人干扰素-γ植物双元表达载体的构建
作者：张奉学 符林春 黄玲 郭兴伯 李国桥 康良仪 韩爱东 王寰宇
单位：张奉学 符林春 黄玲 郭兴伯 李国桥(广州中医药大学热带医学研究所，广州 510405)；康良仪 韩爱东 王寰宇(中国科学院微生物研究所，北京 100083)
关键词：干扰素Ⅲ型；植物，转基因；植物，药用
广州中医药大学学报990309摘要：为研究在药用植物中表达人干扰素(IFN)，构建了人IFN-γ植物双元表达载体。方法是将IFN-γ基因的pstI片段插入克隆载体PBluescript SK(+)中，通过蓝白斑筛选 以xbaI/kpnI证实，以ndeI/kpnI鉴定插入方向。得到中间载体PSKIFN，用xbaI/kpnI双酶切PSKIFN，回收1.3kb片段，将此片段插入植物表达载体PROKII上，经限制性酶切分析及自动测序，结果证实插入片段大小及序列正确，构建获得成功，为进一步在药用植物中表达IFN-γ奠定了基础。
, 百拇医药
中图分类号：Q786 文献标识码：A
Construction of Plant Binary Expression Vector of Human Interferon-γ
ZHANG Fengxue，FU Linchun，HUANG Ling，GUO Xingbo，LI Guoqiao
(Tropical Medicine Institute, Guangzhou University of TCM, Guangzhou 510405, China)；
KANG Liangyi，HAN Aidong，WANG Huanyu
(Institute of Microbiology, Chinese Academy of Science, Beijing 100083,China)
, 百拇医药
Abstract:Plant binary expression vector of human Interferon-γ(HIFN-γ) was constructed to study the expression of in medicinal plant. The method was as follow. The plasmid of PSWIF including interferon-γ gene was digested with pst Ⅰ and low melting point agarose was used to recover the fragment of HIFN-γ.Then the recovered fragment was cloned to the vector of PBluescript SK(+) to form an intermediate vector of PSKIFN.The PSKIFN was digested with kpn I /xba Ⅰ and then coned to plant expression vector of PROK Ⅱ to form the plant binary expression vector of PROKIFN. The PROKIFNwas identified with digestion of kpn Ⅰ / xba Ⅰ and automatic sequence system. The result of restriction analysis showed that the length of inserted fragment was about 1.3kb and that of automatic sequence showed the sequence of inserted fragment was correct.
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Key words:INTERFERON TYPE Ⅲ； PLANTS， TRANSGENIC； PLANTS, MEDICINAL
干扰素(Interferon, IFN)是由细胞产生的一类诱生性的小分子量、高活性、多功能和多用途的蛋白质。它是由多功能细胞因子组成的异源家族。IFN-γ为T淋巴细胞在有丝分裂刺激下产生，又称免疫干扰素。人IFN-γ结构基因位于第12号染色体，编码一个143个氨基酸的碱性蛋白质[1]。近年来大量制备IFN的方法已取得了不少进展。目前用人细胞制备的干扰素有白细胞、类淋巴细胞、成纤维细胞和免疫干扰素，除免疫的干扰素外，其他均已能自动化大量生产。但用人细胞制备的干扰素具有明显的缺点：生产成本高、价格昂贵且有传染多种疾病包括艾滋病的可能。随着分子生物学的飞速发展，目前基因工程生产的重组干扰素已获成功，基因工程载体包括大肠杆菌、酵母、昆虫、地鼠卵巢等细胞。同时，人们还把目光转向另一类载体—植物细胞。我国学者陈炬等[2]首先在烟草植株中表达人IFN-α，稍后，在烟草中表达人IFN-β也获得成功[3]。有鉴于此，我们构建了人IFN-γ植物双元表达载体，以便在药用植物中进行表达。
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1 材料
细菌、质粒：大肠杆菌DH5α，克隆载体PSK(+)及表达载体PROKII均由中科院微生物研究所提供。
酶：限制性内切酶pstI、kpnI、xbaI及kpnI,T4 DNA 连接酶购自Promeaga或华美生物工程公司。
培养基：酵母浸出粉和蛋白胨为oxoid产品。
试剂：低熔点琼脂糖、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)和5-溴-4-录-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)为Sigma产品，其他化学制剂均为进口或国产分析纯试剂。
2 方法
2.1 含IFN-γ基因的中间载体PSKIFN的构建
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2.1.1 IFN-γ基因片段的回收及PBluescript Ⅱ SK+(PSK+)载体的制备 将含IFN-γ基因的质粒转化大肠杆菌DH5α，碱变性法提取质粒DNA，在下列酶切体系中酶切：20μL质粒DNA，6μL10×酶切缓冲液，3μLPstI,31μL双蒸水，37℃水浴2h,微型琼脂糖胶证实酶切效果，采用低熔点琼脂糖回收片段。回收方法：紫外灯下切取目的片段，加2倍体积双蒸水，65℃10min溶解，加300μL饱和酚，摇匀，离心，吸取水相加300μL酚：氯仿，离心，吸取水相加2.5倍体积无水乙醇，1/10体积3mol/L醋酸钠，置液氮10min，取出待溶解后离心10min，乙醇漂洗，凉干即可用于连续反应。PSK+载体按同法制备。
2.1.2 连接反应 连接反应体系：4μLPSKIFN、1μLPSK+、4μL10×连接酶缓冲液、1μLT4DNA连接酶、10μL双蒸水，置16℃保温超过6h。
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2.1.3 连接产物转化大肠杆菌DH5α 按分子克隆方法操作[4]。
2.1.4 重组子的鉴定 在含100mg/L的LB平板上(已涂布40μLX-gal、5μLIPTG)，涂布50μL转化菌液，于37℃下培养16h，再置4℃使蓝色反应完全。挑取白色菌落接种于3mL LB(Luria-Bertani,含氨苄青霉素100mg/L)中，37℃200r/min,培养12h，碱变性法提取重组DNA，用于如下鉴定。
大小鉴定：采用pstI、kpnI、xbaI单酶切及kpnI/xbaI双酶切鉴定。
方向鉴定：根据已知IFN-γ序列及PSK+多克隆位点设计,采用kpnI和ndeI双酶切作方向鉴定。
序列鉴定：自动测序由北京赛百盛公司代测。
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2.2 含IFN-γ基因的植物表达载体的构建
2.2.1 从PSKIFN中回收含IFN-γ片段及PROKII载体制备 选择正向插入的克隆PSKIFN，采用 kpnI/xbaI双酶切，低熔点琼脂糖法回收片段。PROKII载体按同法制备。
2.2.2 IFN-γ与PROKII的连接与转化 连接体系为：1μLPSKIFN，4μLPROKII，1μLT4 DNA Ligase，4μL10×连接缓冲液，10μL双蒸水，16℃保温6h，转化DH5α，转化培养完毕取50μL菌液涂布含卡那霉素100mg/L的LB平板。挑取菌落接种3mLLB(含100mg/L卡那霉素)，培养6h以上，提取质粒用于鉴定。
2.2.3 限制性内切酶鉴定 采用kpnI、xbaI单酶切和kpnI/xbaI双酶切。
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2.2.4 序列鉴定 自动测序由北京赛百盛生物工程公司测定。
3 结果
3.1 片段大小鉴定 含IFN-γ片段的质粒PSWIF是人IFN-γ基因克隆进入PBR322pstI位点，插入片段为1218bp。将此片段用pstI单酶切切下，克隆到PSK+得到中间载体PSKIFN，将PSKIFN用kpnI和xbaI双酶切，克隆到植物表达载体PROKII上，得到植物双元表达载体PROKIFN，对这 3个质粒分别以PSKIFNkpnI、xbaI单酶以及kpnI和xbaI双酶切。对于PSKIFNpstI单酶切应得到1220bp和3000bp两个片段，kpnI和xbaI双酶切得到与其相似的片段，而kpnI单酶切则应得到4200bp的单一片段。结果与预期吻合(见图1的2道、3道、4道，图2的4道)。对于PROKIFNkpnI和xbaI双酶切预期应得到1250bp和9800bp两个片段，结果见图2的2道。
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图1 PSKIFN的酶切鉴定
1、5道：marker(λDNA EcoRI/HindIII)；2道：pstI酶切；
3道：kpnI酶切；4道：kpnI/xbaI酶切
图2 PSKIFN和PROKIFN的酶切分析
1、3、5道：marker;2道：PROKIFN的xbaI/kpnI酶切；
4道：PSKIFN的xbaI/kpnI酶切
3.2 插入方向鉴定 由于中间克隆PSKIFN是pstI单酶切位点插入，存在两端插入可能性，根据已知IFN-γ序列进行DNASIS分析，选择ndeI/kpnI作为方向鉴定用酶，对PSKIFN进行方向鉴定，预期正向插入片段将得到3.1kb和1.1kb两个片段，而反向插入则得到3.9kb和250bp两片段。结果证实得到正向插入片段。由于将PSKIFN、kpnI/xbaI克隆到PROKII上是采用定向克隆，所以不需要进行方向鉴定。
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3.3 序列鉴定 对中间克隆PSKIFN和植物双元表达载体PROKIFN分别采用T7和Sp6启动子序列进行自动测序，每个反应可读约700bp，从两端可读完整的插入序列，所得序列与已发表的序列对照，插入序列完全正确。其基因序列测序结果表明，编码IFN-γ的基因起始位点(AUG)位于第114bp，终止位点位于612bp，从起始位点开始的69bp为一个信号肽序列，编码一个23个氨基酸的信号肽，这一序列在分子释放前被切除。接着是一个编码一个143个氨基酸的碱性蛋白质序列[5](自动测序图谱存编辑部待查)。
4 讨论
利用Ti质粒载体系统将外源基因转化到植物染色体中是迄今为止最为有效的获得遗传性稳定基因工程植物的方法。为了利用农杆菌介导在植物中表达人IFN-γ，通过一步中间克隆，将1.2kb大小的IFN-γ基因克隆到植物表达载体PROKII上。PROKII是常用的植物双元表达载体之一[6]，具有CaMV35S启动子和NOS终止子，含有NPTII基因，可在植物中表达新霉素磷酸转移酶，使转化的植物细胞和组织能在含卡那霉素的培养基上生长，作为加压筛选因子；它还具有Ti质粒的T-DNA的左右边界序列，有利于外源基因在植物宿主染色体上的整合与表达。该载体的构建为进一步在植物中表达IFN-γ奠定了基础。
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作者简介：第一作者，男，助理研究员；
基金项目：国家自然科学基金(39770902)、国家中医药管理局(97Z082)、广东省科委科学基金(960542)资助
参考文献：
[1] Wessmann C, Weber H. The interferon genes[J].Prog Nucleic Acid Res Mol Biol,1986,33:251
[2] 陈炬，孙勇如，李向辉，等.人α-干扰素cDNA在转化的烟草植株中的表达[J].中国科学(B辑)，1990，3：253
[3] Edelbaum A, stein D, Holland N, et al. Expression of active human interferon-beta in transgenic plants[J].J Interferon Res, 1992, 12:449
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[4] Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Extraction and Purification of Plasmid DNA[J]. see:Molecular cloning 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989
[5] 苗健红，王嘉酺.干扰素.见:周廷冲.多肽生长因子基础与临床[M].北京：中国科学技术出版社，1992.525
[6] Michael Bevan.Binary agrobacterum vectors for plant transformation[J]. Necleic Acids Res, 1984,12:8711
收稿日期：1998-12-17；, 百拇医药
单位：张奉学 符林春 黄玲 郭兴伯 李国桥(广州中医药大学热带医学研究所，广州 510405)；康良仪 韩爱东 王寰宇(中国科学院微生物研究所，北京 100083)
关键词：干扰素Ⅲ型；植物，转基因；植物，药用
广州中医药大学学报990309摘要：为研究在药用植物中表达人干扰素(IFN)，构建了人IFN-γ植物双元表达载体。方法是将IFN-γ基因的pstI片段插入克隆载体PBluescript SK(+)中，通过蓝白斑筛选 以xbaI/kpnI证实，以ndeI/kpnI鉴定插入方向。得到中间载体PSKIFN，用xbaI/kpnI双酶切PSKIFN，回收1.3kb片段，将此片段插入植物表达载体PROKII上，经限制性酶切分析及自动测序，结果证实插入片段大小及序列正确，构建获得成功，为进一步在药用植物中表达IFN-γ奠定了基础。
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中图分类号：Q786 文献标识码：A
Construction of Plant Binary Expression Vector of Human Interferon-γ
ZHANG Fengxue，FU Linchun，HUANG Ling，GUO Xingbo，LI Guoqiao
(Tropical Medicine Institute, Guangzhou University of TCM, Guangzhou 510405, China)；
KANG Liangyi，HAN Aidong，WANG Huanyu
(Institute of Microbiology, Chinese Academy of Science, Beijing 100083,China)
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Abstract:Plant binary expression vector of human Interferon-γ(HIFN-γ) was constructed to study the expression of in medicinal plant. The method was as follow. The plasmid of PSWIF including interferon-γ gene was digested with pst Ⅰ and low melting point agarose was used to recover the fragment of HIFN-γ.Then the recovered fragment was cloned to the vector of PBluescript SK(+) to form an intermediate vector of PSKIFN.The PSKIFN was digested with kpn I /xba Ⅰ and then coned to plant expression vector of PROK Ⅱ to form the plant binary expression vector of PROKIFN. The PROKIFNwas identified with digestion of kpn Ⅰ / xba Ⅰ and automatic sequence system. The result of restriction analysis showed that the length of inserted fragment was about 1.3kb and that of automatic sequence showed the sequence of inserted fragment was correct.
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Key words:INTERFERON TYPE Ⅲ； PLANTS， TRANSGENIC； PLANTS, MEDICINAL
干扰素(Interferon, IFN)是由细胞产生的一类诱生性的小分子量、高活性、多功能和多用途的蛋白质。它是由多功能细胞因子组成的异源家族。IFN-γ为T淋巴细胞在有丝分裂刺激下产生，又称免疫干扰素。人IFN-γ结构基因位于第12号染色体，编码一个143个氨基酸的碱性蛋白质[1]。近年来大量制备IFN的方法已取得了不少进展。目前用人细胞制备的干扰素有白细胞、类淋巴细胞、成纤维细胞和免疫干扰素，除免疫的干扰素外，其他均已能自动化大量生产。但用人细胞制备的干扰素具有明显的缺点：生产成本高、价格昂贵且有传染多种疾病包括艾滋病的可能。随着分子生物学的飞速发展，目前基因工程生产的重组干扰素已获成功，基因工程载体包括大肠杆菌、酵母、昆虫、地鼠卵巢等细胞。同时，人们还把目光转向另一类载体—植物细胞。我国学者陈炬等[2]首先在烟草植株中表达人IFN-α，稍后，在烟草中表达人IFN-β也获得成功[3]。有鉴于此，我们构建了人IFN-γ植物双元表达载体，以便在药用植物中进行表达。
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1 材料
细菌、质粒：大肠杆菌DH5α，克隆载体PSK(+)及表达载体PROKII均由中科院微生物研究所提供。
酶：限制性内切酶pstI、kpnI、xbaI及kpnI,T4 DNA 连接酶购自Promeaga或华美生物工程公司。
培养基：酵母浸出粉和蛋白胨为oxoid产品。
试剂：低熔点琼脂糖、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)和5-溴-4-录-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)为Sigma产品，其他化学制剂均为进口或国产分析纯试剂。
2 方法
2.1 含IFN-γ基因的中间载体PSKIFN的构建
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2.1.1 IFN-γ基因片段的回收及PBluescript Ⅱ SK+(PSK+)载体的制备 将含IFN-γ基因的质粒转化大肠杆菌DH5α，碱变性法提取质粒DNA，在下列酶切体系中酶切：20μL质粒DNA，6μL10×酶切缓冲液，3μLPstI,31μL双蒸水，37℃水浴2h,微型琼脂糖胶证实酶切效果，采用低熔点琼脂糖回收片段。回收方法：紫外灯下切取目的片段，加2倍体积双蒸水，65℃10min溶解，加300μL饱和酚，摇匀，离心，吸取水相加300μL酚：氯仿，离心，吸取水相加2.5倍体积无水乙醇，1/10体积3mol/L醋酸钠，置液氮10min，取出待溶解后离心10min，乙醇漂洗，凉干即可用于连续反应。PSK+载体按同法制备。
2.1.2 连接反应 连接反应体系：4μLPSKIFN、1μLPSK+、4μL10×连接酶缓冲液、1μLT4DNA连接酶、10μL双蒸水，置16℃保温超过6h。
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2.1.3 连接产物转化大肠杆菌DH5α 按分子克隆方法操作[4]。
2.1.4 重组子的鉴定 在含100mg/L的LB平板上(已涂布40μLX-gal、5μLIPTG)，涂布50μL转化菌液，于37℃下培养16h，再置4℃使蓝色反应完全。挑取白色菌落接种于3mL LB(Luria-Bertani,含氨苄青霉素100mg/L)中，37℃200r/min,培养12h，碱变性法提取重组DNA，用于如下鉴定。
大小鉴定：采用pstI、kpnI、xbaI单酶切及kpnI/xbaI双酶切鉴定。
方向鉴定：根据已知IFN-γ序列及PSK+多克隆位点设计,采用kpnI和ndeI双酶切作方向鉴定。
序列鉴定：自动测序由北京赛百盛公司代测。
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2.2 含IFN-γ基因的植物表达载体的构建
2.2.1 从PSKIFN中回收含IFN-γ片段及PROKII载体制备 选择正向插入的克隆PSKIFN，采用 kpnI/xbaI双酶切，低熔点琼脂糖法回收片段。PROKII载体按同法制备。
2.2.2 IFN-γ与PROKII的连接与转化 连接体系为：1μLPSKIFN，4μLPROKII，1μLT4 DNA Ligase，4μL10×连接缓冲液，10μL双蒸水，16℃保温6h，转化DH5α，转化培养完毕取50μL菌液涂布含卡那霉素100mg/L的LB平板。挑取菌落接种3mLLB(含100mg/L卡那霉素)，培养6h以上，提取质粒用于鉴定。
2.2.3 限制性内切酶鉴定 采用kpnI、xbaI单酶切和kpnI/xbaI双酶切。
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2.2.4 序列鉴定 自动测序由北京赛百盛生物工程公司测定。
3 结果
3.1 片段大小鉴定 含IFN-γ片段的质粒PSWIF是人IFN-γ基因克隆进入PBR322pstI位点，插入片段为1218bp。将此片段用pstI单酶切切下，克隆到PSK+得到中间载体PSKIFN，将PSKIFN用kpnI和xbaI双酶切，克隆到植物表达载体PROKII上，得到植物双元表达载体PROKIFN，对这 3个质粒分别以PSKIFNkpnI、xbaI单酶以及kpnI和xbaI双酶切。对于PSKIFNpstI单酶切应得到1220bp和3000bp两个片段，kpnI和xbaI双酶切得到与其相似的片段，而kpnI单酶切则应得到4200bp的单一片段。结果与预期吻合(见图1的2道、3道、4道，图2的4道)。对于PROKIFNkpnI和xbaI双酶切预期应得到1250bp和9800bp两个片段，结果见图2的2道。
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图1 PSKIFN的酶切鉴定
1、5道：marker(λDNA EcoRI/HindIII)；2道：pstI酶切；
3道：kpnI酶切；4道：kpnI/xbaI酶切
图2 PSKIFN和PROKIFN的酶切分析
1、3、5道：marker;2道：PROKIFN的xbaI/kpnI酶切；
4道：PSKIFN的xbaI/kpnI酶切
3.2 插入方向鉴定 由于中间克隆PSKIFN是pstI单酶切位点插入，存在两端插入可能性，根据已知IFN-γ序列进行DNASIS分析，选择ndeI/kpnI作为方向鉴定用酶，对PSKIFN进行方向鉴定，预期正向插入片段将得到3.1kb和1.1kb两个片段，而反向插入则得到3.9kb和250bp两片段。结果证实得到正向插入片段。由于将PSKIFN、kpnI/xbaI克隆到PROKII上是采用定向克隆，所以不需要进行方向鉴定。
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3.3 序列鉴定 对中间克隆PSKIFN和植物双元表达载体PROKIFN分别采用T7和Sp6启动子序列进行自动测序，每个反应可读约700bp，从两端可读完整的插入序列，所得序列与已发表的序列对照，插入序列完全正确。其基因序列测序结果表明，编码IFN-γ的基因起始位点(AUG)位于第114bp，终止位点位于612bp，从起始位点开始的69bp为一个信号肽序列，编码一个23个氨基酸的信号肽，这一序列在分子释放前被切除。接着是一个编码一个143个氨基酸的碱性蛋白质序列[5](自动测序图谱存编辑部待查)。
4 讨论
利用Ti质粒载体系统将外源基因转化到植物染色体中是迄今为止最为有效的获得遗传性稳定基因工程植物的方法。为了利用农杆菌介导在植物中表达人IFN-γ，通过一步中间克隆，将1.2kb大小的IFN-γ基因克隆到植物表达载体PROKII上。PROKII是常用的植物双元表达载体之一[6]，具有CaMV35S启动子和NOS终止子，含有NPTII基因，可在植物中表达新霉素磷酸转移酶，使转化的植物细胞和组织能在含卡那霉素的培养基上生长，作为加压筛选因子；它还具有Ti质粒的T-DNA的左右边界序列，有利于外源基因在植物宿主染色体上的整合与表达。该载体的构建为进一步在植物中表达IFN-γ奠定了基础。
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作者简介：第一作者，男，助理研究员；
基金项目：国家自然科学基金(39770902)、国家中医药管理局(97Z082)、广东省科委科学基金(960542)资助
参考文献：
[1] Wessmann C, Weber H. The interferon genes[J].Prog Nucleic Acid Res Mol Biol,1986,33:251
[2] 陈炬，孙勇如，李向辉，等.人α-干扰素cDNA在转化的烟草植株中的表达[J].中国科学(B辑)，1990，3：253
[3] Edelbaum A, stein D, Holland N, et al. Expression of active human interferon-beta in transgenic plants[J].J Interferon Res, 1992, 12:449
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[4] Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Extraction and Purification of Plasmid DNA[J]. see:Molecular cloning 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989
[5] 苗健红，王嘉酺.干扰素.见:周廷冲.多肽生长因子基础与临床[M].北京：中国科学技术出版社，1992.525
[6] Michael Bevan.Binary agrobacterum vectors for plant transformation[J]. Necleic Acids Res, 1984,12:8711
收稿日期：1998-12-17；, 百拇医药