姜黄素诱导Lovo细胞凋亡
作者：陈 宏 张振书 张亚历 姜 泊 周殿元
单位：陈 宏 张振书 张亚历 姜 泊 周殿元(第一军医大学南方医院消化内 科学广州)
关键词：姜黄素；结肠癌细胞；凋亡
摘 要 目的 旨在探讨姜黄素体外抗人结肠癌Lovo细胞生长的作用 摘 要 目的 旨在探讨姜黄素体外抗人结肠癌Lovo细胞生长的作用。方法 采用口 丫啶橙荧光染色、透射电镜观察、流式细胞仪测定及DNA凝胶电泳等技术研究姜黄素诱导肿瘤细胞凋亡的作用。结果 经姜黄素20μM处理24h肿瘤细胞即可发生凋亡，凋亡率达32.6%。DNA凝胶电泳产生特征性DNA梯形带。口 丫啶橙荧光染色和透射电镜观察证实肿瘤细胞形态呈凋亡特征性改变。结论 姜黄素可诱导肿瘤细胞凋亡，这种作用可能是姜黄素抗癌作用机制的一个重要方面。
Curcumin Induces Lovo Cell Apoptosis
, 百拇医药
Chen Hong,Zhang Zhenshu,Zhang Yali,Jiang Bo,Zhou Dianyuan
(Department of Gastroenterology,Nanfang Hospital,The First Military Medical University,Guangzhou 510515)
Abstract:Objective:To probe the inhibitory effects of curcumin on growth of human colon carcinoma cells (Lovo) in vitro.Methods:Apoptosis induced by curcumin was detected by acridine-orange fluorescence,electronic microscopy,flow cytometry and DNA gel electrophoresis.Results:After 24 hours treatment with 20μM curcumin,it was found that apoptosis of Lovo cells occured in up to 32.6% of cells.DNA gel electrophoresis of the cells treated with curcumin showed characteristic DNA ladders.The apoptosis of Lovo cells was confirmed in cellular morphological alternations by acridine-orange fluorescence and electronic microscopy.Conclusion:Curcurmin can induce apoptosis of tumor cells and this effect may contribute to the mechanisms for anti-cancer activity of curcumin.
, 百拇医药
Key words Curcumin Colon carcinoma cell cultured Apoptosis
姜黄素(curcumin)是中药姜黄中提取出来的有效成分，具有无毒、副作用的特点。目前研究认为姜黄素可抑制体内、外肿瘤细胞的生长[1，2]。既往的研究认为，与姜黄同属的中药莪术其有效成分榄香烯具有诱发白血病细胞凋亡的作用[3]，非甾体类抗炎药(NSAIDs)舒林酸对大肠癌细胞具有诱导凋亡的作用[4]，而姜黄素具有NSAIDs类抗炎药的特点。因此，我们研究了姜黄素诱导大肠癌细胞的凋亡作用，现报告如下。
材料与方法
1 药物与试剂 姜黄素系英国DAH公司产品，RPMI-1640、四氮甲唑蓝(MTT)、二甲亚砜(DMSO)、碘化丙啶(PI)、口丫啶橙(acridine orange)、舒林酸(sulindac)系美国Sigma公司产品。
, 百拇医药
2 细胞 人结肠腺癌细胞株Lovo细胞由本校病理教研室提供。RPMI-1640加15%小牛血清培养液常规37℃、5%CO2培养箱中培养。
3 姜黄素溶液的配制 以少量DMSO溶解姜黄素粉剂，配成10mM/L的溶液，置于0℃冰箱保存。临用时，以完全培养液稀释姜黄素至所需浓度，使DMSO终浓度<0.1%。对照组培养液为含15%小牛血清的RPMI-1640培养液，其中DMSO<0.1%。
4 主要仪器 包括JEM-1200EX型透射电镜、FACS-420型流式细胞仪和日本NIKON荧光显微镜。
5 方法
5.1 口 丫啶橙荧光染色：见文献[5]。
5.2 透射电镜观察 细胞样品按常规处理后，在透射电镜下观察细胞的超微结构。
, 百拇医药
5.3 DNA含量组方图和光散射图谱分析 按文献报道方法用流式细胞仪测定[5]。根据DNA含量组方图中出现的“亚G1峰”计算凋亡细胞百分数，在光散射图谱上，分析前向光散射(反映细胞大小的指标：细胞凋亡时，常表现细胞皱缩，故前向光散射低于正常；细胞坏死时，常表现细胞肿胀，故前相光散射高于正常)的变化。
5.4 琼脂糖凝胶电泳观察细胞凋亡导致的DNA梯形带 收集细胞样品，按文献[5]提取DNA，真空抽干后，溶于40μl TE缓冲液中，加入10μl RNase，37℃水浴30min。取所制备的样品20μl在含溴化乙啶的1.5%琼脂糖凝胶中电泳(电压60mV～80mV)，紫外检测仪下观察。同时设地塞米松诱导的小鼠胸腺凋亡细胞DNA和舒林酸诱导的Lovo凋亡细胞DNA作为阳性对照。
结果
1 荧光染色结果 姜黄素20μM处理Lovo细胞24h后，口丫啶橙染色可见较多细胞核或细胞质内含有致密浓染的黄绿色荧光的细胞，甚至可见黄绿色碎片，细胞体积缩小。而对照组细胞核为均匀的黄色或黄绿色荧光，细胞质为均匀的桔红色荧光，细胞体积较大，大小一致(图1)。
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2 姜黄素对细胞超微结构的影响 姜黄素20μM处理Lovo细胞24h后，可见部分细胞呈典型的凋亡细胞形态学改变(图2)。
图1 口丫啶橙荧光染色
A：对照组细胞核为均匀的黄色或黄绿色荧光，细胞质为均匀的桔红色荧光，细胞体积较大，大小一致。B：姜黄素处理组细胞核或细胞质内含有致密浓染的黄绿色荧光颗粒，甚至可见黄绿色碎片，细胞体积缩小。
图2 姜黄素20μM处理24h的Lovo细胞超微结构观察，细胞核染色质固缩，聚集于核膜下，呈块状或新月形小体，可见凋亡小体。核内出现透明区，核仁消失。出现空泡变性，细胞器减少，细胞尚保持结构、胞膜外可见大量的微绒毛，发生扩展并断裂。
, 百拇医药
3 DNA组方图和光散射图谱分析结果 对照组DNA组方图呈典型的肿瘤细胞G0/1、S、G2+M峰型，姜黄素20μM处理24h后，G0/1期前出现明显的亚G1峰，凋亡率为32.6%；而处理48h后，未见明显亚G1峰(图3)。在光散射图谱上处理组前向光散射(FS)均低于对照组，提示经姜黄素处理细胞体积缩小(图4)。
4 DNA凝胶电泳结果 姜黄素20μM处理24h，显示DNA凋亡梯形条带，对照组则为正常细胞基因组条带，坏死细胞呈均匀膜状条带(图5)。
图3 FCM测定DNA组方图
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图4 FCM测定光散射图
A：坏死 B：正常 C：舒林酸 D：姜黄素 E：小鼠胸腺
图5 DNA凝胶电泳
讨论
细胞凋亡(apoptosis)是细胞按自身的程序进行的一种自杀性主动死亡，故细胞凋亡又称编程性细胞死亡(programmed cell death,PCD)。目前姜黄素作为一种抗癌药尚处于临床前试验阶段[6]。我们采用口丫啶橙荧光染色、透射电镜观察、流式细胞仪测定、琼脂糖凝胶电泳研究了姜黄素体外诱导大肠癌细胞凋亡的作用。结果发现姜黄素经20μM姜黄素作用24h，即可诱导Lovo细胞出现凋亡。口丫啶橙染色可见较多细胞核或细胞质内含有致密浓染的黄绿色荧光的细胞，甚至可见黄绿色碎片，细胞体积缩小。流式细胞仪检测出现明显的“亚G1峰”，凋亡率为32.6%，并出现低前向光散射，提示细胞皱缩，发生凋亡。DNA电泳出现凋亡梯形条带。透射电镜观察细胞变圆、变小、核仁消失，染色质浓缩、断裂，聚集于细胞核周边，呈新月形，胞浆浓缩，胞浆中出现较多的空泡，可见凋亡小体。而作用48h后，流式细胞仪检测未出现明显的“亚G1峰”，可能与凋亡细胞染色质进一步降解，细胞裂解死亡有关。
, 百拇医药
以往研究发现姜黄素可抑制细胞蛋白激酶C和酪氨酸蛋白激酶的活性[7，8]，目前认为细胞凋亡的过程受到来自细胞内、外诸多信号的调控[9]，蛋白激酶C对细胞凋亡具有一定的调控作用，其激活物佛波酯可抑制某些特定条件下的细胞凋亡，用蛋白激酶C的抑制剂，如Polymixin、H-7和神经鞘氨醇则可以抵消佛波酯的上述作用；酪氨酸蛋白激酶所介导的信号系统对细胞凋亡起着重要的负调控作用，此信号传导途径被阻断可诱导某些细胞的凋亡。然而，姜黄素诱导肿瘤细胞凋亡的确切机理有待进一步研究。
作者简介：陈宏，男，31岁。1991年第三军大学预防系本科毕业，1997年第一军医大学消化内科硕士毕业，目前在该校攻读消化内科博士学位。
参考文献
[1] Rao CV,Rivenson A,Simi B,et al.Chemoprevention of colon carcinogenesis by dietary curcumin, a Naturally Occurring plant phenoloc compound.Cancer Res.,1995,55:259
, http://www.100md.com
[2] Kuttan R,Bhanumathy P,Nirmala K,et al.Potential anticancer activity of turmeric(curcuma longa).Cancer Lett.,1985,2:197
[3] 杨骅，王仙平，郁琳琳，等.榄香烯抗癌作用与诱发肿瘤细胞凋亡.中华肿瘤杂志，1996，3：169
[4] Piazza GA,Rahm ALK,Krutzsch M,et al.Antineoplastic drugs sulindac sulfone inhitit cell growth by inducing Apoptosis.Cancer Res.,1995,55:3110
[5] 姜泊，张亚历，周殿元.分子生物学常用实验方法.北京：人民军医出版社，1996.174
, 百拇医药
[6] 陈宏，张振书.姜黄的药理作用研究概况.国外医学中医中药分册，1996，6：3
[7] Liu JY,Lin SJ,Lin JK.Inhitibory effects of curcumin on protein kinase C activity induced by 12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate in NIH 3T3 cells.Carcinogenesis.1993,5:857
[8] Rao CV,Simi B,Reddy BS.Inhibition by dietary curcumin of azoxymethane-induced ornithine decarboxylase,tyrosine protein kinase,arachidonic acid metabolism and aberrant crypt foci formationin the rat colon.Carcinogenesis (Lond.),1993,14:2219
[9] 傅涛，徐永华.细胞凋亡的信号转导研究进展.细胞生物学杂志，1996，4：153
(收稿日期 1998—04—14 修回日期 1998—10—20), 百拇医药
单位：陈 宏 张振书 张亚历 姜 泊 周殿元(第一军医大学南方医院消化内 科学广州)
关键词：姜黄素；结肠癌细胞；凋亡
摘 要 目的 旨在探讨姜黄素体外抗人结肠癌Lovo细胞生长的作用 摘 要 目的 旨在探讨姜黄素体外抗人结肠癌Lovo细胞生长的作用。方法 采用口 丫啶橙荧光染色、透射电镜观察、流式细胞仪测定及DNA凝胶电泳等技术研究姜黄素诱导肿瘤细胞凋亡的作用。结果 经姜黄素20μM处理24h肿瘤细胞即可发生凋亡，凋亡率达32.6%。DNA凝胶电泳产生特征性DNA梯形带。口 丫啶橙荧光染色和透射电镜观察证实肿瘤细胞形态呈凋亡特征性改变。结论 姜黄素可诱导肿瘤细胞凋亡，这种作用可能是姜黄素抗癌作用机制的一个重要方面。
Curcumin Induces Lovo Cell Apoptosis
, 百拇医药
Chen Hong,Zhang Zhenshu,Zhang Yali,Jiang Bo,Zhou Dianyuan
(Department of Gastroenterology,Nanfang Hospital,The First Military Medical University,Guangzhou 510515)
Abstract:Objective:To probe the inhibitory effects of curcumin on growth of human colon carcinoma cells (Lovo) in vitro.Methods:Apoptosis induced by curcumin was detected by acridine-orange fluorescence,electronic microscopy,flow cytometry and DNA gel electrophoresis.Results:After 24 hours treatment with 20μM curcumin,it was found that apoptosis of Lovo cells occured in up to 32.6% of cells.DNA gel electrophoresis of the cells treated with curcumin showed characteristic DNA ladders.The apoptosis of Lovo cells was confirmed in cellular morphological alternations by acridine-orange fluorescence and electronic microscopy.Conclusion:Curcurmin can induce apoptosis of tumor cells and this effect may contribute to the mechanisms for anti-cancer activity of curcumin.
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Key words Curcumin Colon carcinoma cell cultured Apoptosis
姜黄素(curcumin)是中药姜黄中提取出来的有效成分，具有无毒、副作用的特点。目前研究认为姜黄素可抑制体内、外肿瘤细胞的生长[1，2]。既往的研究认为，与姜黄同属的中药莪术其有效成分榄香烯具有诱发白血病细胞凋亡的作用[3]，非甾体类抗炎药(NSAIDs)舒林酸对大肠癌细胞具有诱导凋亡的作用[4]，而姜黄素具有NSAIDs类抗炎药的特点。因此，我们研究了姜黄素诱导大肠癌细胞的凋亡作用，现报告如下。
材料与方法
1 药物与试剂 姜黄素系英国DAH公司产品，RPMI-1640、四氮甲唑蓝(MTT)、二甲亚砜(DMSO)、碘化丙啶(PI)、口丫啶橙(acridine orange)、舒林酸(sulindac)系美国Sigma公司产品。
, 百拇医药
2 细胞 人结肠腺癌细胞株Lovo细胞由本校病理教研室提供。RPMI-1640加15%小牛血清培养液常规37℃、5%CO2培养箱中培养。
3 姜黄素溶液的配制 以少量DMSO溶解姜黄素粉剂，配成10mM/L的溶液，置于0℃冰箱保存。临用时，以完全培养液稀释姜黄素至所需浓度，使DMSO终浓度<0.1%。对照组培养液为含15%小牛血清的RPMI-1640培养液，其中DMSO<0.1%。
4 主要仪器 包括JEM-1200EX型透射电镜、FACS-420型流式细胞仪和日本NIKON荧光显微镜。
5 方法
5.1 口 丫啶橙荧光染色：见文献[5]。
5.2 透射电镜观察 细胞样品按常规处理后，在透射电镜下观察细胞的超微结构。
, 百拇医药
5.3 DNA含量组方图和光散射图谱分析 按文献报道方法用流式细胞仪测定[5]。根据DNA含量组方图中出现的“亚G1峰”计算凋亡细胞百分数，在光散射图谱上，分析前向光散射(反映细胞大小的指标：细胞凋亡时，常表现细胞皱缩，故前向光散射低于正常；细胞坏死时，常表现细胞肿胀，故前相光散射高于正常)的变化。
5.4 琼脂糖凝胶电泳观察细胞凋亡导致的DNA梯形带 收集细胞样品，按文献[5]提取DNA，真空抽干后，溶于40μl TE缓冲液中，加入10μl RNase，37℃水浴30min。取所制备的样品20μl在含溴化乙啶的1.5%琼脂糖凝胶中电泳(电压60mV～80mV)，紫外检测仪下观察。同时设地塞米松诱导的小鼠胸腺凋亡细胞DNA和舒林酸诱导的Lovo凋亡细胞DNA作为阳性对照。
结果
1 荧光染色结果 姜黄素20μM处理Lovo细胞24h后，口丫啶橙染色可见较多细胞核或细胞质内含有致密浓染的黄绿色荧光的细胞，甚至可见黄绿色碎片，细胞体积缩小。而对照组细胞核为均匀的黄色或黄绿色荧光，细胞质为均匀的桔红色荧光，细胞体积较大，大小一致(图1)。
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2 姜黄素对细胞超微结构的影响 姜黄素20μM处理Lovo细胞24h后，可见部分细胞呈典型的凋亡细胞形态学改变(图2)。
图1 口丫啶橙荧光染色
A：对照组细胞核为均匀的黄色或黄绿色荧光，细胞质为均匀的桔红色荧光，细胞体积较大，大小一致。B：姜黄素处理组细胞核或细胞质内含有致密浓染的黄绿色荧光颗粒，甚至可见黄绿色碎片，细胞体积缩小。
图2 姜黄素20μM处理24h的Lovo细胞超微结构观察，细胞核染色质固缩，聚集于核膜下，呈块状或新月形小体，可见凋亡小体。核内出现透明区，核仁消失。出现空泡变性，细胞器减少，细胞尚保持结构、胞膜外可见大量的微绒毛，发生扩展并断裂。
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3 DNA组方图和光散射图谱分析结果 对照组DNA组方图呈典型的肿瘤细胞G0/1、S、G2+M峰型，姜黄素20μM处理24h后，G0/1期前出现明显的亚G1峰，凋亡率为32.6%；而处理48h后，未见明显亚G1峰(图3)。在光散射图谱上处理组前向光散射(FS)均低于对照组，提示经姜黄素处理细胞体积缩小(图4)。
4 DNA凝胶电泳结果 姜黄素20μM处理24h，显示DNA凋亡梯形条带，对照组则为正常细胞基因组条带，坏死细胞呈均匀膜状条带(图5)。
图3 FCM测定DNA组方图
, 百拇医药
图4 FCM测定光散射图
A：坏死 B：正常 C：舒林酸 D：姜黄素 E：小鼠胸腺
图5 DNA凝胶电泳
讨论
细胞凋亡(apoptosis)是细胞按自身的程序进行的一种自杀性主动死亡，故细胞凋亡又称编程性细胞死亡(programmed cell death,PCD)。目前姜黄素作为一种抗癌药尚处于临床前试验阶段[6]。我们采用口丫啶橙荧光染色、透射电镜观察、流式细胞仪测定、琼脂糖凝胶电泳研究了姜黄素体外诱导大肠癌细胞凋亡的作用。结果发现姜黄素经20μM姜黄素作用24h，即可诱导Lovo细胞出现凋亡。口丫啶橙染色可见较多细胞核或细胞质内含有致密浓染的黄绿色荧光的细胞，甚至可见黄绿色碎片，细胞体积缩小。流式细胞仪检测出现明显的“亚G1峰”，凋亡率为32.6%，并出现低前向光散射，提示细胞皱缩，发生凋亡。DNA电泳出现凋亡梯形条带。透射电镜观察细胞变圆、变小、核仁消失，染色质浓缩、断裂，聚集于细胞核周边，呈新月形，胞浆浓缩，胞浆中出现较多的空泡，可见凋亡小体。而作用48h后，流式细胞仪检测未出现明显的“亚G1峰”，可能与凋亡细胞染色质进一步降解，细胞裂解死亡有关。
, 百拇医药
以往研究发现姜黄素可抑制细胞蛋白激酶C和酪氨酸蛋白激酶的活性[7，8]，目前认为细胞凋亡的过程受到来自细胞内、外诸多信号的调控[9]，蛋白激酶C对细胞凋亡具有一定的调控作用，其激活物佛波酯可抑制某些特定条件下的细胞凋亡，用蛋白激酶C的抑制剂，如Polymixin、H-7和神经鞘氨醇则可以抵消佛波酯的上述作用；酪氨酸蛋白激酶所介导的信号系统对细胞凋亡起着重要的负调控作用，此信号传导途径被阻断可诱导某些细胞的凋亡。然而，姜黄素诱导肿瘤细胞凋亡的确切机理有待进一步研究。
作者简介：陈宏，男，31岁。1991年第三军大学预防系本科毕业，1997年第一军医大学消化内科硕士毕业，目前在该校攻读消化内科博士学位。
参考文献
[1] Rao CV,Rivenson A,Simi B,et al.Chemoprevention of colon carcinogenesis by dietary curcumin, a Naturally Occurring plant phenoloc compound.Cancer Res.,1995,55:259
, http://www.100md.com
[2] Kuttan R,Bhanumathy P,Nirmala K,et al.Potential anticancer activity of turmeric(curcuma longa).Cancer Lett.,1985,2:197
[3] 杨骅，王仙平，郁琳琳，等.榄香烯抗癌作用与诱发肿瘤细胞凋亡.中华肿瘤杂志，1996，3：169
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[5] 姜泊，张亚历，周殿元.分子生物学常用实验方法.北京：人民军医出版社，1996.174
, 百拇医药
[6] 陈宏，张振书.姜黄的药理作用研究概况.国外医学中医中药分册，1996，6：3
[7] Liu JY,Lin SJ,Lin JK.Inhitibory effects of curcumin on protein kinase C activity induced by 12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate in NIH 3T3 cells.Carcinogenesis.1993,5:857
[8] Rao CV,Simi B,Reddy BS.Inhibition by dietary curcumin of azoxymethane-induced ornithine decarboxylase,tyrosine protein kinase,arachidonic acid metabolism and aberrant crypt foci formationin the rat colon.Carcinogenesis (Lond.),1993,14:2219
[9] 傅涛，徐永华.细胞凋亡的信号转导研究进展.细胞生物学杂志，1996，4：153
(收稿日期 1998—04—14 修回日期 1998—10—20), 百拇医药