抗癌方对HepG2人肝癌细胞株P53蛋白表达的影响
作者：周小舟 郭振球
单位：周小舟 郭振球(深圳市医院 深圳518033)
关键词：抗癌方；P53蛋白；HepG2
摘 要 目的 观察抗癌方对HepG2人肝癌细胞株P53蛋白表达的影响 摘 要 目的 观察抗癌方对HepG2人肝癌细胞株P53蛋白表达的影响，以探讨其抗癌作用机理。方法 采用MTT法分析抗癌方对人肝癌细胞株HepG2细胞生长的影响。结果 抗癌方能明显抑制HepG2的生长，对HepG2细胞的半数生长的抑制剂量(IC50)为1mg/ml。 LSAB方法观察发现抗癌方能诱导HepG2细胞株从相当弱到非常强的比较致密的细胞核染色，且低浓度(0.1mg/ml)P53蛋白表达诱导作用强于高浓度(1mg/ml),几乎将近50%的细胞出现P53蛋白高表达。提示：抗癌方诱导HepG2P53蛋白高达表，可能为其杀伤HepG2细胞株、诱导其凋亡的机制之一。
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The Expression of P53 Protein of HepG2 Cell lines Induced by Anticancer Agent
Zhou Xiaozhou,Guo zhen
(Hepatopathy Institute,Shen Zhen Hospital of Traditional Chinese Medicine,Shen Zhen 518033)
Abstract:Anti-cancer agent is KonXianling,compound pharmacentics from the Chinese medicinal herb which was shown to exhibit activity of treatment hepatic fibrosis of schistosomiasis japonica in human and murine.In this paper,the mechanisms of antitumor activity and apotosis induced by the agent are reported.The in vitro effect of the agent on the growth of HepG2 cells was evaluated by MTT assay.The IC50 of HepG2 cells induced by the agent was 1mg/ml when HepG2 exposed for the agent,～50% of the nucler stained with an intensity that varied from relatively weak to very strong expression of P53 protein.These results indicate that induction of expression of P53 protein contributes to the mechanisms for antitumor activity and apoptosis induced by anti-cancer agent.
, 百拇医药
Key words Anti-cancer agent P53 Protein HepG2
最近的资料推测，对受放射和化学治疗药物DNA损伤细胞的DNA合成和复制的抑制(即抑制基因缺损的累积)，抑癌基因P53起着关键的作用，相反，P53基因缺损的细胞，仅仅部分被阻抑，且含有DNA损伤未被有效修复的细胞继续分裂和增殖[1-2]。另外，有些研究已显示，野生型P53被要求有效地执行受DNA毒性抗癌剂和碘放射治疗的某些细胞类型的程序性细胞死亡[3]。这些观察结果产生了几种假说。首先，因已获得突变或P53其它缺损的肿瘤细胞参与细胞选择过程。因而允许DNA受损的细胞回避野生型P53生长抑制作用。其次，P53缺损的细胞将增加对细胞杀伤和细胞生长抑制作用的化学治疗剂的耐药性。
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抗癌方，原名抗纤灵，系治疗血吸虫病肝纤维化的有效中药制剂[4]。本研究观察其对HepG2人肝癌细胞株P53蛋白表达的影响。以探讨其抑制HepG2细胞生长和诱导细胞凋亡的作用机理。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 中药抗癌方：由黄芪、汉防已、莪术、桃仁等组成，按常规方法浓缩成10%的煎液，过滤、杀菌，4℃保存备用。
1.1.2 TritonX-100：packard公司产品。
1.1.3 一抗，鼠抗人的P53单克隆抗体，工作浓度为1∶50，Dako公司产品。
, 百拇医药 1.1.4 二抗，生物素标记的羊抗鼠抗体，工作浓度为1∶100，Dako公司产品。
1.1.5 细胞株及培养条件：HepG2细胞株(由广州第一军医大学消化内科刘思德博士赠送)，接种于含10%的特级小牛血清(杭州四季青生物工程和材料研究所产品)，100u/ml青霉素及100μg/ml链霉素的RPMI1640(GIBCO公司产品)培养液中，置37℃、50%CO2培养箱内培养传代。
1.2 方法
1.2.1 细胞毒作用观察(即IC50测定)：采用噻唑蓝还原法[5](MTT法，MTT系Sigma产品)。
1.2.2 P53蛋白表达：采用LSAB法[6]
, http://www.100md.com
取对数生长期细胞按1×106接种于30ml培养瓶中，6h后换液，加中药制剂(0.1mg/ml、1mg/ml)，另设5-Fu(7.5μg/ml)和完全培养液作对照，处理48h后收集细胞，Hanks液洗，离心(400g,10min),去上清，取细胞悬液50μl滴于0.01%多聚赖氨酸处理后的玻片上，室温干燥，纯丙酮固定(4℃，30min);0.05% TritonX-100的PBS液渗透5min；5%羊血清PBS液封闭，37℃，20min;加一抗，37℃，60min；加二抗，37℃，30min;加链霉菌抗生物素蛋白——过氧化物酶溶液，37℃，30min;0.03%H2O2的DAB显色，清水冲洗10min；苏木素复染，常规封片，显微镜下观察。
2 结果
2.1 抗癌方对HepG2细胞毒作用：抗癌方处理HepG272h后，能明显抑制细胞的生长，细胞杀伤率明显随药物浓度增加而增加，对HepG272hIC50为1mg/ml。而5-Fu浓度为75μg/ml时，其细胞杀伤率为75%。
, 百拇医药
2.2 抗癌方诱导HepG2细胞株P53蛋白表达：显微镜下可见，未用药物处理的HepG2细胞株，细胞核很少有阳性染色，而且染色部位大多分散在细胞浆内(图1)，当HepG2细胞株用抗癌方(图2)及化疗药物5-Fu处理48h后，可见从相当弱到非常强的比较致密的细胞核染色，且抗癌方低浓度(0.1mg/ml)P53蛋白表达诱导作用强于高浓度(1mg/ml)，几乎将近50%的细胞出现P53蛋白高表达。
图1 未用药处理的HepG2细胞株，细胞核很少有阳性染色。×400
, 百拇医药
图2 HepG2细胞株经中药抗癌方处理48小时后，可见非常强的比较致密的细胞核染色。×400
3 讨论
DNA损伤剂，如紫外线照射、X线和化学治疗药物等，能增加正常到恶变细胞的野生型P53蛋白水平，而野生型P53，通过正常G1或G2检测点调控机制阻止DNA损伤复制起着重要的作用[1-2]。相反，带有突变或其它缺损的P53蛋白细胞，将缺乏一种或更多的野生型P53的正常功能，包括与G1或G2检测点调控和由于化学治疗或其它细胞应激反应出现DNA损伤后的细胞周期的继续。不能有效地修复损伤的DNA将可能导致潜在的致命的基因变异和细胞死亡的产生。另外一种支持上述推测的研究显示，具有高水平野生型P53蛋白、CODP耐药的人类卵巢癌细胞株，当转染突变型P53后，对CDDP细胞毒作用的敏感性明显增加[7]。因此，提示，野生型P53是允许正常和恶变细胞幸免于由各种因素引起DNA损伤的关键防护机制部分。
, 百拇医药
然而，其它的一些报道，在头颈部肿瘤细胞和结肠癌细胞没有检测到的P53 突变状态和放射敏感性的关系[8]。而且Burkitt's淋巴细胞放射抗性的出现是由于具有正常诱导DNA损伤后G1阻滞和刺激死亡的功能型、野生型P53缺失引起[9]。因而，这些资料支持了另外一种推测，即拥有突变型P53的细胞较带有野生型P53的细胞更可能幸免于DNA损害。因此，前者将简单地累积更多的DNA损害和(或)不承受经过凋亡机制而产生的正常清除。显然，肿瘤细胞对DNA损伤剂的生物反应，仅仅部分地依赖P53突变状态。现在的模式推测，DNA损伤后的细胞将通过几种可能途径的任何一种，而继续生长复制。因而，依靠特殊的细胞种类，P53基因的突变，将对化学药物敏感或抗性有利。
HepG2细胞株，为具有野生型P53的人肝癌细胞系[10]，我们的资料支持野生型P53在DNA受损后对细胞的生长抑制和诱导其凋亡中起重要作用，即抗癌方和5-Fu 均诱导野生型P53蛋白高表达，其中抗癌方低浓度即可诱导P53蛋白高表达。5—Fu，属尿嘧啶类似物，是一种通过几种途径既抑制RNA合成，又抑制DAN合成的抗代谢药物。受损伤的细胞，当P53蛋白表达量增高到一定程度后，可以使细胞停止在G1期至凋亡。抗癌方诱导HepG2P53蛋白高表达，可能为其杀伤HepG2细胞株、诱导细胞凋亡(资料待发表)的机制之一。
, 百拇医药
作者简介：周小舟，女，34岁，博士。研究方向：肝纤维化—肝硬化—肝癌变的中医诊治研究。
参考文献
[1] Kastan, M.B., Ongekwere, O., Sidransky, D., Vogelstein, B.and Craig, R.W., Participation of P53 protein in the cellular response to DNA damage. Cancer Res, 1991，51:6304～11
[2] Loganzo, F., Jr., Nabeya, Y., Maslak, p.and Albino, A.p. , Stabilization of P53 protein is a critical response of UV radiation in human melanocytes:implicatons for melanoma development. Mol. cell. Diff., 1994， 2:23～43
, 百拇医药
[3] Lowe, S.W., Ruley, H. E., Jacks, T.and Housman, D.E. P53-dependent apoptosis modulates the cytotoxicity of anticancer agents, cell, 1993,74:957～67
[4] 郭振球，袁肇凯，杨运高，等.抗纤灵治疗血吸虫病肝纤维化的临床与实验研究.中药新药与临床药理，1996,7(3)：3～6
[5] Mosmann T:Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:Application to proliferation and cytotoxity assay. J Immunal methods, 1983,65:55
[6] Hsu S.M., Raine, l. and Fanger, H., A comparative study of the peroxidase-antiperoxidase method and an avidin-biotin complex method for studying polypeptide hornmones with radio immunoassay anti-bodies. Amer. J. clin. pathol. 1981，75:734～8
, 百拇医药
[7] Brown, R., Clugston; C., Burns, P., et al. Increased accumulation of P53 protein in cisplatin-resistant ovarian cell lines. Int. J.cancer, 1993，53:678～84
[8] Slichenmyer, W. J., Nelson, W. G., Slebos, R.J., et al. Loss of a P53-associated G1 check point does not decrease cell survival following DNA damage. Cancer Res. 1993，53:4164～8
[9] O'connor, P.M., Jackman,J., Jondle, D., et al. Role of P53 tumor suppressor gene in cell cycle arrest and radiosensitivity of Burkittis lymphoma cell lines. Cancer Res. 1993，53:4776～80
[10] Y.S. Carol Shieh, Chau Nguyen, Maria V., et al. Tumor-suppressor P53 gene in hepatitis C and B virus-associated human hepatocellular carcinoma. Int J Cancer, 1993, 54:558～62
(收稿日期 1998—08—20 修回日期 1998—12—03), 百拇医药
单位：周小舟 郭振球(深圳市医院 深圳518033)
关键词：抗癌方；P53蛋白；HepG2
摘 要 目的 观察抗癌方对HepG2人肝癌细胞株P53蛋白表达的影响 摘 要 目的 观察抗癌方对HepG2人肝癌细胞株P53蛋白表达的影响，以探讨其抗癌作用机理。方法 采用MTT法分析抗癌方对人肝癌细胞株HepG2细胞生长的影响。结果 抗癌方能明显抑制HepG2的生长，对HepG2细胞的半数生长的抑制剂量(IC50)为1mg/ml。 LSAB方法观察发现抗癌方能诱导HepG2细胞株从相当弱到非常强的比较致密的细胞核染色，且低浓度(0.1mg/ml)P53蛋白表达诱导作用强于高浓度(1mg/ml),几乎将近50%的细胞出现P53蛋白高表达。提示：抗癌方诱导HepG2P53蛋白高达表，可能为其杀伤HepG2细胞株、诱导其凋亡的机制之一。
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The Expression of P53 Protein of HepG2 Cell lines Induced by Anticancer Agent
Zhou Xiaozhou,Guo zhen
(Hepatopathy Institute,Shen Zhen Hospital of Traditional Chinese Medicine,Shen Zhen 518033)
Abstract:Anti-cancer agent is KonXianling,compound pharmacentics from the Chinese medicinal herb which was shown to exhibit activity of treatment hepatic fibrosis of schistosomiasis japonica in human and murine.In this paper,the mechanisms of antitumor activity and apotosis induced by the agent are reported.The in vitro effect of the agent on the growth of HepG2 cells was evaluated by MTT assay.The IC50 of HepG2 cells induced by the agent was 1mg/ml when HepG2 exposed for the agent,～50% of the nucler stained with an intensity that varied from relatively weak to very strong expression of P53 protein.These results indicate that induction of expression of P53 protein contributes to the mechanisms for antitumor activity and apoptosis induced by anti-cancer agent.
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Key words Anti-cancer agent P53 Protein HepG2
最近的资料推测，对受放射和化学治疗药物DNA损伤细胞的DNA合成和复制的抑制(即抑制基因缺损的累积)，抑癌基因P53起着关键的作用，相反，P53基因缺损的细胞，仅仅部分被阻抑，且含有DNA损伤未被有效修复的细胞继续分裂和增殖[1-2]。另外，有些研究已显示，野生型P53被要求有效地执行受DNA毒性抗癌剂和碘放射治疗的某些细胞类型的程序性细胞死亡[3]。这些观察结果产生了几种假说。首先，因已获得突变或P53其它缺损的肿瘤细胞参与细胞选择过程。因而允许DNA受损的细胞回避野生型P53生长抑制作用。其次，P53缺损的细胞将增加对细胞杀伤和细胞生长抑制作用的化学治疗剂的耐药性。
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抗癌方，原名抗纤灵，系治疗血吸虫病肝纤维化的有效中药制剂[4]。本研究观察其对HepG2人肝癌细胞株P53蛋白表达的影响。以探讨其抑制HepG2细胞生长和诱导细胞凋亡的作用机理。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 中药抗癌方：由黄芪、汉防已、莪术、桃仁等组成，按常规方法浓缩成10%的煎液，过滤、杀菌，4℃保存备用。
1.1.2 TritonX-100：packard公司产品。
1.1.3 一抗，鼠抗人的P53单克隆抗体，工作浓度为1∶50，Dako公司产品。
, 百拇医药 1.1.4 二抗，生物素标记的羊抗鼠抗体，工作浓度为1∶100，Dako公司产品。
1.1.5 细胞株及培养条件：HepG2细胞株(由广州第一军医大学消化内科刘思德博士赠送)，接种于含10%的特级小牛血清(杭州四季青生物工程和材料研究所产品)，100u/ml青霉素及100μg/ml链霉素的RPMI1640(GIBCO公司产品)培养液中，置37℃、50%CO2培养箱内培养传代。
1.2 方法
1.2.1 细胞毒作用观察(即IC50测定)：采用噻唑蓝还原法[5](MTT法，MTT系Sigma产品)。
1.2.2 P53蛋白表达：采用LSAB法[6]
, http://www.100md.com
取对数生长期细胞按1×106接种于30ml培养瓶中，6h后换液，加中药制剂(0.1mg/ml、1mg/ml)，另设5-Fu(7.5μg/ml)和完全培养液作对照，处理48h后收集细胞，Hanks液洗，离心(400g,10min),去上清，取细胞悬液50μl滴于0.01%多聚赖氨酸处理后的玻片上，室温干燥，纯丙酮固定(4℃，30min);0.05% TritonX-100的PBS液渗透5min；5%羊血清PBS液封闭，37℃，20min;加一抗，37℃，60min；加二抗，37℃，30min;加链霉菌抗生物素蛋白——过氧化物酶溶液，37℃，30min;0.03%H2O2的DAB显色，清水冲洗10min；苏木素复染，常规封片，显微镜下观察。
2 结果
2.1 抗癌方对HepG2细胞毒作用：抗癌方处理HepG272h后，能明显抑制细胞的生长，细胞杀伤率明显随药物浓度增加而增加，对HepG272hIC50为1mg/ml。而5-Fu浓度为75μg/ml时，其细胞杀伤率为75%。
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2.2 抗癌方诱导HepG2细胞株P53蛋白表达：显微镜下可见，未用药物处理的HepG2细胞株，细胞核很少有阳性染色，而且染色部位大多分散在细胞浆内(图1)，当HepG2细胞株用抗癌方(图2)及化疗药物5-Fu处理48h后，可见从相当弱到非常强的比较致密的细胞核染色，且抗癌方低浓度(0.1mg/ml)P53蛋白表达诱导作用强于高浓度(1mg/ml)，几乎将近50%的细胞出现P53蛋白高表达。
图1 未用药处理的HepG2细胞株，细胞核很少有阳性染色。×400
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图2 HepG2细胞株经中药抗癌方处理48小时后，可见非常强的比较致密的细胞核染色。×400
3 讨论
DNA损伤剂，如紫外线照射、X线和化学治疗药物等，能增加正常到恶变细胞的野生型P53蛋白水平，而野生型P53，通过正常G1或G2检测点调控机制阻止DNA损伤复制起着重要的作用[1-2]。相反，带有突变或其它缺损的P53蛋白细胞，将缺乏一种或更多的野生型P53的正常功能，包括与G1或G2检测点调控和由于化学治疗或其它细胞应激反应出现DNA损伤后的细胞周期的继续。不能有效地修复损伤的DNA将可能导致潜在的致命的基因变异和细胞死亡的产生。另外一种支持上述推测的研究显示，具有高水平野生型P53蛋白、CODP耐药的人类卵巢癌细胞株，当转染突变型P53后，对CDDP细胞毒作用的敏感性明显增加[7]。因此，提示，野生型P53是允许正常和恶变细胞幸免于由各种因素引起DNA损伤的关键防护机制部分。
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然而，其它的一些报道，在头颈部肿瘤细胞和结肠癌细胞没有检测到的P53 突变状态和放射敏感性的关系[8]。而且Burkitt's淋巴细胞放射抗性的出现是由于具有正常诱导DNA损伤后G1阻滞和刺激死亡的功能型、野生型P53缺失引起[9]。因而，这些资料支持了另外一种推测，即拥有突变型P53的细胞较带有野生型P53的细胞更可能幸免于DNA损害。因此，前者将简单地累积更多的DNA损害和(或)不承受经过凋亡机制而产生的正常清除。显然，肿瘤细胞对DNA损伤剂的生物反应，仅仅部分地依赖P53突变状态。现在的模式推测，DNA损伤后的细胞将通过几种可能途径的任何一种，而继续生长复制。因而，依靠特殊的细胞种类，P53基因的突变，将对化学药物敏感或抗性有利。
HepG2细胞株，为具有野生型P53的人肝癌细胞系[10]，我们的资料支持野生型P53在DNA受损后对细胞的生长抑制和诱导其凋亡中起重要作用，即抗癌方和5-Fu 均诱导野生型P53蛋白高表达，其中抗癌方低浓度即可诱导P53蛋白高表达。5—Fu，属尿嘧啶类似物，是一种通过几种途径既抑制RNA合成，又抑制DAN合成的抗代谢药物。受损伤的细胞，当P53蛋白表达量增高到一定程度后，可以使细胞停止在G1期至凋亡。抗癌方诱导HepG2P53蛋白高表达，可能为其杀伤HepG2细胞株、诱导细胞凋亡(资料待发表)的机制之一。
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作者简介：周小舟，女，34岁，博士。研究方向：肝纤维化—肝硬化—肝癌变的中医诊治研究。
参考文献
[1] Kastan, M.B., Ongekwere, O., Sidransky, D., Vogelstein, B.and Craig, R.W., Participation of P53 protein in the cellular response to DNA damage. Cancer Res, 1991，51:6304～11
[2] Loganzo, F., Jr., Nabeya, Y., Maslak, p.and Albino, A.p. , Stabilization of P53 protein is a critical response of UV radiation in human melanocytes:implicatons for melanoma development. Mol. cell. Diff., 1994， 2:23～43
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[3] Lowe, S.W., Ruley, H. E., Jacks, T.and Housman, D.E. P53-dependent apoptosis modulates the cytotoxicity of anticancer agents, cell, 1993,74:957～67
[4] 郭振球，袁肇凯，杨运高，等.抗纤灵治疗血吸虫病肝纤维化的临床与实验研究.中药新药与临床药理，1996,7(3)：3～6
[5] Mosmann T:Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:Application to proliferation and cytotoxity assay. J Immunal methods, 1983,65:55
[6] Hsu S.M., Raine, l. and Fanger, H., A comparative study of the peroxidase-antiperoxidase method and an avidin-biotin complex method for studying polypeptide hornmones with radio immunoassay anti-bodies. Amer. J. clin. pathol. 1981，75:734～8
, 百拇医药
[7] Brown, R., Clugston; C., Burns, P., et al. Increased accumulation of P53 protein in cisplatin-resistant ovarian cell lines. Int. J.cancer, 1993，53:678～84
[8] Slichenmyer, W. J., Nelson, W. G., Slebos, R.J., et al. Loss of a P53-associated G1 check point does not decrease cell survival following DNA damage. Cancer Res. 1993，53:4164～8
[9] O'connor, P.M., Jackman,J., Jondle, D., et al. Role of P53 tumor suppressor gene in cell cycle arrest and radiosensitivity of Burkittis lymphoma cell lines. Cancer Res. 1993，53:4776～80
[10] Y.S. Carol Shieh, Chau Nguyen, Maria V., et al. Tumor-suppressor P53 gene in hepatitis C and B virus-associated human hepatocellular carcinoma. Int J Cancer, 1993, 54:558～62
(收稿日期 1998—08—20 修回日期 1998—12—03), 百拇医药