兔眼人工晶体植入术后虹膜、晶体上皮细胞纤溶酶原激活物抑制物-1mRNA的表达
作者：吴强 杨冠 陈国辉 戴友林
单位：200233上海市第六人民医院眼科
关键词：虹膜；晶体；上皮细胞；纤溶酶原激活物抑制物-1
中华眼科杂志990318 【摘要】 目的 观察具有合成纤溶酶原激活物抑制物-1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)蛋白酶的虹膜、晶体上皮细胞在晶体摘除联合人工晶体植入术后其合成的PAI-1量的变化,以阐述PAI-1对白内障囊外摘除联合人工晶体植入术后纤维蛋白反应和后囊膜混浊形成的作用。方法 8只新西兰白兔，均1只眼经晶体囊外摘除术后在晶体囊袋内植入人工晶体,另1只眼未手术作为正常对照;每2只兔眼(2只手术眼和2只未手术眼)分别在术后第1、7、15、30天时,取出整个虹膜和晶体囊膜组织,抽取RNA;应用逆反转录-聚合酶链反应技术观测各标本中PAI-1mRNA表达量的变化,数据进行统计学分析处理。结果 在术后第1天,虹膜和晶体上皮细胞的PAI-1mRNA表达量即出现明显的升高;在虹膜组织中,PAI-1mRNA这种高水平表达可持续到术后15天(P<0.001),但在术后30天时,其表达量又降至正常(P=0.87);而晶体上皮细胞PAI-1mRNA的表达量,在术后1、7、15、30天时术眼显著高于正常对侧眼(P<0.001)。结论 PAI-1可能是引起白内障囊外摘除联合人工晶体植入术后纤维蛋白反应的主要原因,同时它对后囊膜混浊的发展也起到重要的作用。
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Plasminogen activator inhibitor-1 mRNA expression by the iris and lens epithelial cells of rabbit eye with intraocular lens implantation WU Qiang, YANG Guan, CHEN Guohui, et al. Department of Ophthalmology, Shanghai No.6 Hospital, Shanghai 200233
【Abstract】 Objective To investigate the change of plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) synthesized by the iris and the lens epithelial cells (LECs) after extracapsular cataract extraction (ECCE) with intraocular lens (IOL) implantation and the role of PAI-1 in the occurrence of fibrin reaction and the formation of posterior capsular opacification. Methods Eight adult rabbits were studied. In each rabbit, one eye underwent ECCE with IOL implantation and the other eye was normal without any surgical intervention. The iris tissue and the lens capsule of each two normal eyes and each two surgical eyes were excised on the postoperative 1, 7, 15 and 30 days respectively. The amount of PAI-1 mRNA expresson in the specimens was detected by using reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). The data were analyzed statistically. Results The amount of PAI-1 mRNA expresson in the iris tissue and the LECs of the surgical eyes displayed a significant increase on the first day after operation. The high expression of PAI-1 mRNA by the iris might last 15 days (P<0.001), but it declined to the normal range on the postoperative 30 days (P=0.87). The high level of PAI-1 mRNA expresson by the LECs in the surgical eyes had significant difference when compared with that of the normal eyes at 1, 7, 15 and 30 days postoperatively (P<0.001). Conclusion It is indicated that PAI-1 enzyme is a major cause for fibrin reaction after ECCE with IOL implantation, and may play critical roles in the development of posterior capsular opacification.
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【Key words】 Iris Lens Epithelial cells Plasminogen activator inhibitor-1
纤溶酶原激活物抑制物-1(plasminogen activator inhibitor-1, PAI-1)是一种广泛存在于机体内的蛋白酶，它起到特异的抑制纤溶酶原激活物(plasminogen activators,PAs)对纤溶酶原的激活。多项研究资料表明，PAI-1不但对血循环中的纤维蛋白降解起到抑制作用，而且还可对细胞外基质蛋白的降解起到保护性作用[1]。另外的研究还发现，PAI-1也是一种急性相反应的成分，在术后、外伤、心肌梗塞发生时，血循环中的PAI-1水平明显升高[2]。白内障囊外摘除联合人工晶体植入术后，术眼常不可避免地发生纤维蛋白反应。这种纤维蛋白反应的发生是否是由存在在眼房水内的PAI-1水平发生改变而导致的结果，我们应用逆反转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerse chain reaction，RT-PCR)分子生物学技术，对合成PAI-1的虹膜组织、晶体上皮细胞进行研究，从PAI-1基因的转录水平揭示术后眼房水内PAI-1量的动态变化，以阐述PAI-1对眼内纤维蛋白反应所起到的重要调节作用。
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材料和方法
一、主要试剂和仪器
1.试剂：鼠白血病病毒反转录酶(moloney murine leukemia virus reverse transcriptase,M-MLVRT)(美国Gibco Brl公司产品)，dNTP、随机引物、Tag酶、RNsin(美国Promega公司产品)。
2.仪器:PCR仪(PERKIN ELMER48，美国产)，计算机图像分析仪(Image Analysis System,德国产)，超速低温离心机(HERMLE ZK380，德国产)，紫外分光光度仪(Ultrospec 300，瑞典产)。
二、方法
1.实验对象及标本的制备:选用本院动物房提供的新西兰白兔8只，体重2.5～3.0kg。1只眼未进行手术作为正常对照眼,另1只眼植入人工晶体(美国Ocularvision公司产品)。方法如下：术前用1%阿托品散瞳；兔耳缘静脉注射1%戊巴比妥钠35mg/kg麻醉。用尖刀片于上方角巩缘处做10～2点钟方位的角膜缘切口,用截囊针在前囊上方做“-”字形截囊[3]，娩核，使用双管套针注吸皮质，在粘弹性物质的支撑下植入人工晶体。缝合角巩膜切口，结膜下注射庆大霉素4万U，术后每天给予复方磺胺醋酰钠眼药水、土霉素眼膏点眼治疗。每2只兔为一组，分别于术后1、3、7、15、30天时处死动物，显微镜操作下切取兔眼的虹膜和晶体囊膜组织，置入冻存管，液氮内保存以备组织RNA提取用。
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2.组织标本的RNA提取：将所截取的未手术兔眼和人工晶体植入术后不同时期的兔眼虹膜和晶体囊膜，用匀浆器制成组织匀浆,然后依次加入RNA快速提取试剂和氯仿-异丙醇后，经高速离心进行标本的RNA提取;所提取的16份标本RNA，经紫外分光光度仪测定，其吸光度(A)260nm/(A)280nm比值为1.7～1.98。
3.组织标本mRNA的逆反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)：参照Wagner等[4]介绍的方法,并作适当修改。
引物序列：
PAI-1(约360bp)
5′ATG-GAA-TTC-CCG-TGG-AAC-AAG-AAT-GAG-ATC-AG 3′
3′GAG-ACA-CGG-GTA-CTA-CCG-AGT 5′
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β-actin(828bp)
5′ATC-TGG-CAC-CAC-CTT-CTA-CAA-TGA-GCT-GC 3′
3′CGT-CTA-CAC-CTA-GTC-GTT-CGT-CCT-CAT-ACT-GC 5′
在20μl反应体系中加有随机引物0.2μl、RNsin1μl、待测组织细胞RNA2μg、5倍缓冲液4μl、10mmol/LdNTP1μl、M-MLVRT200IU，最后用Depc处理水补充总量，37℃下放置60min，然后升高温度至90℃下5min，再迅速下降温度;将反转录产物10μl加入包含有10倍缓冲剂液5μl、25mmol/LMgCl24μl、10mmol/LdNTP2μl、上、下引物各3μl、Tag酶0.4μl的反应体系中，用Depc处理水补充总量达50μl，石蜡油封住反应体系液面，分别按如下反应条件在PCR仪上进行cDNA的扩增。PAI-1：94℃下3min，然后94℃下15s、54℃下30s、72℃下30s，28个循环，最后在72℃下再放置10min。β-actin：94℃下3min、60℃下1min、72℃下2min1个循环后，接94℃下45s、60℃下1min、72℃下45s，循环30次，最后在72℃下再放置10min。
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4.cDNA电泳：将聚合酶链反应(PCR)产物和载样缓冲液加入1%琼脂糖凝胶加样槽中电泳，电压5V/cm，电泳时间1h，然后用0.5μg/ml溴乙锭染色25min，摄片，计算机图像分析仪进行吸光度(A)扫描测定。
5.统计学处理方法：所测到各条带吸光度(A)值采用SAS-6.04计算机软件包进行统计分析处理。所有未手术眼和手术眼均进行F检验，术后不同时期的术眼和未手术对侧眼之间用Duncan检验进行两两比较。
结果
所有手术眼和未手术眼的虹膜组织细胞和晶体上皮细胞均显示出2条清楚的条带,其长度经PCR标记(mark)确定PAI-1mRNA为360bp、β-actin为828bp。
一、兔眼人工晶体植入术前、后虹膜组织PAI-1mRNA的表达
, http://www.100md.com 术后第1天，虹膜组织细胞内PAI-1mRNA表达即出现明显的升高，这种增高的表达水平可持续到术后15天(P<0.001);而在术后30天时，虹膜组织细胞PAI-1mRNA的表达量即恢复到正常水平,统计学上差异无显著性(P=0.87)(表1，图1)。
表1 兔眼术前、后虹膜组织PAI-1mRNA表达的吸光度(A)值的方差分析 术后时间
(天)
眼数
PAI-1mRNA吸光度(A)值(
±s)
F值
P值
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未手术眼
手术眼
1
2
0.66±0.03
1.99±0.09
91.28
0.0007
7
2
0.67±0.02
1.85±0.09
79.26
, 百拇医药
0.0009
15
2
0.60±0.01
1.96±0.06
262.80
0.0001
30
2
0.62±0.02
0.64±0.07
0.03
0.8700
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1分子量mark 2阴性对照 3阳性对照(兔肝细胞) 4正常对照
5术后第1天 6术后第7天 7术后第15天 8术后30天
图1 兔眼术前、后虹膜组织PAI-1mRNA的表达
二、兔眼人工晶体植入术前、后晶体上皮细胞PAI-1mRNA的表达
术后第1天，晶体上皮细胞内PAI-1mRNA也同样出现明显的升高(P<0.001)，并且在术后7、15和30天时术眼PAI-1mRNA表达的吸光度(A)值经表达的β-actin吸光度(A)值校正后，与校正后的对侧未手术眼的PAI-1mRNA表达吸光度(A)值比较，统计学上差异有非常显著性(P<0.001)(表2,图2)。
表2 兔眼术前、后晶体上皮细胞PAI-1mRNA表达的吸光度(A)值的方差分析 术后时间
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(天)
眼数
PAI-1mRNA吸光度(A)值(±s)
F值
P值
未手术眼
手术眼
1
2
0.58±0.02
, 百拇医药 2.02±0.05
371.16
0.0001
7
2
0.68±0.09
1.75±0.05
135.33
0.0003
15
2
0.69±0.03
1.82±0.05
, 百拇医药
205.26
0.0001
30
2
0.58±0.04
1.40±0.09
36.55
0.0038
1分子量mark 2阴性对照 3阳性对照(兔肝细胞) 4正常对照
, http://www.100md.com 5术后第1天 6术后第7天7术后第15天 8术后30天
图2 兔眼术前、后晶体上皮细胞PAI-1mRNA的表达
讨论
房水是一包含有多种生物活性物质的液体。近年我们的研究已发现，在正常眼房水内有PAI-1蛋白酶的存在，其活性及含量明显低于血浆中所含有的PAI-1；生理状态下存在于房水内的PAI-1蛋白酶其主要来源于虹膜组织的合成，但在白内障囊外摘除联合人工晶体植入术后,囊膜的完整性受到破坏,晶体上皮细胞直接与房水接触,由晶体上皮细胞合成的PAI-1可释放进入房水而构成房水中PAI-1的一个重要来源。
PAI-1属于丝氨酸蛋白酶类，是纤溶酶原激活物(PAs)的生理抑制剂；而PAs在体内是起到特异的激活纤溶酶的作用。激活的纤溶酶可促使纤维蛋白水解，形成可溶性肽段，同时，具有活性的纤溶酶还具有直接降解层粘连蛋白、纤粘连蛋白，或通过激活胶原酶而降解胶原蛋白等细胞外基质蛋白的作用[5]。PAI-1通过抑制PAs，降低了PAs对纤溶酶的激活作用，避免了细胞外基质蛋白的过度降解，对细胞外基质蛋白起到保护性机制的作用；PAI-1水平的升高将形成一个抑制蛋白质降解为主的蛋白质降解-蛋白质降解抑制的动态平衡。
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白内障囊外摘除联合人工晶体植入术后，血-房水屏障的破坏，纤维蛋白原、炎性细胞以及一些活性介质渗出进入房水中，在凝血酶的作用下可溶性纤维蛋白原被转变成不溶性的纤维蛋白。在正常情况下，这些不溶性纤维蛋白可由房水中纤溶系统的纤溶酶降解清除。在白内障囊外摘除联合人工晶体植入术后，纤溶酶活性的相对低下，房水内常有纤维蛋白的沉积，严重者形成纤维凝块或纤维膜。这种房水内纤溶系统功能的相对低下是否是由存在于房水内PAI-1水平发生改变的结果，我们对植入人工晶体的兔眼进行研究，发现虹膜组织以及残留在囊膜上裸露于房水中可表现出活跃的生物学功能的晶体上皮细胞，在术后第1天其PAI-1的mRNA表达水平远远高于生理状态下的表达水平；这种高水平的PAI-1mRNA表达在虹膜组织可持续到术后15天,但在术后30天时又降至正常;而在晶体上皮细胞内PAI-1mRNA的表达量自术后第1天开始到术后30天时一直持续较高的水平，在30天后其表达量虽有所下降，但是仍高于正常水平。这与临床观察的白内障囊外摘除联合人工晶体植入术后纤维蛋白反应持续的时间基本一致[6]，说明房水内PAI-1水平的增高是导致白内障囊外摘除联合人工晶体植入术后纤维蛋白反应、纤维膜形成的重要原因。
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这种白内障囊外摘除联合人工晶体植入术后眼房水内PAI-1水平的增高，在临床上具有很重要的病理作用。首先，它使房水内降解纤维蛋白的能力下降，纤维蛋白出现沉积，纤维凝块和纤维膜形成。有研究报道，纤维蛋白具有影响细胞的迁移、生长、分化的重要作用[7]。Vidauri-Leal等[8]观察发现，纤维蛋白还可刺激视网膜色素上皮细胞向成纤维细胞的转变，后者具有迁徙性和收缩性。在组织的损伤修复过程中，一旦细胞发生纤维样化生后即表现出细胞生长迅速，胶原合成、沉积、细胞外基质重建等一系列生物学特性[8]。白内障囊外摘除联合人工晶体植入术后，房水内纤溶系统的功能相对低下，纤维蛋白极易形成，在晶体后囊膜上发生沉积，趋使晶体上皮细胞向后囊膜迁移，而且它还可作为晶体上皮细胞生长的初期细胞外基质成分，诱使晶体上皮细胞表现出一系列的成纤维细胞所具有的生物学特性。其次，房水内的高PAI-1水平降低了房水内的蛋白质降解系统的功能，因而起到避免由转化后的晶体上皮细胞所合成的细胞外基质蛋白的过多降解作用。因此，房水内PAI-1水平的增高所引起纤维蛋白的沉积，促进了晶体上皮细胞的迁移、生长，并发生纤维样化生，高水平的PAI-1又降低了房水内蛋白质降解系统对纤维样化生的晶体上皮细胞合成的细胞外基质蛋白的清除作用，最终导致转化的晶体上皮细胞在后囊膜上的生长、增殖，大量的细胞外基质蛋白在后囊膜上沉积，晶体后囊膜发生混浊，使光线透过受阻，视力受损。
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然而，这种引起术后眼虹膜组织和晶体上皮细胞表达PAI-1增高的原因目前尚不完全清楚。作为对机体的生长发育和损伤反应起到多种调节功能的细胞因子，可能在血-房水屏障破坏后，自血浆渗出到房水中，和/或由眼前段组织细胞分泌而来，以内分泌、自分泌和旁分泌方式刺激眼虹膜组织和晶体上皮细胞表达PAI-1，从而使房水中的PAI-1水平增高。目前有关对影响眼虹膜组织和晶体上皮细胞合成PAI-1的因素及调节机制的认识，尚需更进一步的研究。
卫生部第二届全国中青年眼科会议优秀论文一等奖
参考文献
1 Van Den Berg EA, Sprengers ED, Jaye M,et al. Regulation of plasminogen activator inhibitor-1 mRNA in human endothelial cells. Thromb Haemostas, 1988，60:63-67.
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2 Emeis JJ, Hoekzema R, de Vos AF. Inhibiting interleukin-1 and tumor necrosis factor-α does not reduce induction of plasminogen activator inhibitor type-1 by endotoxin in rats in vivo. Blood, 1995，85:115-120.
3 何守志, 主编. 白内障及其现代手术治疗学. 北京：人民军医出版社出版. 1992.95-102.
4 Wagner J, Jan-Danser AH, Derkx FHM, et al. Demonstration of renin mRNA, angiotensinogen mRNA, and angiotensin converting enzyme mRNA expression in the human eye: evidence for an intraocular renin-angiotensin system. Br J Ophthalmol, 1996，80:159-163.
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5 Bosma PJ, Van Den Berg EA, Kooistra T. Human plasminogen activator inhibitor-1 gene. J Biol Chem, 1988，263:9129-9148.
6 周朝晖. 人工晶体植入术后眼内炎症反应的组织病理学基础. 国外医学眼科学分册, 1994，18：107-113.
7 Tuan TL, Song A, Chang S, et al. In vitro fibroplasia：matrix contraction, cell growth, and collagen production of fibroblasts cultured in fibrin gels. Exp Cell Res, 1996，223:127-134.
8 Vidauri-Leal JS, Glaser BM. Effect of fibrin on morphologic characteristics of retinal pigment epithelial cells. Arch Ophthalmol, 1984，102:1376-1379.
(收稿：1998-08-19 修回1999-01-26 ), http://www.100md.com
单位：200233上海市第六人民医院眼科
关键词：虹膜；晶体；上皮细胞；纤溶酶原激活物抑制物-1
中华眼科杂志990318 【摘要】 目的 观察具有合成纤溶酶原激活物抑制物-1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)蛋白酶的虹膜、晶体上皮细胞在晶体摘除联合人工晶体植入术后其合成的PAI-1量的变化,以阐述PAI-1对白内障囊外摘除联合人工晶体植入术后纤维蛋白反应和后囊膜混浊形成的作用。方法 8只新西兰白兔，均1只眼经晶体囊外摘除术后在晶体囊袋内植入人工晶体,另1只眼未手术作为正常对照;每2只兔眼(2只手术眼和2只未手术眼)分别在术后第1、7、15、30天时,取出整个虹膜和晶体囊膜组织,抽取RNA;应用逆反转录-聚合酶链反应技术观测各标本中PAI-1mRNA表达量的变化,数据进行统计学分析处理。结果 在术后第1天,虹膜和晶体上皮细胞的PAI-1mRNA表达量即出现明显的升高;在虹膜组织中,PAI-1mRNA这种高水平表达可持续到术后15天(P<0.001),但在术后30天时,其表达量又降至正常(P=0.87);而晶体上皮细胞PAI-1mRNA的表达量,在术后1、7、15、30天时术眼显著高于正常对侧眼(P<0.001)。结论 PAI-1可能是引起白内障囊外摘除联合人工晶体植入术后纤维蛋白反应的主要原因,同时它对后囊膜混浊的发展也起到重要的作用。
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Plasminogen activator inhibitor-1 mRNA expression by the iris and lens epithelial cells of rabbit eye with intraocular lens implantation WU Qiang, YANG Guan, CHEN Guohui, et al. Department of Ophthalmology, Shanghai No.6 Hospital, Shanghai 200233
【Abstract】 Objective To investigate the change of plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) synthesized by the iris and the lens epithelial cells (LECs) after extracapsular cataract extraction (ECCE) with intraocular lens (IOL) implantation and the role of PAI-1 in the occurrence of fibrin reaction and the formation of posterior capsular opacification. Methods Eight adult rabbits were studied. In each rabbit, one eye underwent ECCE with IOL implantation and the other eye was normal without any surgical intervention. The iris tissue and the lens capsule of each two normal eyes and each two surgical eyes were excised on the postoperative 1, 7, 15 and 30 days respectively. The amount of PAI-1 mRNA expresson in the specimens was detected by using reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). The data were analyzed statistically. Results The amount of PAI-1 mRNA expresson in the iris tissue and the LECs of the surgical eyes displayed a significant increase on the first day after operation. The high expression of PAI-1 mRNA by the iris might last 15 days (P<0.001), but it declined to the normal range on the postoperative 30 days (P=0.87). The high level of PAI-1 mRNA expresson by the LECs in the surgical eyes had significant difference when compared with that of the normal eyes at 1, 7, 15 and 30 days postoperatively (P<0.001). Conclusion It is indicated that PAI-1 enzyme is a major cause for fibrin reaction after ECCE with IOL implantation, and may play critical roles in the development of posterior capsular opacification.
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【Key words】 Iris Lens Epithelial cells Plasminogen activator inhibitor-1
纤溶酶原激活物抑制物-1(plasminogen activator inhibitor-1, PAI-1)是一种广泛存在于机体内的蛋白酶，它起到特异的抑制纤溶酶原激活物(plasminogen activators,PAs)对纤溶酶原的激活。多项研究资料表明，PAI-1不但对血循环中的纤维蛋白降解起到抑制作用，而且还可对细胞外基质蛋白的降解起到保护性作用[1]。另外的研究还发现，PAI-1也是一种急性相反应的成分，在术后、外伤、心肌梗塞发生时，血循环中的PAI-1水平明显升高[2]。白内障囊外摘除联合人工晶体植入术后，术眼常不可避免地发生纤维蛋白反应。这种纤维蛋白反应的发生是否是由存在在眼房水内的PAI-1水平发生改变而导致的结果，我们应用逆反转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerse chain reaction，RT-PCR)分子生物学技术，对合成PAI-1的虹膜组织、晶体上皮细胞进行研究，从PAI-1基因的转录水平揭示术后眼房水内PAI-1量的动态变化，以阐述PAI-1对眼内纤维蛋白反应所起到的重要调节作用。
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材料和方法
一、主要试剂和仪器
1.试剂：鼠白血病病毒反转录酶(moloney murine leukemia virus reverse transcriptase,M-MLVRT)(美国Gibco Brl公司产品)，dNTP、随机引物、Tag酶、RNsin(美国Promega公司产品)。
2.仪器:PCR仪(PERKIN ELMER48，美国产)，计算机图像分析仪(Image Analysis System,德国产)，超速低温离心机(HERMLE ZK380，德国产)，紫外分光光度仪(Ultrospec 300，瑞典产)。
二、方法
1.实验对象及标本的制备:选用本院动物房提供的新西兰白兔8只，体重2.5～3.0kg。1只眼未进行手术作为正常对照眼,另1只眼植入人工晶体(美国Ocularvision公司产品)。方法如下：术前用1%阿托品散瞳；兔耳缘静脉注射1%戊巴比妥钠35mg/kg麻醉。用尖刀片于上方角巩缘处做10～2点钟方位的角膜缘切口,用截囊针在前囊上方做“-”字形截囊[3]，娩核，使用双管套针注吸皮质，在粘弹性物质的支撑下植入人工晶体。缝合角巩膜切口，结膜下注射庆大霉素4万U，术后每天给予复方磺胺醋酰钠眼药水、土霉素眼膏点眼治疗。每2只兔为一组，分别于术后1、3、7、15、30天时处死动物，显微镜操作下切取兔眼的虹膜和晶体囊膜组织，置入冻存管，液氮内保存以备组织RNA提取用。
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2.组织标本的RNA提取：将所截取的未手术兔眼和人工晶体植入术后不同时期的兔眼虹膜和晶体囊膜，用匀浆器制成组织匀浆,然后依次加入RNA快速提取试剂和氯仿-异丙醇后，经高速离心进行标本的RNA提取;所提取的16份标本RNA，经紫外分光光度仪测定，其吸光度(A)260nm/(A)280nm比值为1.7～1.98。
3.组织标本mRNA的逆反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)：参照Wagner等[4]介绍的方法,并作适当修改。
引物序列：
PAI-1(约360bp)
5′ATG-GAA-TTC-CCG-TGG-AAC-AAG-AAT-GAG-ATC-AG 3′
3′GAG-ACA-CGG-GTA-CTA-CCG-AGT 5′
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β-actin(828bp)
5′ATC-TGG-CAC-CAC-CTT-CTA-CAA-TGA-GCT-GC 3′
3′CGT-CTA-CAC-CTA-GTC-GTT-CGT-CCT-CAT-ACT-GC 5′
在20μl反应体系中加有随机引物0.2μl、RNsin1μl、待测组织细胞RNA2μg、5倍缓冲液4μl、10mmol/LdNTP1μl、M-MLVRT200IU，最后用Depc处理水补充总量，37℃下放置60min，然后升高温度至90℃下5min，再迅速下降温度;将反转录产物10μl加入包含有10倍缓冲剂液5μl、25mmol/LMgCl24μl、10mmol/LdNTP2μl、上、下引物各3μl、Tag酶0.4μl的反应体系中，用Depc处理水补充总量达50μl，石蜡油封住反应体系液面，分别按如下反应条件在PCR仪上进行cDNA的扩增。PAI-1：94℃下3min，然后94℃下15s、54℃下30s、72℃下30s，28个循环，最后在72℃下再放置10min。β-actin：94℃下3min、60℃下1min、72℃下2min1个循环后，接94℃下45s、60℃下1min、72℃下45s，循环30次，最后在72℃下再放置10min。
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4.cDNA电泳：将聚合酶链反应(PCR)产物和载样缓冲液加入1%琼脂糖凝胶加样槽中电泳，电压5V/cm，电泳时间1h，然后用0.5μg/ml溴乙锭染色25min，摄片，计算机图像分析仪进行吸光度(A)扫描测定。
5.统计学处理方法：所测到各条带吸光度(A)值采用SAS-6.04计算机软件包进行统计分析处理。所有未手术眼和手术眼均进行F检验，术后不同时期的术眼和未手术对侧眼之间用Duncan检验进行两两比较。
结果
所有手术眼和未手术眼的虹膜组织细胞和晶体上皮细胞均显示出2条清楚的条带,其长度经PCR标记(mark)确定PAI-1mRNA为360bp、β-actin为828bp。
一、兔眼人工晶体植入术前、后虹膜组织PAI-1mRNA的表达
, http://www.100md.com 术后第1天，虹膜组织细胞内PAI-1mRNA表达即出现明显的升高，这种增高的表达水平可持续到术后15天(P<0.001);而在术后30天时，虹膜组织细胞PAI-1mRNA的表达量即恢复到正常水平,统计学上差异无显著性(P=0.87)(表1，图1)。
表1 兔眼术前、后虹膜组织PAI-1mRNA表达的吸光度(A)值的方差分析 术后时间
(天)
眼数
PAI-1mRNA吸光度(A)值(
±s)F值
P值
, http://www.100md.com
未手术眼
手术眼
1
2
0.66±0.03
1.99±0.09
91.28
0.0007
7
2
0.67±0.02
1.85±0.09
79.26
, 百拇医药
0.0009
15
2
0.60±0.01
1.96±0.06
262.80
0.0001
30
2
0.62±0.02
0.64±0.07
0.03
0.8700
, 百拇医药
1分子量mark 2阴性对照 3阳性对照(兔肝细胞) 4正常对照
5术后第1天 6术后第7天 7术后第15天 8术后30天
图1 兔眼术前、后虹膜组织PAI-1mRNA的表达
二、兔眼人工晶体植入术前、后晶体上皮细胞PAI-1mRNA的表达
术后第1天，晶体上皮细胞内PAI-1mRNA也同样出现明显的升高(P<0.001)，并且在术后7、15和30天时术眼PAI-1mRNA表达的吸光度(A)值经表达的β-actin吸光度(A)值校正后，与校正后的对侧未手术眼的PAI-1mRNA表达吸光度(A)值比较，统计学上差异有非常显著性(P<0.001)(表2,图2)。
表2 兔眼术前、后晶体上皮细胞PAI-1mRNA表达的吸光度(A)值的方差分析 术后时间
, 百拇医药
(天)
眼数
PAI-1mRNA吸光度(A)值(
±s)F值
P值
未手术眼
手术眼
1
2
0.58±0.02
, 百拇医药 2.02±0.05
371.16
0.0001
7
2
0.68±0.09
1.75±0.05
135.33
0.0003
15
2
0.69±0.03
1.82±0.05
, 百拇医药
205.26
0.0001
30
2
0.58±0.04
1.40±0.09
36.55
0.0038
1分子量mark 2阴性对照 3阳性对照(兔肝细胞) 4正常对照
, http://www.100md.com 5术后第1天 6术后第7天7术后第15天 8术后30天
图2 兔眼术前、后晶体上皮细胞PAI-1mRNA的表达
讨论
房水是一包含有多种生物活性物质的液体。近年我们的研究已发现，在正常眼房水内有PAI-1蛋白酶的存在，其活性及含量明显低于血浆中所含有的PAI-1；生理状态下存在于房水内的PAI-1蛋白酶其主要来源于虹膜组织的合成，但在白内障囊外摘除联合人工晶体植入术后,囊膜的完整性受到破坏,晶体上皮细胞直接与房水接触,由晶体上皮细胞合成的PAI-1可释放进入房水而构成房水中PAI-1的一个重要来源。
PAI-1属于丝氨酸蛋白酶类，是纤溶酶原激活物(PAs)的生理抑制剂；而PAs在体内是起到特异的激活纤溶酶的作用。激活的纤溶酶可促使纤维蛋白水解，形成可溶性肽段，同时，具有活性的纤溶酶还具有直接降解层粘连蛋白、纤粘连蛋白，或通过激活胶原酶而降解胶原蛋白等细胞外基质蛋白的作用[5]。PAI-1通过抑制PAs，降低了PAs对纤溶酶的激活作用，避免了细胞外基质蛋白的过度降解，对细胞外基质蛋白起到保护性机制的作用；PAI-1水平的升高将形成一个抑制蛋白质降解为主的蛋白质降解-蛋白质降解抑制的动态平衡。
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白内障囊外摘除联合人工晶体植入术后，血-房水屏障的破坏，纤维蛋白原、炎性细胞以及一些活性介质渗出进入房水中，在凝血酶的作用下可溶性纤维蛋白原被转变成不溶性的纤维蛋白。在正常情况下，这些不溶性纤维蛋白可由房水中纤溶系统的纤溶酶降解清除。在白内障囊外摘除联合人工晶体植入术后，纤溶酶活性的相对低下，房水内常有纤维蛋白的沉积，严重者形成纤维凝块或纤维膜。这种房水内纤溶系统功能的相对低下是否是由存在于房水内PAI-1水平发生改变的结果，我们对植入人工晶体的兔眼进行研究，发现虹膜组织以及残留在囊膜上裸露于房水中可表现出活跃的生物学功能的晶体上皮细胞，在术后第1天其PAI-1的mRNA表达水平远远高于生理状态下的表达水平；这种高水平的PAI-1mRNA表达在虹膜组织可持续到术后15天,但在术后30天时又降至正常;而在晶体上皮细胞内PAI-1mRNA的表达量自术后第1天开始到术后30天时一直持续较高的水平，在30天后其表达量虽有所下降，但是仍高于正常水平。这与临床观察的白内障囊外摘除联合人工晶体植入术后纤维蛋白反应持续的时间基本一致[6]，说明房水内PAI-1水平的增高是导致白内障囊外摘除联合人工晶体植入术后纤维蛋白反应、纤维膜形成的重要原因。
, 百拇医药
这种白内障囊外摘除联合人工晶体植入术后眼房水内PAI-1水平的增高，在临床上具有很重要的病理作用。首先，它使房水内降解纤维蛋白的能力下降，纤维蛋白出现沉积，纤维凝块和纤维膜形成。有研究报道，纤维蛋白具有影响细胞的迁移、生长、分化的重要作用[7]。Vidauri-Leal等[8]观察发现，纤维蛋白还可刺激视网膜色素上皮细胞向成纤维细胞的转变，后者具有迁徙性和收缩性。在组织的损伤修复过程中，一旦细胞发生纤维样化生后即表现出细胞生长迅速，胶原合成、沉积、细胞外基质重建等一系列生物学特性[8]。白内障囊外摘除联合人工晶体植入术后，房水内纤溶系统的功能相对低下，纤维蛋白极易形成，在晶体后囊膜上发生沉积，趋使晶体上皮细胞向后囊膜迁移，而且它还可作为晶体上皮细胞生长的初期细胞外基质成分，诱使晶体上皮细胞表现出一系列的成纤维细胞所具有的生物学特性。其次，房水内的高PAI-1水平降低了房水内的蛋白质降解系统的功能，因而起到避免由转化后的晶体上皮细胞所合成的细胞外基质蛋白的过多降解作用。因此，房水内PAI-1水平的增高所引起纤维蛋白的沉积，促进了晶体上皮细胞的迁移、生长，并发生纤维样化生，高水平的PAI-1又降低了房水内蛋白质降解系统对纤维样化生的晶体上皮细胞合成的细胞外基质蛋白的清除作用，最终导致转化的晶体上皮细胞在后囊膜上的生长、增殖，大量的细胞外基质蛋白在后囊膜上沉积，晶体后囊膜发生混浊，使光线透过受阻，视力受损。
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然而，这种引起术后眼虹膜组织和晶体上皮细胞表达PAI-1增高的原因目前尚不完全清楚。作为对机体的生长发育和损伤反应起到多种调节功能的细胞因子，可能在血-房水屏障破坏后，自血浆渗出到房水中，和/或由眼前段组织细胞分泌而来，以内分泌、自分泌和旁分泌方式刺激眼虹膜组织和晶体上皮细胞表达PAI-1，从而使房水中的PAI-1水平增高。目前有关对影响眼虹膜组织和晶体上皮细胞合成PAI-1的因素及调节机制的认识，尚需更进一步的研究。
卫生部第二届全国中青年眼科会议优秀论文一等奖
参考文献
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, 百拇医药
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8 Vidauri-Leal JS, Glaser BM. Effect of fibrin on morphologic characteristics of retinal pigment epithelial cells. Arch Ophthalmol, 1984，102:1376-1379.
(收稿：1998-08-19 修回1999-01-26 ), http://www.100md.com