脾虚小鼠红细胞免疫和腹腔巨噬细胞吞噬功能改变的实验研究*
作者：章 梅 夏 天 张仲海
单位：第四军医大学西京医院 陕西710032
关键词：脾虚证；腹腔巨噬细胞；吞噬功能；红细胞免疫；四君子汤；小鼠
北京中医药大学学报990311 摘 要：采用化学发光测定和分析的方法，对利血平造模的小鼠进行腹腔巨噬细胞吞噬功能和红细胞免疫功能的测定。结果：脾虚证小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能和红细胞免疫功能下降，经四君子汤治疗后腹腔巨噬细胞吞噬功能和红细胞免疫功能明显恢复和增强。
Experimental Study on the Erythrocyte Immunization and Phagocytic Change of Celiac Macrophagocyte in the Mouse Model with Deficient Spleen Syndrome
, http://www.100md.com
Zhang Mei, Xia Tian, Zhang Zhonghai
(Xijing Hospital of No.4military Medical University, Shaanxi 710032)
ABSTRACT: Objective: Test the phagocytic function of celiac macrophagocyte and the erythrocyte immunization, to study the essence of deficient spleen syndrome from the perspective of nonspecific immunity. Methods: Using chemiluminescence assay to determine phagocytic function of celiac macrophagocyte and the erythrocyte immunization of the mouse model by reserpine. Results: The phagocytic function of celiac macrophagocyte and the erythrocyte immunization were decreased in the deficient spleen mouse model. After treating with Sijunzi Tang which can invigorate the spleen and replenish qi in TCM, the phagocytic function of celiac macrophagocyte and the erythrocyte immunization were markedly restored and enhanced. Conclusion: the decreased nonspecific immunologic function of deficient spleen syndrome provide a fresh database for the study on the essence of deficient spleen syndrome in the immunologic function.
, 百拇医药
KEY WORDS: Deficient spleen syndrome; Celiac macrophagocyte; Phagocytic function; Erythrocyte immunization; Sijunzi Tang
1 材料和方法
1.1 材料
7～8周龄体重18～20g雄性BALB/C小鼠，购自第四军医大学动物实验中心；人参、茯苓、白术、炙甘草购自西京医院中医药房；酵母多糖为美国Sigma公司产品；补体致敏酵母菌由西京医院检验科提供，磷酸缓冲液内含0.14mol/L NaCl，2.7mol/L KCl，12mol/L Na2HPO4,1.5mol/L KH2-PO4,0.9mol/LmgCl2;鲁米诺为Merk-Schucharbg公司产品；SGH-I型化学发光检测仪为上海计量工程局实验仪器厂生产；RPMI-1640培养液，美国Gibc公司；24孔培养板，美国Corning公司；CO2细胞培养箱：Sheldon manufacturing INC；倒置显微镜：重庆光学仪器厂。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 动物模型的复制：将24只小白鼠随机分为3组，每组8只。①正常组：皮下注射生理盐水2mL/(只.d)，同时胃饲蒸馏水0.25mL/(只.d)；②脾虚组：皮下注射利血平0.3mg/(kg.d)，胃饲蒸馏水0.25mL/(只.d)；③四君子汤治疗组：皮下注射利血平0.3mg/(kg.d)，并胃饲四君子汤煎液0.25mL/(只.d)，含生药1g。于第6天，脾虚组小鼠出现稀便、食量减少、少动等症状。第12天，体重减轻，食少等脾虚诸症明显加重，而治疗组及正常组均无此表现。
1.2.2 酵母多糖的调制：称取酵母多糖于生理盐水中混匀后煮沸30min；1000r/min，离心
10min，弃上清，加生理盐水及正常鼠血清，混匀后于37℃温育30min，洗涤后，用生理盐水调成10g/L，混匀分装，备用。
, 百拇医药
1.2.3 腹腔巨噬细胞制备：小鼠腹腔注射0.15 MPBS 3mL，轻揉腹部5min后，和0.15 MPBS适量冲洗腹腔多次，收集腹腔巨噬细胞，经离心沉淀后，去上清，用10%FCS的RPMI-1640培养液，配成2×109 L-1的细胞悬液，加入24孔板内，每孔1mL，置37℃、5%CO2培养2 h后，倾去上清，用0.02%DETA-0.15MPBS处理10min后，用RPMI-1640洗下纯化的巨噬细胞，调浓度为1×109L-1，取1mL细胞悬液离心去上清，加入pH 6.4的PBS的缓冲液0.2mL。
1.2.4 吞噬发光检测：取腹腔巨噬细胞100μL，磷酸缓冲液200μL，鲁米诺扩增液100μL，混匀后，于37℃平衡2～3min测6 s本底脉冲数，再滴加调理的酵母多糖100μL，于37℃恒温下每隔2min测1次6s CPM，连续15次，全部检测过程使用SHG-I型化学发光检测仪进行。
, http://www.100md.com
1.2.5 红细胞免疫功能测定：红细胞C3b受体(RBC-C3bR)花环试验和细胞免疫复合物(RBC-IC)花环试验参照文献[1]。
2 结果
2.1 腹腔巨噬细胞吞噬发光强度积分值、发光峰值比较
结果见表1。
表1 腹腔巨噬细胞吞噬发光强度积分值、光峰值(AMP为2×103个；
±s) 组别
n
积分值
峰 值
, http://www.100md.com
正常组
8
129.84±57.41
22.84±7.31
脾虚组
8
36.92±15.37**△△
6.65±1.76**△△
治疗组
8
168.21±87.52
21.93±11.64
, 百拇医药
注：与正常组比较△△P<0.01； 与治疗组比较**P<0.012.2 红细胞免疫功能
结果见表2。
表2 红细胞免疫功能 (±s) 组别
n
RBC-C3b花环率/%
RBC-IC花环率/%
正常组
8
19.87±2.47
4.21±1.89
, 百拇医药
脾虚组
8
10.79±4.80**△
3.48±1.12**△△
治疗组
8
16.23±4.15
1.65±2.01
注：与正常组比较**P<0.01；与治疗组比较△P<0.05 △△P<0.013 讨论
中医学认为脾主运化，为气血生化之源，脾胃所伤，则百病由生，脾旺则不受邪，以上论述都体现了一定的免疫学思想。现代研究也发现在脾虚证患者及动物模型的机体变化中，有不同程度的免疫学指标改变，提示脾与免疫有一定联系。
, 百拇医药
小鼠腹腔巨噬细胞具有吞噬作用，借助于它，机体可能吞噬和杀灭细菌，它是机体一项重要的免疫功能。1972年Allen首先观察到多形核细胞吞噬过程中产生化学发光(Chenelumiexcenec,CL)现象，从而建立了快速准确的检测细胞吞噬功能的CL方法[2]。巨噬细胞受到调理过的酵母菌刺激后，发光呼吸“暴发”，产生OH、O2、H2O2等氧的活性集团，同时伴有发光现象，但十分微弱，加入鲁米诺后，鲁米诺可被活性氧化成激发态，当回复到基态时发出大量光子，使CL测定的敏感性明显增加。腹腔巨噬细胞化学发光与白细胞吞噬杀菌功能密切相关[3]。本研究采用化学发光测定和分析的方法，对脾虚模型小鼠进行了腹腔巨噬细胞吞噬功能的测定，结果表明，脾虚小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能下降，与正常比较差异显著(P<0.01)，经四君子汤健脾益气治疗后，腹腔巨噬细胞吞噬功能明显恢复(P<0.01)，说明脾虚证机体非特异性免疫功能失调，腹腔巨噬细胞的吞噬功能下降，与中医对脾的认识相符合。腹腔巨噬细胞功能下降是脾虚证免疫机能失调的重要方面之一。增强腹腔巨噬细胞吞噬功能，改善非特异性免疫功能是四君子汤健脾益气作用的具体环节之一。
, 百拇医药
本研究发现，脾虚时红细胞C3b受体水平下降，提示红细胞介导的清除循环免疫复合物及免疫粘附功能下降，从而导致脾虚时免疫功能的低下。循环免疫复合物的增多，给机体带来许多不利的影响，它可以沉积于很多组织器官，能固定血小板、补体，并与血小板、中性粒细胞及其它炎性细胞上的受体发生反应，导致各种炎症的发生；它能直接或通过补体调节T细胞和B细胞的活化，并能影响中性粒细胞表面对抗原的接受，从而影响细胞免疫和体液免疫[4]。说明脾虚时红细胞C3b受体形成率在某种程度上反映了脾虚时免疫功能的改变，引起这种红细胞C3b受体形成率改变的原因可能是由于脾虚时细胞免疫、非特异性免疫等各种因素综合作用的结果，红细胞C3b受体含量可作为分析脾虚证免疫功能状态的参考指标之一。四君子汤可提高脾虚对小鼠的红细胞免疫功能，从而达到健脾益气的目的。
* 国家自然科学基金资助项目
作者简介：章梅，女，32岁，医学硕士，讲师
, http://www.100md.com
参考文献
1 欧阳松.细胞免疫测定方法改进.临床检验杂志，1985，(3)：18～19
2 何建文.微量全血化学发光法对病毒性肝炎患者中性粒细胞吞噬功能的研究.中国实验临床免疫学杂志，1991，3(6)：23～24
3 Grebner TV.Comparison of phagocytic and chemiluminessence response of human pohymorphonuclear neutrophils. J Lab Clin Med. 1977,89:153～156
4 粕川醴司.免疫复合物病.北京：科学出版社，1986.36～38
(收稿日期：1998-01-08), 百拇医药
单位：第四军医大学西京医院 陕西710032
关键词：脾虚证；腹腔巨噬细胞；吞噬功能；红细胞免疫；四君子汤；小鼠
北京中医药大学学报990311 摘 要：采用化学发光测定和分析的方法，对利血平造模的小鼠进行腹腔巨噬细胞吞噬功能和红细胞免疫功能的测定。结果：脾虚证小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能和红细胞免疫功能下降，经四君子汤治疗后腹腔巨噬细胞吞噬功能和红细胞免疫功能明显恢复和增强。
Experimental Study on the Erythrocyte Immunization and Phagocytic Change of Celiac Macrophagocyte in the Mouse Model with Deficient Spleen Syndrome
, http://www.100md.com
Zhang Mei, Xia Tian, Zhang Zhonghai
(Xijing Hospital of No.4military Medical University, Shaanxi 710032)
ABSTRACT: Objective: Test the phagocytic function of celiac macrophagocyte and the erythrocyte immunization, to study the essence of deficient spleen syndrome from the perspective of nonspecific immunity. Methods: Using chemiluminescence assay to determine phagocytic function of celiac macrophagocyte and the erythrocyte immunization of the mouse model by reserpine. Results: The phagocytic function of celiac macrophagocyte and the erythrocyte immunization were decreased in the deficient spleen mouse model. After treating with Sijunzi Tang which can invigorate the spleen and replenish qi in TCM, the phagocytic function of celiac macrophagocyte and the erythrocyte immunization were markedly restored and enhanced. Conclusion: the decreased nonspecific immunologic function of deficient spleen syndrome provide a fresh database for the study on the essence of deficient spleen syndrome in the immunologic function.
, 百拇医药
KEY WORDS: Deficient spleen syndrome; Celiac macrophagocyte; Phagocytic function; Erythrocyte immunization; Sijunzi Tang
1 材料和方法
1.1 材料
7～8周龄体重18～20g雄性BALB/C小鼠，购自第四军医大学动物实验中心；人参、茯苓、白术、炙甘草购自西京医院中医药房；酵母多糖为美国Sigma公司产品；补体致敏酵母菌由西京医院检验科提供，磷酸缓冲液内含0.14mol/L NaCl，2.7mol/L KCl，12mol/L Na2HPO4,1.5mol/L KH2-PO4,0.9mol/LmgCl2;鲁米诺为Merk-Schucharbg公司产品；SGH-I型化学发光检测仪为上海计量工程局实验仪器厂生产；RPMI-1640培养液，美国Gibc公司；24孔培养板，美国Corning公司；CO2细胞培养箱：Sheldon manufacturing INC；倒置显微镜：重庆光学仪器厂。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 动物模型的复制：将24只小白鼠随机分为3组，每组8只。①正常组：皮下注射生理盐水2mL/(只.d)，同时胃饲蒸馏水0.25mL/(只.d)；②脾虚组：皮下注射利血平0.3mg/(kg.d)，胃饲蒸馏水0.25mL/(只.d)；③四君子汤治疗组：皮下注射利血平0.3mg/(kg.d)，并胃饲四君子汤煎液0.25mL/(只.d)，含生药1g。于第6天，脾虚组小鼠出现稀便、食量减少、少动等症状。第12天，体重减轻，食少等脾虚诸症明显加重，而治疗组及正常组均无此表现。
1.2.2 酵母多糖的调制：称取酵母多糖于生理盐水中混匀后煮沸30min；1000r/min，离心
10min，弃上清，加生理盐水及正常鼠血清，混匀后于37℃温育30min，洗涤后，用生理盐水调成10g/L，混匀分装，备用。
, 百拇医药
1.2.3 腹腔巨噬细胞制备：小鼠腹腔注射0.15 MPBS 3mL，轻揉腹部5min后，和0.15 MPBS适量冲洗腹腔多次，收集腹腔巨噬细胞，经离心沉淀后，去上清，用10%FCS的RPMI-1640培养液，配成2×109 L-1的细胞悬液，加入24孔板内，每孔1mL，置37℃、5%CO2培养2 h后，倾去上清，用0.02%DETA-0.15MPBS处理10min后，用RPMI-1640洗下纯化的巨噬细胞，调浓度为1×109L-1，取1mL细胞悬液离心去上清，加入pH 6.4的PBS的缓冲液0.2mL。
1.2.4 吞噬发光检测：取腹腔巨噬细胞100μL，磷酸缓冲液200μL，鲁米诺扩增液100μL，混匀后，于37℃平衡2～3min测6 s本底脉冲数，再滴加调理的酵母多糖100μL，于37℃恒温下每隔2min测1次6s CPM，连续15次，全部检测过程使用SHG-I型化学发光检测仪进行。
, http://www.100md.com
1.2.5 红细胞免疫功能测定：红细胞C3b受体(RBC-C3bR)花环试验和细胞免疫复合物(RBC-IC)花环试验参照文献[1]。
2 结果
2.1 腹腔巨噬细胞吞噬发光强度积分值、发光峰值比较
结果见表1。
表1 腹腔巨噬细胞吞噬发光强度积分值、光峰值(AMP为2×103个；
±s) 组别n
积分值
峰 值
, http://www.100md.com
正常组
8
129.84±57.41
22.84±7.31
脾虚组
8
36.92±15.37**△△
6.65±1.76**△△
治疗组
8
168.21±87.52
21.93±11.64
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注：与正常组比较△△P<0.01； 与治疗组比较**P<0.012.2 红细胞免疫功能
结果见表2。
表2 红细胞免疫功能 (
±s) 组别n
RBC-C3b花环率/%
RBC-IC花环率/%
正常组
8
19.87±2.47
4.21±1.89
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脾虚组
8
10.79±4.80**△
3.48±1.12**△△
治疗组
8
16.23±4.15
1.65±2.01
注：与正常组比较**P<0.01；与治疗组比较△P<0.05 △△P<0.013 讨论
中医学认为脾主运化，为气血生化之源，脾胃所伤，则百病由生，脾旺则不受邪，以上论述都体现了一定的免疫学思想。现代研究也发现在脾虚证患者及动物模型的机体变化中，有不同程度的免疫学指标改变，提示脾与免疫有一定联系。
, 百拇医药
小鼠腹腔巨噬细胞具有吞噬作用，借助于它，机体可能吞噬和杀灭细菌，它是机体一项重要的免疫功能。1972年Allen首先观察到多形核细胞吞噬过程中产生化学发光(Chenelumiexcenec,CL)现象，从而建立了快速准确的检测细胞吞噬功能的CL方法[2]。巨噬细胞受到调理过的酵母菌刺激后，发光呼吸“暴发”，产生OH、O2、H2O2等氧的活性集团，同时伴有发光现象，但十分微弱，加入鲁米诺后，鲁米诺可被活性氧化成激发态，当回复到基态时发出大量光子，使CL测定的敏感性明显增加。腹腔巨噬细胞化学发光与白细胞吞噬杀菌功能密切相关[3]。本研究采用化学发光测定和分析的方法，对脾虚模型小鼠进行了腹腔巨噬细胞吞噬功能的测定，结果表明，脾虚小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能下降，与正常比较差异显著(P<0.01)，经四君子汤健脾益气治疗后，腹腔巨噬细胞吞噬功能明显恢复(P<0.01)，说明脾虚证机体非特异性免疫功能失调，腹腔巨噬细胞的吞噬功能下降，与中医对脾的认识相符合。腹腔巨噬细胞功能下降是脾虚证免疫机能失调的重要方面之一。增强腹腔巨噬细胞吞噬功能，改善非特异性免疫功能是四君子汤健脾益气作用的具体环节之一。
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本研究发现，脾虚时红细胞C3b受体水平下降，提示红细胞介导的清除循环免疫复合物及免疫粘附功能下降，从而导致脾虚时免疫功能的低下。循环免疫复合物的增多，给机体带来许多不利的影响，它可以沉积于很多组织器官，能固定血小板、补体，并与血小板、中性粒细胞及其它炎性细胞上的受体发生反应，导致各种炎症的发生；它能直接或通过补体调节T细胞和B细胞的活化，并能影响中性粒细胞表面对抗原的接受，从而影响细胞免疫和体液免疫[4]。说明脾虚时红细胞C3b受体形成率在某种程度上反映了脾虚时免疫功能的改变，引起这种红细胞C3b受体形成率改变的原因可能是由于脾虚时细胞免疫、非特异性免疫等各种因素综合作用的结果，红细胞C3b受体含量可作为分析脾虚证免疫功能状态的参考指标之一。四君子汤可提高脾虚对小鼠的红细胞免疫功能，从而达到健脾益气的目的。
* 国家自然科学基金资助项目
作者简介：章梅，女，32岁，医学硕士，讲师
, http://www.100md.com
参考文献
1 欧阳松.细胞免疫测定方法改进.临床检验杂志，1985，(3)：18～19
2 何建文.微量全血化学发光法对病毒性肝炎患者中性粒细胞吞噬功能的研究.中国实验临床免疫学杂志，1991，3(6)：23～24
3 Grebner TV.Comparison of phagocytic and chemiluminessence response of human pohymorphonuclear neutrophils. J Lab Clin Med. 1977,89:153～156
4 粕川醴司.免疫复合物病.北京：科学出版社，1986.36～38
(收稿日期：1998-01-08), 百拇医药
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