造血细胞工程及其在恶性肿瘤治疗中的应用前景*
作者：裴雪涛
单位：军事医学科学院放射医学研究所，国家生物医学分析中心(北京100850)
关键词：
肿瘤990323 癌症是主要的致死性疾病之一，且死亡率仍高居不下。目前的治疗手段还不能治愈所有的癌症患者，而且某些类型的肿瘤即使是早期诊断也难以获得满意的疗效，至于转移性、全身性或进展期的肿瘤则更难以治愈。目前的肿瘤治疗策略中，手术和放疗等局部治疗对局限性肿瘤有较好的疗效，而对于全身性、转移性或局部治疗后的微小残留病灶则主要依靠化疗或免疫疗法进行系统性治疗。
化疗仍然是目前应用最广的肿瘤治疗方法，无论是单独使用或是与手术、放疗和免疫治疗联合，化疗在延长生存期和提高疗效方面均起着重要的作用。尤其是近40年来，各种新型抗肿瘤药物的不断发现和不同作用机制、靶位点的药物联合应用，已明显改善了癌症患者的治愈率、生存期和生活质量。但几乎所有的抗肿瘤药物都有剂量限制性毒副反应，尤其是严重的骨髓抑制和心脏毒性已经成为主要的剂量限制性毒性，并使得患者难以接受足量的化疗药物。合理的药物组合、足够的药物剂量和按计划进行的疗程，可显著提高肿瘤治疗的效果。而较缓和的化疗方案易导致肿瘤细胞耐药性的产生，化疗方案的延迟则会诱发肿瘤细胞重新增殖而导致复发。
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目前的化疗毒副反应，中性粒细胞减少和血小板减少是最主要的化疗限制性毒副反应，造血生长因子(如G-CSF、GM-CSF、Epo、Tpo等)的应用对化疗后的造血恢复起到积极的作用；而造血干细胞移植支持下的大剂量化疗则进一步提高恶性肿瘤的治疗效果和生存期，尤其是转移性、全身性、难治性或进展期的肿瘤。然而，干细胞移植需采集到足够量的干细胞，骨髓采集和外周血动员、采集、分离等步骤较为复杂，对于多次接受化疗的患者也难以进行有效的动员和采集；单份脐带血所含CD34+细胞的数量比用于成人骨髓移植的数量少10～15倍；此外，干细胞移植后成熟血细胞的再生成也还需1～3周。因此，人们依然期盼更加有效、安全、经济的造血细胞疗法。
近年来，造血细胞分选技术、造血生长因子的发现与克隆、各种ex vivo操作技术的建立与完善，使得造血细胞在数量、性能和功能方面的改造更易于操作与应用，从而产生一个新兴的研究与应用领域，即造血细胞工程。造血细胞工程是利用造血干/祖细胞的高度增殖能力和多向分化潜能，通过细胞工程的技术，在体外模拟或部分模拟体内的造血过程(包括基质细胞的支持和造血生长因子的调控等)，对分离纯化的造血干/祖细胞进行体外扩增、定向诱导分化、功能激活与调控、目的基因转染等，从而在短时间内大量扩增早期造血祖细胞及各阶段的造血前体细胞，以及定向诱导扩增大量的红细胞、粒/巨噬细胞、巨核细胞/血小板、树突状细胞(Dendritic Cells,DC)、NK细胞、T/B淋巴细胞等功能血细胞和免疫活性细胞，并可对部分细胞的功能进行激活和调控，对缺陷性基因进行靶向性转染，最终将造血细胞治疗更广泛和有效地应用于干细胞移植、生物免疫治疗、造血支持治疗和基因治疗待领域。
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一、大剂量放化疗后的造血支持治疗
自80年代起，造血干细胞移植已成为恶性肿瘤大剂量放疗后造血支持治疗的主要措施，同时也是造血系统疾病、自身免疫性疾病和部分遗传性疾病的重要治疗手段。近年来的研究和临床试验表明：化疗+细胞因子(G-CSF、GM-CSF等)可使更多的干细胞进入外周血，从而可以采集到足够的造血干/祖细胞用于移植，并使其移植后的粒细胞和血小板恢复速度明显快于骨髓移植。因此，外周血干细胞移植已成为造血干细胞移植的主要干细胞来源[1]。目前的研究则更多地关注于VLA-4、LFA-1、c-kit、CD18等细胞粘附分子(CAM)所参与的干细胞动员机制，以及G-CSF、GM-CSF、SCF、FL、Tpo、IL-8等细胞因子及其组合的动员效率和动员细胞的表型、性能、长期造血重建能力等，此方面的研究将会使外周血干细胞移植的应用更加广泛、高效和快捷。
脐带血含有丰富的造血干/祖细胞，其免疫细胞的抗原性较弱，CTL祖细胞较少，移植相关GvHD的发生相对骨髓和外周血少而轻，采集保存容易，对供者无任何伤害，因此被认为是极具潜力的新的造血干细胞来源。1989年首例脐带血移植治疗Fanconi贫血获得成功后，更是引起全球的关注，对脐带血造血干/祖细胞的生物学性能、免疫学特征、移植潜能等方面的研究已成为热点，且在许多国家均建立了规模不等的脐带血库。纽约血液中心自1992年开始启动其胎盘/脐带血计划，至今所保存的胎盘/脐带血已超过8000份，并为700余例患者提供了脐带血干细胞用于移植，对其移植后随访超过100天的562例患者进行了分析，表明脐带血移植可以顺利重建患者的长期造血，移植患者中54%有2～3个位点不相合，但其发生的急性GvHD较易控制，仅少数患者出现慢性GvHD[2]因此，大规模的脐带血库将成为新的、有效的干细胞来源。
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二、造血干/祖细胞分离纯化与移植物阳性净化
纯化造血干/祖细胞是造血细胞工程的限制性因素，但各种血细胞群体的复杂性、不均一性以及造血干/祖细胞的稀少使得其分离纯化难以实现。进入90年代后，随着分子生物学、免疫学、细胞生物学、激光工业、纳米材料和电子计算机等学科和技术的高速发展，使纯化造血干/祖细胞成为现实，也为造血干/祖细胞的体外扩增、定向诱导分化、基因治疗、生物免疫治疗、建库、移植等奠定了基础。利用CD34、CD38、c-kit、CDw90等细胞表面标志，通过不断发展和完善的免疫磁珠、生物素-抗生素亲和吸附、流式细胞术、单抗铺展贴壁等细胞分选技术，从而使CD34+及其亚群细胞(如CD34+CD38-、CD34+Thy-1+Lin-、CD34+HLA-DR-CD33-等)的分离纯化得以广泛开展。且更深入的研究还发展了新的造血干/祖细胞分选标志(如AC133)以及发现了可能是更早期的、能够重建长期造血和免疫功能的CD34-Lin-造血干细胞[3]。
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自体造血细胞移植时，移植物中的肿瘤细胞污染是导致移植后复发的主要克隆来源；而异基因移植时的供者T淋巴细胞又是GvHD发生的主要原因。因此，移植物中肿瘤细胞或T淋巴细胞的净化就成为造血干细胞移植中的重点研究领域之一。由于绝大部分实体瘤细胞不表达CD34抗原，因此纯化CD34+细胞的阳性净化已成为近年来被人们认同和广泛应用的肿瘤净化策略。依据上述CD34+细胞分选的原理，CellPro亲和吸附分选系统和CliniMACS磁性分选系统均已进入临床应用，并证明可净化移植物中污染的肿瘤和异基因移植时的T淋巴细胞，其净化效率可达4～6个对数级，从而降低移植后的复发率，控制移植相关的严重GvHD和移植物对肿瘤细胞的免疫反应，因此被广泛应用于恶性肿瘤和自身免疫性疾病治疗时的异基因和自体干细胞移植；同时，纯化的CD34+细胞还使应用相关供者的超剂量干细胞进行半相合移植成为可能。
三、造血干/祖细胞体外扩增与定向诱导分化
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利用造血干/祖细胞的高度增殖能力和多向分化潜能，以及各种造血生长因子和造血基质细胞的调控作用，可使来自骨髓、动员外周血和脐带血的造血细胞在SCF、IL-3、GM-CSF、EPO等细胞因子的不同组合刺激下得以大量扩增，但其对早期祖细胞的扩增作用不明显，且加速细胞的分化，从而导致重建长期造血能力的耗竭。因此，如何在扩增造血细胞的同时，又保留造血干细胞及扩增早期造血祖细胞，保证长期造血重建，这已成为造血细胞工程研究的重点和难点。近来的研究在此方面有了较大的进展：①Flt3/Flk2配基(FL)、TPO等细胞因子被证明具有协同刺激早期造血祖细胞的作用，作者的研究结果表明，FL、TPO加上部分传统的细胞因子组合，可以大大提高造血细胞的扩增效率，短时间内可使造血细胞总数增加数千倍，且可使早期造血祖细胞扩增近50倍，这远远高于传统细胞因子组合的扩增效果；②利用CD34+CD38-细胞亚群进行扩增也可以明显增加早期造血祖细胞的扩增而减缓其分化成熟，且其扩增细胞的再植能力也明显高于CD34+CD38+亚群扩增的细胞；③基质细胞的支持也是扩增早期造血祖细胞的重要手段，有基质细胞存在的情况下，CD34+CD38-细胞经FL、CSF、IL-3等细胞因子的刺激，LTC-IC可被扩增数十倍，而没有基质的扩增体系则难以维持LTC-IC的增殖[4]；④新一代的“生物反应器”可持续灌注低浓度的细胞因子和不断更换培养基，从而减轻细胞分化压力，清除细胞代谢产物，减少污染机会，增加扩增效率；⑤TGF-β、MIP-1α、LIF等负调控因子可阻止细胞分化，在适当的时机加入扩增体系，使扩增细胞的分化速率减慢，从而保留更多的早期造血细胞数量和功能。
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扩增造血祖细胞的同时，也明显地加速了其分化，这是造血祖细胞扩增所面临的一个难题，同时又为我们展开了一个新的研究领域，即利用造血干/祖细胞具有多向分化的潜能，通过FL、SCF、GM-CSF、EPO、TPO、IL-2、IL-4、IL-7等细胞因子的不同组合，以及骨髓、胸腺、淋巴结等造血微环境的作用，定向地诱导其分化，产生大量所需的功能细胞(如红细胞、粒细胞、血小板、树突状细胞、NK细胞、淋巴细胞等)，满足基础研究及临床应用的需要，在新一代的细胞免疫治疗中将具有十分重要的意义[5]。
四、树突状细胞介导的肿瘤免疫治疗
除造血细胞相关的造血支持治疗外，LAK、CIK、CTL、TIL以及DC等细胞介导的免疫治疗也逐渐成为恶性肿瘤等疾病的重要治疗策略。其中DC是体内最有效的抗原递呈细胞(APC)，通过其表面的B7、MHC-Ⅱ、CD1、ICAM-1等信号分子和共刺激分子，并分泌大量IL-12等细胞因子，激活T辅助细胞，并传递特异性抗原信号，最终激活细胞毒T细胞(CTL)。因此，在肿瘤免疫及其治疗中具有重要意义。利用GM-CSF、IL-4、TNF-α、FL-SCF、Rank、Trance等细胞因子的不同组合，可以从CD34+造血祖细胞和外周血单核细胞诱导扩增出大量的DC，进一步则通过肿瘤特异性多肽、酸提抗原或肿瘤差异mRNA刺激、肿瘤抗原编码基因导入、细胞因子修饰、DC与肿瘤细胞融合、DC吞噬细胞凋亡小体等策略使DC装载特异性抗原[6]，诱导抗原特异性CTL杀伤肿瘤细胞，因此已成为当今肿瘤生物治疗领域倍受关注的焦点。目前，DC回输疗法已成功地试用于非霍奇金淋巴瘤、黑素瘤、前列腺癌和多发性骨髓瘤等恶性肿瘤晚期患者的治疗[7]。此外，DC的来源与大量扩增、免疫学特性、作用机制等研究也成为热点，DC在感染、移植排斥、AIDS和自身免疫性疾病中的作用也引起人们的关注。进一步的深入研究，将会使DC介导的特异性免疫治疗在肿瘤、感染、移植免疫、自身免疫等疾病中得到更安全、有效的应用。
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五、造血细胞作为靶细胞的基因治疗
由于造血干细胞具有自我更新、多向分化、重建长期造血、采集和体外处理容易等特点，因此是基因治疗最理想的靶细胞之一，以此为基础的基因治疗在重症免疫缺陷、遗传性疾病、恶性肿瘤、造血干细胞保护、AIDS等领域具有广阔的应用前景[8]。在美国NIH公布的基因治疗方案中，以造血细胞作为靶细胞的基础治疗方案已达30余个，这些治疗方案正从实验室阶段逐渐向临床过度。①外源基因标记在自体造血干细胞移植后复发原因和净化效果的分析中也已成为主要的证据，这在干细胞移植后的造血重建、细胞归巢(Homing)、肿瘤复发的克隆起源、各种净化肿瘤细胞方法的评价等方面具有重要价值；②mdr-1、dhfr、mgmt等耐药基因的转染则可使造血干/祖细胞能够耐受更高的化疗药物剂量，从而可以进一步提高化疗剂量和增加不同作用机制的药物组合，使肿瘤化疗效果更加满意，同时又保护造血细胞免遭伤害；③FL、GM-CSF、TPO等细胞因子转染造血基质细胞促进造血功能恢复；④此外，通过HSV-TK自杀基因的转染和GCV的选择性杀伤作用，调控T淋巴细胞的数量，也将为异基因造血干细胞移植时控制GvHD保留GvL的治疗方案奠定基础。目前人们普遍关注的造血干/祖细胞及其亚群的分离纯化、造血细胞基因转染效率的提高、基因转移载体(脂质体、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒等)的不断改进、转基因细胞的扩增和定向诱导分化、新的目的基因的发现、目的基因转染后的稳定表达和调控等领域的深入研究将使造血细胞相关的基因治疗更加有效和广泛地应用于临床。
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*国家杰出青年科学基金(39825111)资助
作者简介 斐雪涛，男，研究员，博士生导师。
参 考 文 献
1 To LB,Haylock DN,Simmons PJ, et al. The biology and clinical uses of blood stem cells.Blood ,1997,89:2233
2 Rubinstein P,Carrier C,Scaradavou A, et al. Outcomes among 562 recipients of placental blood transplants from unrelated donors.New Egl J Med,1998,339:1565
3 Osawa M,Hanada K,Hamada H, et al.Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell.Science,1996,273:242
, 百拇医药
4 Herman P,Ferrant A,de Bruyere M, et al.Stromal factors support the expansion of the whole hemopoietic spectrum from bone marrow CD34+DR- cells and of some hemopoietic subsets from CD34+ and CD34+DR+ cells.Leukemia,1998,12:735
5 裴雪涛，王立生，徐 黎，等.CD34+造血祖细胞的定向诱导分化研究.中华血液学杂志，1998，19：289
6 Albert ML,Sauter B,Bhardwaj N.Dendritic cells acquire antigen from apoptotic cells and induce class I-restricted CTLs.Nature,1998,392:86
, 百拇医药
7 Salgaller ML,Tjoa BA,Lodeg PA, et al. Dendritic cell-based immunotherapy of prostate cancer.Crit Rev Immunol,1998,18:109
8 Davis B,Saitta FP,Bauer G,et al. Targeted transduction of CD34+ cells by transdominant negative Rev-expressing retrovirus yields partial anti-HIV protection of progeny macrophages.Hum Gene Ther,1998,9:1197
(收稿：1999-03-24), 百拇医药
单位：军事医学科学院放射医学研究所，国家生物医学分析中心(北京100850)
关键词：
肿瘤990323 癌症是主要的致死性疾病之一，且死亡率仍高居不下。目前的治疗手段还不能治愈所有的癌症患者，而且某些类型的肿瘤即使是早期诊断也难以获得满意的疗效，至于转移性、全身性或进展期的肿瘤则更难以治愈。目前的肿瘤治疗策略中，手术和放疗等局部治疗对局限性肿瘤有较好的疗效，而对于全身性、转移性或局部治疗后的微小残留病灶则主要依靠化疗或免疫疗法进行系统性治疗。
化疗仍然是目前应用最广的肿瘤治疗方法，无论是单独使用或是与手术、放疗和免疫治疗联合，化疗在延长生存期和提高疗效方面均起着重要的作用。尤其是近40年来，各种新型抗肿瘤药物的不断发现和不同作用机制、靶位点的药物联合应用，已明显改善了癌症患者的治愈率、生存期和生活质量。但几乎所有的抗肿瘤药物都有剂量限制性毒副反应，尤其是严重的骨髓抑制和心脏毒性已经成为主要的剂量限制性毒性，并使得患者难以接受足量的化疗药物。合理的药物组合、足够的药物剂量和按计划进行的疗程，可显著提高肿瘤治疗的效果。而较缓和的化疗方案易导致肿瘤细胞耐药性的产生，化疗方案的延迟则会诱发肿瘤细胞重新增殖而导致复发。
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目前的化疗毒副反应，中性粒细胞减少和血小板减少是最主要的化疗限制性毒副反应，造血生长因子(如G-CSF、GM-CSF、Epo、Tpo等)的应用对化疗后的造血恢复起到积极的作用；而造血干细胞移植支持下的大剂量化疗则进一步提高恶性肿瘤的治疗效果和生存期，尤其是转移性、全身性、难治性或进展期的肿瘤。然而，干细胞移植需采集到足够量的干细胞，骨髓采集和外周血动员、采集、分离等步骤较为复杂，对于多次接受化疗的患者也难以进行有效的动员和采集；单份脐带血所含CD34+细胞的数量比用于成人骨髓移植的数量少10～15倍；此外，干细胞移植后成熟血细胞的再生成也还需1～3周。因此，人们依然期盼更加有效、安全、经济的造血细胞疗法。
近年来，造血细胞分选技术、造血生长因子的发现与克隆、各种ex vivo操作技术的建立与完善，使得造血细胞在数量、性能和功能方面的改造更易于操作与应用，从而产生一个新兴的研究与应用领域，即造血细胞工程。造血细胞工程是利用造血干/祖细胞的高度增殖能力和多向分化潜能，通过细胞工程的技术，在体外模拟或部分模拟体内的造血过程(包括基质细胞的支持和造血生长因子的调控等)，对分离纯化的造血干/祖细胞进行体外扩增、定向诱导分化、功能激活与调控、目的基因转染等，从而在短时间内大量扩增早期造血祖细胞及各阶段的造血前体细胞，以及定向诱导扩增大量的红细胞、粒/巨噬细胞、巨核细胞/血小板、树突状细胞(Dendritic Cells,DC)、NK细胞、T/B淋巴细胞等功能血细胞和免疫活性细胞，并可对部分细胞的功能进行激活和调控，对缺陷性基因进行靶向性转染，最终将造血细胞治疗更广泛和有效地应用于干细胞移植、生物免疫治疗、造血支持治疗和基因治疗待领域。
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一、大剂量放化疗后的造血支持治疗
自80年代起，造血干细胞移植已成为恶性肿瘤大剂量放疗后造血支持治疗的主要措施，同时也是造血系统疾病、自身免疫性疾病和部分遗传性疾病的重要治疗手段。近年来的研究和临床试验表明：化疗+细胞因子(G-CSF、GM-CSF等)可使更多的干细胞进入外周血，从而可以采集到足够的造血干/祖细胞用于移植，并使其移植后的粒细胞和血小板恢复速度明显快于骨髓移植。因此，外周血干细胞移植已成为造血干细胞移植的主要干细胞来源[1]。目前的研究则更多地关注于VLA-4、LFA-1、c-kit、CD18等细胞粘附分子(CAM)所参与的干细胞动员机制，以及G-CSF、GM-CSF、SCF、FL、Tpo、IL-8等细胞因子及其组合的动员效率和动员细胞的表型、性能、长期造血重建能力等，此方面的研究将会使外周血干细胞移植的应用更加广泛、高效和快捷。
脐带血含有丰富的造血干/祖细胞，其免疫细胞的抗原性较弱，CTL祖细胞较少，移植相关GvHD的发生相对骨髓和外周血少而轻，采集保存容易，对供者无任何伤害，因此被认为是极具潜力的新的造血干细胞来源。1989年首例脐带血移植治疗Fanconi贫血获得成功后，更是引起全球的关注，对脐带血造血干/祖细胞的生物学性能、免疫学特征、移植潜能等方面的研究已成为热点，且在许多国家均建立了规模不等的脐带血库。纽约血液中心自1992年开始启动其胎盘/脐带血计划，至今所保存的胎盘/脐带血已超过8000份，并为700余例患者提供了脐带血干细胞用于移植，对其移植后随访超过100天的562例患者进行了分析，表明脐带血移植可以顺利重建患者的长期造血，移植患者中54%有2～3个位点不相合，但其发生的急性GvHD较易控制，仅少数患者出现慢性GvHD[2]因此，大规模的脐带血库将成为新的、有效的干细胞来源。
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二、造血干/祖细胞分离纯化与移植物阳性净化
纯化造血干/祖细胞是造血细胞工程的限制性因素，但各种血细胞群体的复杂性、不均一性以及造血干/祖细胞的稀少使得其分离纯化难以实现。进入90年代后，随着分子生物学、免疫学、细胞生物学、激光工业、纳米材料和电子计算机等学科和技术的高速发展，使纯化造血干/祖细胞成为现实，也为造血干/祖细胞的体外扩增、定向诱导分化、基因治疗、生物免疫治疗、建库、移植等奠定了基础。利用CD34、CD38、c-kit、CDw90等细胞表面标志，通过不断发展和完善的免疫磁珠、生物素-抗生素亲和吸附、流式细胞术、单抗铺展贴壁等细胞分选技术，从而使CD34+及其亚群细胞(如CD34+CD38-、CD34+Thy-1+Lin-、CD34+HLA-DR-CD33-等)的分离纯化得以广泛开展。且更深入的研究还发展了新的造血干/祖细胞分选标志(如AC133)以及发现了可能是更早期的、能够重建长期造血和免疫功能的CD34-Lin-造血干细胞[3]。
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自体造血细胞移植时，移植物中的肿瘤细胞污染是导致移植后复发的主要克隆来源；而异基因移植时的供者T淋巴细胞又是GvHD发生的主要原因。因此，移植物中肿瘤细胞或T淋巴细胞的净化就成为造血干细胞移植中的重点研究领域之一。由于绝大部分实体瘤细胞不表达CD34抗原，因此纯化CD34+细胞的阳性净化已成为近年来被人们认同和广泛应用的肿瘤净化策略。依据上述CD34+细胞分选的原理，CellPro亲和吸附分选系统和CliniMACS磁性分选系统均已进入临床应用，并证明可净化移植物中污染的肿瘤和异基因移植时的T淋巴细胞，其净化效率可达4～6个对数级，从而降低移植后的复发率，控制移植相关的严重GvHD和移植物对肿瘤细胞的免疫反应，因此被广泛应用于恶性肿瘤和自身免疫性疾病治疗时的异基因和自体干细胞移植；同时，纯化的CD34+细胞还使应用相关供者的超剂量干细胞进行半相合移植成为可能。
三、造血干/祖细胞体外扩增与定向诱导分化
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利用造血干/祖细胞的高度增殖能力和多向分化潜能，以及各种造血生长因子和造血基质细胞的调控作用，可使来自骨髓、动员外周血和脐带血的造血细胞在SCF、IL-3、GM-CSF、EPO等细胞因子的不同组合刺激下得以大量扩增，但其对早期祖细胞的扩增作用不明显，且加速细胞的分化，从而导致重建长期造血能力的耗竭。因此，如何在扩增造血细胞的同时，又保留造血干细胞及扩增早期造血祖细胞，保证长期造血重建，这已成为造血细胞工程研究的重点和难点。近来的研究在此方面有了较大的进展：①Flt3/Flk2配基(FL)、TPO等细胞因子被证明具有协同刺激早期造血祖细胞的作用，作者的研究结果表明，FL、TPO加上部分传统的细胞因子组合，可以大大提高造血细胞的扩增效率，短时间内可使造血细胞总数增加数千倍，且可使早期造血祖细胞扩增近50倍，这远远高于传统细胞因子组合的扩增效果；②利用CD34+CD38-细胞亚群进行扩增也可以明显增加早期造血祖细胞的扩增而减缓其分化成熟，且其扩增细胞的再植能力也明显高于CD34+CD38+亚群扩增的细胞；③基质细胞的支持也是扩增早期造血祖细胞的重要手段，有基质细胞存在的情况下，CD34+CD38-细胞经FL、CSF、IL-3等细胞因子的刺激，LTC-IC可被扩增数十倍，而没有基质的扩增体系则难以维持LTC-IC的增殖[4]；④新一代的“生物反应器”可持续灌注低浓度的细胞因子和不断更换培养基，从而减轻细胞分化压力，清除细胞代谢产物，减少污染机会，增加扩增效率；⑤TGF-β、MIP-1α、LIF等负调控因子可阻止细胞分化，在适当的时机加入扩增体系，使扩增细胞的分化速率减慢，从而保留更多的早期造血细胞数量和功能。
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扩增造血祖细胞的同时，也明显地加速了其分化，这是造血祖细胞扩增所面临的一个难题，同时又为我们展开了一个新的研究领域，即利用造血干/祖细胞具有多向分化的潜能，通过FL、SCF、GM-CSF、EPO、TPO、IL-2、IL-4、IL-7等细胞因子的不同组合，以及骨髓、胸腺、淋巴结等造血微环境的作用，定向地诱导其分化，产生大量所需的功能细胞(如红细胞、粒细胞、血小板、树突状细胞、NK细胞、淋巴细胞等)，满足基础研究及临床应用的需要，在新一代的细胞免疫治疗中将具有十分重要的意义[5]。
四、树突状细胞介导的肿瘤免疫治疗
除造血细胞相关的造血支持治疗外，LAK、CIK、CTL、TIL以及DC等细胞介导的免疫治疗也逐渐成为恶性肿瘤等疾病的重要治疗策略。其中DC是体内最有效的抗原递呈细胞(APC)，通过其表面的B7、MHC-Ⅱ、CD1、ICAM-1等信号分子和共刺激分子，并分泌大量IL-12等细胞因子，激活T辅助细胞，并传递特异性抗原信号，最终激活细胞毒T细胞(CTL)。因此，在肿瘤免疫及其治疗中具有重要意义。利用GM-CSF、IL-4、TNF-α、FL-SCF、Rank、Trance等细胞因子的不同组合，可以从CD34+造血祖细胞和外周血单核细胞诱导扩增出大量的DC，进一步则通过肿瘤特异性多肽、酸提抗原或肿瘤差异mRNA刺激、肿瘤抗原编码基因导入、细胞因子修饰、DC与肿瘤细胞融合、DC吞噬细胞凋亡小体等策略使DC装载特异性抗原[6]，诱导抗原特异性CTL杀伤肿瘤细胞，因此已成为当今肿瘤生物治疗领域倍受关注的焦点。目前，DC回输疗法已成功地试用于非霍奇金淋巴瘤、黑素瘤、前列腺癌和多发性骨髓瘤等恶性肿瘤晚期患者的治疗[7]。此外，DC的来源与大量扩增、免疫学特性、作用机制等研究也成为热点，DC在感染、移植排斥、AIDS和自身免疫性疾病中的作用也引起人们的关注。进一步的深入研究，将会使DC介导的特异性免疫治疗在肿瘤、感染、移植免疫、自身免疫等疾病中得到更安全、有效的应用。
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五、造血细胞作为靶细胞的基因治疗
由于造血干细胞具有自我更新、多向分化、重建长期造血、采集和体外处理容易等特点，因此是基因治疗最理想的靶细胞之一，以此为基础的基因治疗在重症免疫缺陷、遗传性疾病、恶性肿瘤、造血干细胞保护、AIDS等领域具有广阔的应用前景[8]。在美国NIH公布的基因治疗方案中，以造血细胞作为靶细胞的基础治疗方案已达30余个，这些治疗方案正从实验室阶段逐渐向临床过度。①外源基因标记在自体造血干细胞移植后复发原因和净化效果的分析中也已成为主要的证据，这在干细胞移植后的造血重建、细胞归巢(Homing)、肿瘤复发的克隆起源、各种净化肿瘤细胞方法的评价等方面具有重要价值；②mdr-1、dhfr、mgmt等耐药基因的转染则可使造血干/祖细胞能够耐受更高的化疗药物剂量，从而可以进一步提高化疗剂量和增加不同作用机制的药物组合，使肿瘤化疗效果更加满意，同时又保护造血细胞免遭伤害；③FL、GM-CSF、TPO等细胞因子转染造血基质细胞促进造血功能恢复；④此外，通过HSV-TK自杀基因的转染和GCV的选择性杀伤作用，调控T淋巴细胞的数量，也将为异基因造血干细胞移植时控制GvHD保留GvL的治疗方案奠定基础。目前人们普遍关注的造血干/祖细胞及其亚群的分离纯化、造血细胞基因转染效率的提高、基因转移载体(脂质体、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒等)的不断改进、转基因细胞的扩增和定向诱导分化、新的目的基因的发现、目的基因转染后的稳定表达和调控等领域的深入研究将使造血细胞相关的基因治疗更加有效和广泛地应用于临床。
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*国家杰出青年科学基金(39825111)资助
作者简介 斐雪涛，男，研究员，博士生导师。
参 考 文 献
1 To LB,Haylock DN,Simmons PJ, et al. The biology and clinical uses of blood stem cells.Blood ,1997,89:2233
2 Rubinstein P,Carrier C,Scaradavou A, et al. Outcomes among 562 recipients of placental blood transplants from unrelated donors.New Egl J Med,1998,339:1565
3 Osawa M,Hanada K,Hamada H, et al.Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell.Science,1996,273:242
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4 Herman P,Ferrant A,de Bruyere M, et al.Stromal factors support the expansion of the whole hemopoietic spectrum from bone marrow CD34+DR- cells and of some hemopoietic subsets from CD34+ and CD34+DR+ cells.Leukemia,1998,12:735
5 裴雪涛，王立生，徐 黎，等.CD34+造血祖细胞的定向诱导分化研究.中华血液学杂志，1998，19：289
6 Albert ML,Sauter B,Bhardwaj N.Dendritic cells acquire antigen from apoptotic cells and induce class I-restricted CTLs.Nature,1998,392:86
, 百拇医药
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(收稿：1999-03-24), 百拇医药