而对汇合后的细胞影响则不明显。TGF-β1对生长增殖旺盛的汇合前细胞抑制作用明显,而对生长增殖缓慢或停止的汇合后细胞抑制作用不明显,这与对小梁细胞生长增殖产生刺激作用的成纤维细胞生长因子作用机制相似。
参考文献
1 Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate phenol chloroform extraction. Anal Biochem, 1987,162:156-159.
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2 Tripathi RC, Li JP, Borisuth NSC, et al. Trabecular cells of the eye express mRNA for TGF-β1 and secrete this cytokine. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1993,34: 2562-2569.
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7 Borisuth NSC,Tripathi BJ, Tripathi RC. Identification and partial characterization of TGF-β1 receptors on trabecular cells. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1992, 33:596-603.
(收稿：1998-10-26 修回：1999-02-13), http://www.100md.com
单位：100034 北京医科大学第一医院眼科
关键词：细胞；小梁；生长因子；肌动蛋白；青光眼；开角型
中华眼科杂志990308 【摘要】 目的 了解转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)对培养的人眼小梁细胞微丝肌动蛋白的影响,探讨房水引流阻力在原发性开角型青光眼(primary&127;open angle glaucoma,POAG)的病因和发病机制中的作用。方法 小梁网来源于除眼部疾患以外的各种原因死亡的6岁以下儿童,在24h内取材于34例68只正常眼球。用各相对质量浓度的TGF-β1及中和抗体进行人眼小梁细胞原代和传代培养，于光镜和电镜下观察培养的人眼小梁细胞。结果 根据培养细胞的生长特性和形态特征,以及细胞外基质染色特点等,确定培养的细胞为人眼小梁细胞。各浓度组与对照组比较,TGF-β1使张力纤维束增多,F-肌动蛋白含量增加,β-肌动蛋白mRNA表达增强;其上调作用呈时间依赖性;TGF-β1中和抗体可拮抗此作用。TGF-β1在高浓度、作用时间延长时,使汇合前的小梁细胞生长增殖抑制、细胞膜破裂及细胞脱落。结论 将逆转录-半定量多聚酶链式反应用于POAG研究领域,可加速、加强定量分析在基因水平上的POAG病因研究。TGF-β1在一定范围内上调培养的人眼小梁细胞微丝肌动蛋白,可加强小梁细胞收缩能力,有利于降低小梁网房水引流阻力。
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Influenceof transforming growth factor-β1 on actin in cultured human trabecular cells ZHONG Lichun, LI Meiyu. Department of Ophthalmology, First School of Clinical Medicine, Beijing Medical University, Beijing 100034
【Abstract】 Objective To understand transforming growth factor-β1 (TFG-β1) influencing microfilament actins in cultured human trabecular cells (HTCs) and approach to the effect of resistance of aqueous outflow in the pathogenesis and mechanism of primary open angle glaucoma (POAG). Methods Trabecular meshwork was collected from 68 eyeballs of 34 human donors under 6 years old within 24 hours after death. HTCs were primarily cultured and subcultured. Cultured cells were observed by light and electron microscopes. Laminin (LN) and IVcollagen (IVC) in extracellular matrix (ECM) were immunohistochemically stained by S-P method. Various doses (0, 1, 5 ng/ml) of TFG-β1 and 30 μg/ml neutralizing antibody of TFG-β1 were respectively added to the third passage cells before confluence and acted for 6, 12, 24 hours. Stress fibers stained with fluorescein isocyanate (FITC)-phalloidin were observed under light and electron microscopes. Various doses (0, 0.5, 1, 5 ng/ml) of TFG-β1 and 30 μg/ml neutralizing antibody of TFG-β1 were respectively added to the third passage cells after confluence for one week and acted for 6, 12, 24, 48 hours. The positive numbers of labeled F-actins were quantitatively evaluated by flow cytometry. Various doses (0, 0.5, 1, 5 ng/ml) of TFG-β1 and 30 μg/ml neutralizing antibody of TFG-β1 were respectively added to the third passage cells after confluence for one week and acted for 6, 12, 24, 36, 48 hours. The amount of β-actin mRNA expression was semi-quantitatively evaluated by densitometry with reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) using specific oligonucleotide primers for β-actin and glyceraldehyde-3-phophate dehydrogenase (G3PDH) as an internal standard. Results According to the growing characteristics and morphological features of the cultured cells, they were identified as HTCs. In comparison with the control group, TGF-β1 could increase the stress fibrous bundle, the contents of F-actins and the expression of β-actin mRNA; the effects of TFG-β1 appeared time dependent and were antagonized by neutralizing antibody of TFG-β1. When TFG-β1 was at higher concentration and longer acting time, cell proliferation was inhibited, cell membrane ruptured and cells peeled off in cultured HTCs before confluence. Conclusions Application of reverse transcription-semiquantitative PCR can promote the pathogenic research of POAG at genetic level, in a certain extent, TFG-β1 can obviously upregulate microfilament actins in the confluent HTCs, enhance the contractility of trabecular cells and decrease the resistance of aqueous outflow in trabecular meshwork.
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【Key words】 Cells, trabecular Growth factor Actin Glaucoma, open angle
原发性开角型青光眼(primary open angle glaucoma,POAG)是致盲的主要疾病之一,POAG的视神经损害是由于小梁网房水引流阻力增加使眼压升高所致。受各种因素调节的小梁细胞形态与功能异常使小梁网清除和吞噬能力下降,细胞外基质堆积等,以致引起房水引流阻力增加。细胞骨架微丝肌动蛋白是小梁细胞功能活动的主要结构基础,其数量与质量直接影响到小梁细胞的形态与功能。转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是活跃于眼部的多肽细胞生长因子,推测TGF-β1可能通过调节小梁细胞微丝肌动蛋白而参与小梁网房水引流活动。
材料与方法
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一、标本来源
小梁网来源于除眼部疾患以外的各种原因死亡的6岁以下儿童,在24h内取材于34例68只正常眼球。
二、人眼小梁细胞体外培养
在解剖显微镜下找到Schawlbe线和巩膜突的小梁网前、后界,用玻璃针插入Schlemm管内,在玻璃针与巩膜突之间环形切开Schlemm管,从Schwalbe线处分离下小梁网。小梁网组织块原代培养,胰蛋白酶消化传代培养,传3代细胞用于实验研究。
三、培养细胞光镜和电镜标本制备
传3代汇合前和汇合后的细胞铺片分别进行Wright-Giemsa染色、常规电镜标本制备及细胞外基质染色,包括层粘连蛋白(Laminin,LN)与Ⅳ型胶原(Ⅳ collagen,Ⅳ C)免疫组化S-P法染色;用相对质量浓度TGF-β1为0、1、5ng/ml和TGF-β1中和抗体为30μg/ml,作用于传3代汇合前的小梁细胞铺片6、12、24h,经异硫氰酸荧光素-鬼笔环肽(fluorescien isothiocyanate, FITC-phalloidin)染色;用光镜和电镜观察培养的细胞、细胞外基质及张力纤维束形态。
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四、流式细胞计测定
相对质量浓度TGF-β1为0、0.5、1、5ng/ml,TGF-β1中和抗体为30μg/ml,分别作用于传3代汇合后1周的小梁细胞6、12、24、48h，共20个样品经FITC-phalloidin染色,流式细胞仪定量测定F-肌动蛋白的相对荧光强度。
五、细胞总RNA提取和逆转录-多聚酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain,RT-PCR)
TGF-β1相对质量浓度为0、0.5、1、5ng/ml,分别作用于传3代汇合后1周的小梁细胞3、6、12、24、36、48h,共24个样品,每个样品细胞计数后用异硫氢酸胍、酚、氯仿等一步法抽提细胞总RNA[1]。每个样品在进行RT-PCR实验前RNA浓度调整为1μg/μl。人的β-肌动蛋白引物序列(460bp),上游:5′CAG AGC AAG AGA GGC ATC3′,下游:5′TGT CAC GCA CGA TTT CCC GC3′;内参照人的甘油醛-3-磷酸酯脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,G3PDH)引物序列(214bp),下游:5′CCA TCA CCA TCT TCC A3′,5′AGG CTG TTG TCA TAC TTC TC 3′。热循环RT-PCR仪条件设置:43℃，30min；94℃，1min；50℃，30s；72℃，1.5min；15～36个循环数。以PCR产物进行2%琼脂糖电泳,用可见紫外光检测仪观察与摄像,薄层光密度扫描仪半定量测定DNA电泳带光密度吸收值。
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六、统计学处理方法
选用方差分析的F检验、q检验及直线相关分析。
结果
一、培养细胞的细胞鉴定
原代培养6～28天细胞从组织块向外生长,6～8周细胞围绕在组织块周围形成单细胞层。传代培养24h后多数细胞已贴壁,2或3周细胞汇合形成单细胞层(图1)。汇合后的细胞均匀一致且数量衡定,细胞可稳定1或2个月,2个月后开始降解,可传至8或9代。光镜下见汇合前细胞形态呈三角形或梭形,汇合后细胞形成一单细胞层,胞突重叠,但胞体不重叠。扫描电镜下细胞表面有均匀分布的短状微绒毛和包涵体小囊突起。透射电镜下均可见各种细胞器丰富、核膜不明显,有黑色峰带状楔形异染色质位于核膜内侧。培养细胞的细胞外基质免疫组化S-P法染色显示LN和ⅣC阳性。综上所述,从培养细胞的生长特性、形态特征和LN、ⅣC阳性S-P法染色特点确定培养的细胞为人眼小梁细胞。
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图1 传代培养的人眼小梁细胞汇合形成单细胞层 ×100
二、TGF-β1对培养的人眼小梁细胞微丝肌动蛋白的影响
从张力纤维束形态、F-肌动蛋白含量及β-肌动蛋白mRNA表达强度3方面分析。张力纤维束构成微丝,F-肌动蛋白组成张力纤维束,β-肌动蛋白是F-肌动蛋白的基本成分。
1.张力纤维束形态:TGF-β1各浓度组与对照组比较,随着作用时间的延长而张力纤维束增多,各时间组随着浓度升高而不增多,加有中和抗体者不增多。高浓度、作用时间延长者汇合前细胞生长增殖抑制,细胞膜破裂,细胞脱落(图2～8)。
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图2 未加TGF-β1时的张力纤维束，纤维纤细，纵向分布 FITC-phalloidin染色×400
细胞,小梁 生长因子 肌动蛋白 青光眼,开角型
图3 TGF-β1为1ng/ml，作用6小时，张力纤维束增多、增粗 FITC-phalloidin染色 ×400
图4 TGF-β1为1ng/ml，作用12小时，张力纤维束增多、增粗，纵横交错；同一浓度的TGF-β1作用时间延长，其张力纤维束增多明显 FITC-phalloidin染色×400
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图5 TGF-β1为1ng/ml，作用12小时，张力纤维束增多、增粗，纵横交错；同一作用时间，浓度升高时张力纤维束增多不明显，可见细胞生长增殖抑制,细胞膜破裂,细胞脱落 FITC-phalloidin染色×400
图6 未加TGF-β1的张力纤维束，纤维纤细，纵向分布 透射电镜×27000
图7 TGF-β1为1ng/ml，作用24小时，张力纤维束增多、增粗 透射电镜×27000
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图8 TGF-β1为1ng/ml，加TGF-β1中和抗体为30μg/ml，作用24小时，张力纤维束纤维纤细，纵向分布，与未加TGF-β1时的张力纤维束形态相似 透射电镜×40000
2.F-肌动蛋白含量:流式细胞计检测每个样品的相对荧光强度，即为一定细胞数所含F-肌动蛋白的含量(表1)。经统计学处理,各浓度组与对照组的F-肌动蛋白含量比较,差异均有显著性(P<0.01);各浓度组随着作用时间的延长含量增加(r=0.889,P<0.05);而各时间组随着浓度升高含量不增加(r=0.675,P>0.05);加有TGF-β1中和抗体者含量不增加(P>0.05)。
表1 TGF-β1各相对质量浓度中20个样品不同时间的细胞数和相对荧光强度参数 TGF-β1
, 百拇医药 相对质量浓度
(ng/ml)
6h
12h
24h
48h
细胞数
荧光强度参数
(
±s)细胞数
荧光强度参数
, 百拇医药
(
±s)细胞数
荧光强度参数
(
±s)细胞数
荧光强度参数
(
±s), 百拇医药
0
7032
38.70±2.90
6204
41.34±2.50
4990
37.88±2.14
2813
38.99±3.01
0.5
7717
100.58±2.50
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6365
123.38±2.24
7670
132.63±2.85
6139
158.86±2.30
1
6615
120.20±2.66
5341
155.13±2.47
5666
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161.37±2.12
7417
171.43±2.03
5
6549
159.86±2.75
4658
183.93±2.00
7570
194.21±3.05
4999
206.71±3.41
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1+Ab
6521
40.12±2.89
5300
39.88±2.10
7083
40.10±2.70
6720
36.12±2.98
3.β-肌动蛋白mRNA表达强度:每个样品的细胞计数和RNA提取实验重复4次取其平均值。24个样品细胞数平均为3107万个,细胞RNA含量平均为81.43μg(表2)。每个样品的RNA电泳带清晰,OD值均为1.9。在进行RT-半定量PCR实验之前,首先确定β-肌动蛋白和内参照G3PDH二者PCR产量的对数增长期。在RNA相对质量浓度为2.25μg/μl、30循环数以前为β-肌动蛋白的PCR产量的对数增长期;在RNA相对质量浓度为2.25μg/ul、33循环数以前为G3PDH的PCR产量的对数增长期;在RNA相对质量浓度为2.25μg/μl、30循环数以前均为β-肌动蛋白和G3PDH的PCR产量的对数增长期。因此,选择RNA相对质量浓度为2.25μg/μl、28循环数进行RT-半定量PCR实验(表3)。24个样品每次实验均为同批实验品，重复3次,但重复实验时可能由于非同批实验品造成的差异性,使每个样品在3次实验中的β-肌动蛋白和G3PDH的PCR产量各不相同，但3次实验中β-肌动蛋白/G3PDH的PCR产量的比值一致性达到0.1。24个无RNA的阴性对照样品重复3次均为阴性(图8，9)(表4)。
, 百拇医药
表2 TGF-β1各相对质量浓度中24个样品不同时间的细胞数和RNA含量 TGF-β1
相对质量浓度
(ng/ml)
3h
6h
12h
24h
36h
48h
细胞数
(104)
, 百拇医药
RNA
(μg)
细胞数
(104)
RNA
(μg)
细胞数
(104)
RNA
(μg)
细胞数
(104)
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RNA
(μg)
细胞数
(104)
RNA
(μg)
细胞数
(104)
RNA
(μg)
0
3036
79.6
, 百拇医药
3175
83.2
3103
81.3
3085
80.9
2982
78.2
3175
83.2
0.5
3047
79.7
, 百拇医药
3129
82.0
3126
81.9
3017
79.1
3255
85.3
3049
79.9
1
3164
82.9
, 百拇医药
3082
80.8
3122
81.8
3035
79.6
3055
80.1
3083
80.8
5
3209
84.1
, 百拇医药
3095
81.1
3217
84.3
2990
78.4
3085
80.9
3244
85.0
表3 不同RNA浓度各循环数的PCR产量参数(μg/μl) RNA浓度
(μg/μl)
, 百拇医药
各循环数的PCR产量参数
15
18
21
24
27
30
33
36
β-肌动蛋白
18
0.286
0.582
, 百拇医药
1.168
2.322
4.140
4.620
4.638
4.641
2.25
0.208
0.290
0.581
1.166
2.321
4.638
, 百拇医药
4.620
4.637
1.15
-
0.210
0.300
0.586
1.167
2.322
4.640
4.638
G3PDH
18
, 百拇医药
0.204
0.282
0.578
1.162
2.326
4.640
4.639
4.642
2.25
-
0.209
0.292
0.582
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1.168
2.322
4.642
4.639
1.15
-
-
0.212
0.301
0.581
1.168
2.318
4.640
, 百拇医药
2.25
0.212
0.294
0.584
1.164
2.324
4.640
4.639
4.642
β-肌动蛋白+
G3PDH
-
0.210
, 百拇医药
0.293
0.584
1.170
2.324
4.640
4.638
注：“-”示未取得数据
图9 左：从下向上依次为：1示PGEM7Zf(+)DNAmarker，从左向右为657、458、434、267、174、142、102、80bp。2示无RNA,28循环数阴性对照。3～10示RNA浓度为2.25μg/μl,在15、18、21、24、27、30、33、36循环数的β-肌动蛋白(460bp,左侧电泳带)和G3PDH(214bp,右侧电泳带)的PCR产物电泳图
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图9 中：从下向上依次为：1示PGEM7Zf(+)DNAmarker，从左向右为657、458、434、267、174、142、102、80bp。2～13示左侧电泳带为β-肌动蛋白(460bp)和右侧电泳带为G3PDH(214bp)。2～5示TGF-β1依次为0、0.5、1、5ng/ml,作用3小时。6～9示TGF-β1依次为0、0.5、1、5ng/ml,作用6小时。10～13示TGF-β1依次为0、0.5、1、5ng/ml,作用12小时
图9 右：从下向上依次为：1示PGEM7Zf(+)DNAmarker,从左向右为657、458、434、267、174、142、102、80bp。2～13示左侧电泳带为β-肌动蛋白460bp和右侧电泳带为G3PDH214bp。2～5示TGF-β1依次为0、0.5、1、5ng/ml，作用24小时。6～9示TGF-β1依次为0、0.5、1、5ng/ml,作用36小时。10～13示TGF-β1依次为0、0.5、1、5ng/ml，作用48小时
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表4 TGF-β124个样品细胞数β-肌动蛋白/G3PDH比值参数 TGF-β1
相对质量
浓度(ng/ml)
不同时间的β-肌动蛋白/G3PDH比值参数
3h
6h
12h
24h
36h
48h
0
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1.3175
1.2678
1.2725
1.2768
1.2762
1.2980
0.5
1.8410
1.8471
3.0654
3.6724
4.1172
, 百拇医药 4.2804
1
2.8154
2.8292
4.0947
4.1943
4.2692
4.4324
5
2.8328
2.9286
4.3951
4.4504
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4.5141
4.8402
经统计学处理,各浓度组与对照组的β-肌动蛋白mRNA表达强度比较,差异均有显著性(P<0.001);各浓度组随着作用时间的延长表达增强(r=882,P<0.001);各时间组随着浓度的升高表达不增强(r=0.672,P=0.05)。TGF-β1对转录水平β-肌动蛋白mRNA表达增强的影响与对蛋白水平F-肌动蛋白含量增加的影响结果一致。
讨论
一、RT-半定量PCR技术在POAG病因研究中的应用
RT-PCR技术是从少量细胞中提取总RNA,扩增大量特异性DNA序列。Tripathi等[2]于1993年首次选用RT-PCR技术,从有限的培养小梁细胞中提取总RNA,通过扩增特异性DNA序列以了解小梁细胞是否表达TGF-β1的mRNA等。本组设立内参照和测定PCR产量电泳带光密度吸收值等,对RT-PCR产量进行半定量分析,以了解TGF-β1对β-肌动蛋白mRNA表达的影响,将定量研究引入POAG病因研究中,为这一研究领域提供了一种有效实用的研究手段。
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二、TGF-β1对微丝肌动蛋白的正调节效应
本组研究结果表明,TGF-β1使培养的人眼小梁细胞张力纤维束增多,F-肌动蛋白含量增加,β-肌动蛋白mRNA增强，其转录水平和翻译水平结果一致;与TGF-β1对其他非肌肉细胞微丝肌动蛋白的影响也一致[3]。Tamm等[4]发现,TGF-β1对培养的人和猴眼小梁细胞α-肌动蛋白mRNA表达增强,使小梁细胞向肌成纤维细胞方向转化。这表明TGF-β1对小梁细胞微丝肌动蛋白正调节效应为多方面。此种正调节机制尚不清楚,可能发生在转录水平。
三、TGF-β1对房水引流的调节
有资料表明，培养的猪眼小梁细胞可产生TGF-β1、β2,其细胞膜上存在有与之相结合的受体[2,5-7]。TGF-β1参与小梁网房水引流的功能活动,可能通过增加小梁网细胞外基质堆积等使房水引流阻力增加;也可能通过加强小梁细胞的收缩与运动功能,使房水引流阻力降低。在一定范围内,TGF-β1上调培养的小梁细胞微丝肌动蛋白,使细胞收缩与运动能力适当增强,利于房水引流;如果细胞收缩与运动能力过度增强,使小梁网挛缩,失去弹性,孔闭锁等，则不利于房水引流。因此,TGF-β1必须使小梁细胞的收缩和运动功能与小梁网房水引流功能相协调,才能调节眼内压在正常范围。反之则可能使眼压升高,导致POAG发生。
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四、TGF-β1在高浓度、作用时间延长时对培养的人眼小梁细胞形态与生长增殖的影响
TGF-β1在高浓度、作用时间延长时,使汇合前的细胞生长增殖抑制,细胞膜破裂,细胞脱落;而对汇合后的细胞影响则不明显。TGF-β1对生长增殖旺盛的汇合前细胞抑制作用明显,而对生长增殖缓慢或停止的汇合后细胞抑制作用不明显,这与对小梁细胞生长增殖产生刺激作用的成纤维细胞生长因子作用机制相似。
参考文献
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(收稿：1998-10-26 修回：1999-02-13), http://www.100md.com