Leflunomide对异种肾移植(豚鼠／大白鼠)超急排斥反应的抑制效果
作者：王熹 闵志廉 朱有华 王亚伟 齐隽
单位：第二军医大学长征医院肾移植中心(上海，200003)
关键词：肾移植；豚鼠/大白鼠；Leflunomide
肾脏病与透析肾移植杂志990308
摘 要 目的：观察Leflunomide对异种肾移植超急排斥反应的抑制效果。方法：用已经建立的异种异位肾移植超急排斥反应模型。术前1，3，5，7天开始分别给5组受鼠口服Leflunomide 10mg/(kg.d)。观察超急排斥反应发生的时间。结果：术前服药时间少于3天的受鼠，其超急排斥反应发生的时间与对照组相比无明显变化；术前服药5天和7天的受鼠，移植肾的持续泌尿时间分别为9.58±2.09min和27.25±7.63min，显著长于对照组。结论：Leflunomide作为免疫抑制剂，在异种(豚鼠→大白鼠)肾移植实验研究中，可推迟、但不能消除异种超急排斥反应。
, http://www.100md.com
EFFECT OF LEFLUNOMIDE ON XENOGENEIC HYPERACUTE REACTION IN THE IN VIVO MODEL OF GUINEA PIG-TO-RAT RENAL XENOTRANSPLANTATION
Wang Xi, Min Zhilian, Zhu Youhua, Wang Yawei, Qi Jun
(Urological Center of PLA, Changzheng Hospital, Second Military Medical University of PLA, Shanghai, 200003)
OBJECTIVE To study the effect of Luflunomide on xenogeneic hyperacute rejections(XHR).
, 百拇医药
METHODOLOGY With the established in vivo model of ginea pig-to-rat kidney transplantation, Leflunomide prepared daily in normal saline, was given to 5 groups of recipient rats by gastric instillation at the dosage of 10mg/(kg.day) for 0, 1, 3, 5, 7 days before operation.
RESULTS The groups taken Leflunomide less than 3 days showed no differences in uresis time after renal xenografts. But in the two groups taken Leflunomide for 5 and 7 days the uresis time lasted for 9.58±2.09 minutes and 27.25±7.63 minutes respectively, which were significantly prolonged as compared to the other groups.
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CONCLUSION These results suggested that Leflunomide, as an humoral immune responsive agent,can postpone, but not prevent XHR in a single drug regime.
Key words kidney xenotransplantation Leflunomide
Leflunomide(HWA486，RS34821)是近年来由德国Hoechest药厂合成的新型免疫抑制剂。属于异恶唑类衍生物。在许多自身免疫性疾病的动物模型上。可抑制病情的进展[1]。不仅可抑制体内T细胞的活性[2]，更主要的是直接下调体液免疫反应，抑制抗体的产生。我们用已建立的豚鼠→大白鼠异种肾移植模型，观察了其对异种移植超急排斥反应的抑制效果，现报告如下。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 实验动物、药品试剂和仪器 雄性SD大鼠，体重约250g(上海市计划生育研究所)；豚鼠43只，雌雄不限，体重约250g(第二军医大学实验动物中心)；Leflunomide(Hoechest药厂，德国)；HCA离体肾保存液(上海市中心血站)；显微外科手术器械(上海市医疗器械研究所)；手术显微镜(GX-SS，22-3，上海医用光学仪器厂)；医用显微外科缝合线(上海医用缝合线厂)。
1.2 异种肾移植手术 豚鼠为供鼠，SD大鼠为受鼠，具体操作同文献[3]。
1.3 动物分组及用药 分为对照组及用药组A、B、C、D四组。对照组15只仅给生理盐水1ml/d，不用药。用药组将Leflunomide用生理盐水配成混合物，用前摇匀，以10mg/(kg.d)体重由胃管给药。A组16只，术前1天开始用药；B组14只，术前3天开始用药；C组16只，术前5天开始用药；D组17只，术前7天开始用药。
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1.4 结果判断 以移植肾脏接通血流后泌尿的持续时间为肾功能的观测指标。以肾脏明显变紫、静脉回流塌陷或停止泌尿1h以上为发生超急排斥反应。此时切除移植肾，10%福尔马林固定，石蜡包埋切片，HE染色，行病理检查。
1.5 统计学分析 根据Student统计学方法，测定结果以均数±标准差(
±s)表示。两种资料的比较用方差分析检验。以P<0.05为差异显著，P<0.01为差异非常显著。
2 结果
实验组A，B和对照组相比，移植肾的泌尿时间均较短且尿量较少，6min左右时即出现明显的变紫、回流静脉塌陷及停止泌尿，统计学上差异亦不显著，见附表
附表 Leflunomide抑制异种肾移植超急排斥反应的效果 分组
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n
用药天数
移植肾泌尿时间(min)
P值
对照组
15
0
6.58±0.64
实验组A
16
1
6.82±0.88
>0.05*
, 百拇医药
实验组B
14
3
6.75±1.06
>0.05*
实验组C
16
5
9.58±2.09
<0.01*
实验组D
17
, http://www.100md.com 7
27.25±7.63
<0.01*
*vs对照组
用药5天后再手术，则泌尿持续时间明显延长，平均达9.58±2.09min，与对照组相比差异显著；用药7天后，以泌尿时间为监测指标则可发现超急排斥反应的时间进一步推迟，已达27.25±7.63min，与对照组差异非常显著。但各组均未能完全避免超急排斥反应的发生。切除的移植肾行病理检查，可发现典型的超急排斥反应征象：间质水肿，肾小球浊肿，中性白细胞浸润，小血管内血栓形成。
3 讨论
异种器官移植走向成功的关键是克服体液免疫介导的超急排斥反应。以猪/人异种移植为例，猪血管内皮细胞表面糖蛋白或糖脂末端的α-1，3半乳糖基(α-1，3Gal)是被人体天然抗体识别并激活补体而引发超急排斥反应的主要位点。其主要成分为IgM及IgG，占体内抗体总量的1%，产生这些抗体的B细胞亦占B细胞总数的1%[4]。这种抗体介导的超急排斥反应在异种器官接通血流后的数分钟至数小时内即可造成移植物不可逆性损害。
, 百拇医药
Leflunomide抑制抗体的产生是非特异性的，它只是减少抗体的产生，并不能消除体内已存在的抗体[5，6]。在单独使用时是否会对异种肾移植的超急排斥反应有所抑制，尚未见报道。我们采用了安全有效的剂量10mg/(kg.d)，并于术前1，3，5，7天给药，观察了Leflunomide的效果。从实验结果可知：术前1～3天用药基本无效；术前5～7天用药仅可推迟超急排斥反应发生的时间，但仍不能避免其发生。这与文献中关于Leflunomide的作用机制的报道相吻合，即：Leflunomide抑制的是核酸的从头合成途径，阻止的是B细胞增殖周期中的一个关键步骤。抑制DNA合成过程中的一个关键酶——二氢乳清酸脱氢酶(DHODH)的活性可以使细胞内的核苷酸消耗怠尽，终止DNA和RNA的生物合成，使细胞无法进入S期，最终不能增殖[7]。另外，Leflunomide还可抑制促使细胞活化的信号传导，如作为酪氨酸激酶的抑制物，抑制表皮生长因子和IL-2，以此抑制B细胞增殖[8]。介导异种超急排斥反应的天然抗体主要为IgM，其半衰期为5.1天，术前5～7天用药，可以显著降低体内IgM水平，我们的实验结果也间接证实了这一点。Leflunomide也抑制T细胞的免疫活性，抑制抗原或有丝分裂原刺激下的T细胞的生长，并呈剂量依赖性。Leflunomide允许T细胞活化，但不能进入细胞增殖周期，T细胞被阻止在S期前，这一点与B细胞被阻止于S期颇相似。对于T细胞，Leflunomide在较小剂量时可抑制其增殖，但不影响IL-2R的表达；较大剂量、特别是毒性剂量时，细胞的增殖和IL-2R的表达均可被抑制[9]。Leflunomide还可抑制由IL-1，IL-6，TNFα及GM-CSF刺激引起的细胞增殖反应[10]。这些均可降低B细胞的免疫应答功能，影响抗体的产生，从而抑制体液免疫，延缓异种移植超急排斥反应的发生。
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异种器官移植超急排斥反应多在异种移植物接通血流后的数分钟至数小时内发生。除了已知的天然抗体起主要作用外，体外实验也发现T细胞及NK细胞均参与了排斥反应[11]。细胞免疫的作用可能尚未显露出来，移植物即已被体液免疫介导的破坏作用所摧毁。因此，我们制定了术前单一给药的原则，以检测其对异种超急排斥反应的抑制效果。发现：Leflunomide对超急排斥反应有一定的抑制作用，但不能避免其发生。目前对异种移植超急排斥反应机制的认识尚未完善，Leflunomide的作用机制也有待进一步研究和认识。本实验结果提示：对异种移植超急排斥反应，若使用Leflunomide，应考虑结合其它免疫抑制剂或疗法。
参考文献
1 Batrlett RR，Dimitrijevic M，Mattar T et al.Leflunomide(HWA486)，a novel immunomodulating compound for the treatment of autoimmune disorders and reactions leading to transplantation rejection.Agents Action，1991，32：10
, 百拇医药
2 Chong AS，Gebel H，Finnegan A et al.Leflunomide，a novel immunpmodulatory agent：in vitro analyses of the mechanism of immunosuppression.Transplant Proc.1993，25：747
3 王熹，赵明，邱实等.异种、异位肾移植超急排斥反应模型的初步探讨.肾脏病与透析肾移植杂志，1999，(8)1：90
4 Galili U，Anaraki F，Thall A et al.One percent of human circulation B lymphocytes are capable of producing the natural anti-Gal antibody.Blood，1993，82：2485
5 Morris RE，Huang X，Cao W et al.Leflunomide(HWA486)and its analogue suppress T-and B-cell proliferation in vitro，acute rejection，ongoingrejection，and antidonor antibody synthesis in mouse，rat，and cynomolgus monkey transplant recipients as well as arterial intimal thickening after balloon catheter injury.Transplant Proc，1995，27：445
, 百拇医药
6 Morris RE，Huang X，Gregory CR et al.Studies in experimental models of chronic rejection：use of rapamycin(sirolimus)and isoxazole derivatives(Leflunomide and analogue)for the suppression of gratf vascular disease and obliterative bronchiolitis.Transplant Proc，1995，27：2068
7 Greene S，Watanabe K，Braatz-Trulson J et al. Inhibirion of dihydrooratate dehydrogenase by the immunosuppressive agent Leflunomide.Biochem Pharmacol，1995，50：861
, 百拇医药
8 Xu X，Williams JW，Bremer EG et al.Inhibition of protien tyrosine phosphorylation in T cells by a novel immunosuppressive agent，Leflunomide.J Biol Chem，1995，270：12398
9 Lang R，Wagner H，Heeg K.Differential effects of the immunosuppresive agents cyclosporine and leflunomide in vivo.Transplantation，1995，59：382
10 Ju DW，Zheng QY，Wang HB et al.Leflunomide inhibits cytokine induced DNA synthesis of rabbit synovial cells in culture.Chung Kuo Yao Li Hsueh Pao，1994，15：223
11 Matsumiya G，Shirakura R，Miyagawa S et al.Inhibitory effect of the complement receptor-specific monoclonal antibody on the induced antibody response and the role of CD4+ and CD8+ T-cells in the rat to mouse xenotransplantation.Transplant Proc，1993，25：405
(1998-11-19收稿，1999-02-15修回), 百拇医药
单位：第二军医大学长征医院肾移植中心(上海，200003)
关键词：肾移植；豚鼠/大白鼠；Leflunomide
肾脏病与透析肾移植杂志990308
摘 要 目的：观察Leflunomide对异种肾移植超急排斥反应的抑制效果。方法：用已经建立的异种异位肾移植超急排斥反应模型。术前1，3，5，7天开始分别给5组受鼠口服Leflunomide 10mg/(kg.d)。观察超急排斥反应发生的时间。结果：术前服药时间少于3天的受鼠，其超急排斥反应发生的时间与对照组相比无明显变化；术前服药5天和7天的受鼠，移植肾的持续泌尿时间分别为9.58±2.09min和27.25±7.63min，显著长于对照组。结论：Leflunomide作为免疫抑制剂，在异种(豚鼠→大白鼠)肾移植实验研究中，可推迟、但不能消除异种超急排斥反应。
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EFFECT OF LEFLUNOMIDE ON XENOGENEIC HYPERACUTE REACTION IN THE IN VIVO MODEL OF GUINEA PIG-TO-RAT RENAL XENOTRANSPLANTATION
Wang Xi, Min Zhilian, Zhu Youhua, Wang Yawei, Qi Jun
(Urological Center of PLA, Changzheng Hospital, Second Military Medical University of PLA, Shanghai, 200003)
OBJECTIVE To study the effect of Luflunomide on xenogeneic hyperacute rejections(XHR).
, 百拇医药
METHODOLOGY With the established in vivo model of ginea pig-to-rat kidney transplantation, Leflunomide prepared daily in normal saline, was given to 5 groups of recipient rats by gastric instillation at the dosage of 10mg/(kg.day) for 0, 1, 3, 5, 7 days before operation.
RESULTS The groups taken Leflunomide less than 3 days showed no differences in uresis time after renal xenografts. But in the two groups taken Leflunomide for 5 and 7 days the uresis time lasted for 9.58±2.09 minutes and 27.25±7.63 minutes respectively, which were significantly prolonged as compared to the other groups.
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CONCLUSION These results suggested that Leflunomide, as an humoral immune responsive agent,can postpone, but not prevent XHR in a single drug regime.
Key words kidney xenotransplantation Leflunomide
Leflunomide(HWA486，RS34821)是近年来由德国Hoechest药厂合成的新型免疫抑制剂。属于异恶唑类衍生物。在许多自身免疫性疾病的动物模型上。可抑制病情的进展[1]。不仅可抑制体内T细胞的活性[2]，更主要的是直接下调体液免疫反应，抑制抗体的产生。我们用已建立的豚鼠→大白鼠异种肾移植模型，观察了其对异种移植超急排斥反应的抑制效果，现报告如下。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 实验动物、药品试剂和仪器 雄性SD大鼠，体重约250g(上海市计划生育研究所)；豚鼠43只，雌雄不限，体重约250g(第二军医大学实验动物中心)；Leflunomide(Hoechest药厂，德国)；HCA离体肾保存液(上海市中心血站)；显微外科手术器械(上海市医疗器械研究所)；手术显微镜(GX-SS，22-3，上海医用光学仪器厂)；医用显微外科缝合线(上海医用缝合线厂)。
1.2 异种肾移植手术 豚鼠为供鼠，SD大鼠为受鼠，具体操作同文献[3]。
1.3 动物分组及用药 分为对照组及用药组A、B、C、D四组。对照组15只仅给生理盐水1ml/d，不用药。用药组将Leflunomide用生理盐水配成混合物，用前摇匀，以10mg/(kg.d)体重由胃管给药。A组16只，术前1天开始用药；B组14只，术前3天开始用药；C组16只，术前5天开始用药；D组17只，术前7天开始用药。
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1.4 结果判断 以移植肾脏接通血流后泌尿的持续时间为肾功能的观测指标。以肾脏明显变紫、静脉回流塌陷或停止泌尿1h以上为发生超急排斥反应。此时切除移植肾，10%福尔马林固定，石蜡包埋切片，HE染色，行病理检查。
1.5 统计学分析 根据Student统计学方法，测定结果以均数±标准差(
±s)表示。两种资料的比较用方差分析检验。以P<0.05为差异显著，P<0.01为差异非常显著。2 结果
实验组A，B和对照组相比，移植肾的泌尿时间均较短且尿量较少，6min左右时即出现明显的变紫、回流静脉塌陷及停止泌尿，统计学上差异亦不显著，见附表
附表 Leflunomide抑制异种肾移植超急排斥反应的效果 分组
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n
用药天数
移植肾泌尿时间(min)
P值
对照组
15
0
6.58±0.64
实验组A
16
1
6.82±0.88
>0.05*
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实验组B
14
3
6.75±1.06
>0.05*
实验组C
16
5
9.58±2.09
<0.01*
实验组D
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27.25±7.63
<0.01*
*vs对照组
用药5天后再手术，则泌尿持续时间明显延长，平均达9.58±2.09min，与对照组相比差异显著；用药7天后，以泌尿时间为监测指标则可发现超急排斥反应的时间进一步推迟，已达27.25±7.63min，与对照组差异非常显著。但各组均未能完全避免超急排斥反应的发生。切除的移植肾行病理检查，可发现典型的超急排斥反应征象：间质水肿，肾小球浊肿，中性白细胞浸润，小血管内血栓形成。
3 讨论
异种器官移植走向成功的关键是克服体液免疫介导的超急排斥反应。以猪/人异种移植为例，猪血管内皮细胞表面糖蛋白或糖脂末端的α-1，3半乳糖基(α-1，3Gal)是被人体天然抗体识别并激活补体而引发超急排斥反应的主要位点。其主要成分为IgM及IgG，占体内抗体总量的1%，产生这些抗体的B细胞亦占B细胞总数的1%[4]。这种抗体介导的超急排斥反应在异种器官接通血流后的数分钟至数小时内即可造成移植物不可逆性损害。
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Leflunomide抑制抗体的产生是非特异性的，它只是减少抗体的产生，并不能消除体内已存在的抗体[5，6]。在单独使用时是否会对异种肾移植的超急排斥反应有所抑制，尚未见报道。我们采用了安全有效的剂量10mg/(kg.d)，并于术前1，3，5，7天给药，观察了Leflunomide的效果。从实验结果可知：术前1～3天用药基本无效；术前5～7天用药仅可推迟超急排斥反应发生的时间，但仍不能避免其发生。这与文献中关于Leflunomide的作用机制的报道相吻合，即：Leflunomide抑制的是核酸的从头合成途径，阻止的是B细胞增殖周期中的一个关键步骤。抑制DNA合成过程中的一个关键酶——二氢乳清酸脱氢酶(DHODH)的活性可以使细胞内的核苷酸消耗怠尽，终止DNA和RNA的生物合成，使细胞无法进入S期，最终不能增殖[7]。另外，Leflunomide还可抑制促使细胞活化的信号传导，如作为酪氨酸激酶的抑制物，抑制表皮生长因子和IL-2，以此抑制B细胞增殖[8]。介导异种超急排斥反应的天然抗体主要为IgM，其半衰期为5.1天，术前5～7天用药，可以显著降低体内IgM水平，我们的实验结果也间接证实了这一点。Leflunomide也抑制T细胞的免疫活性，抑制抗原或有丝分裂原刺激下的T细胞的生长，并呈剂量依赖性。Leflunomide允许T细胞活化，但不能进入细胞增殖周期，T细胞被阻止在S期前，这一点与B细胞被阻止于S期颇相似。对于T细胞，Leflunomide在较小剂量时可抑制其增殖，但不影响IL-2R的表达；较大剂量、特别是毒性剂量时，细胞的增殖和IL-2R的表达均可被抑制[9]。Leflunomide还可抑制由IL-1，IL-6，TNFα及GM-CSF刺激引起的细胞增殖反应[10]。这些均可降低B细胞的免疫应答功能，影响抗体的产生，从而抑制体液免疫，延缓异种移植超急排斥反应的发生。
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异种器官移植超急排斥反应多在异种移植物接通血流后的数分钟至数小时内发生。除了已知的天然抗体起主要作用外，体外实验也发现T细胞及NK细胞均参与了排斥反应[11]。细胞免疫的作用可能尚未显露出来，移植物即已被体液免疫介导的破坏作用所摧毁。因此，我们制定了术前单一给药的原则，以检测其对异种超急排斥反应的抑制效果。发现：Leflunomide对超急排斥反应有一定的抑制作用，但不能避免其发生。目前对异种移植超急排斥反应机制的认识尚未完善，Leflunomide的作用机制也有待进一步研究和认识。本实验结果提示：对异种移植超急排斥反应，若使用Leflunomide，应考虑结合其它免疫抑制剂或疗法。
参考文献
1 Batrlett RR，Dimitrijevic M，Mattar T et al.Leflunomide(HWA486)，a novel immunomodulating compound for the treatment of autoimmune disorders and reactions leading to transplantation rejection.Agents Action，1991，32：10
, 百拇医药
2 Chong AS，Gebel H，Finnegan A et al.Leflunomide，a novel immunpmodulatory agent：in vitro analyses of the mechanism of immunosuppression.Transplant Proc.1993，25：747
3 王熹，赵明，邱实等.异种、异位肾移植超急排斥反应模型的初步探讨.肾脏病与透析肾移植杂志，1999，(8)1：90
4 Galili U，Anaraki F，Thall A et al.One percent of human circulation B lymphocytes are capable of producing the natural anti-Gal antibody.Blood，1993，82：2485
5 Morris RE，Huang X，Cao W et al.Leflunomide(HWA486)and its analogue suppress T-and B-cell proliferation in vitro，acute rejection，ongoingrejection，and antidonor antibody synthesis in mouse，rat，and cynomolgus monkey transplant recipients as well as arterial intimal thickening after balloon catheter injury.Transplant Proc，1995，27：445
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6 Morris RE，Huang X，Gregory CR et al.Studies in experimental models of chronic rejection：use of rapamycin(sirolimus)and isoxazole derivatives(Leflunomide and analogue)for the suppression of gratf vascular disease and obliterative bronchiolitis.Transplant Proc，1995，27：2068
7 Greene S，Watanabe K，Braatz-Trulson J et al. Inhibirion of dihydrooratate dehydrogenase by the immunosuppressive agent Leflunomide.Biochem Pharmacol，1995，50：861
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8 Xu X，Williams JW，Bremer EG et al.Inhibition of protien tyrosine phosphorylation in T cells by a novel immunosuppressive agent，Leflunomide.J Biol Chem，1995，270：12398
9 Lang R，Wagner H，Heeg K.Differential effects of the immunosuppresive agents cyclosporine and leflunomide in vivo.Transplantation，1995，59：382
10 Ju DW，Zheng QY，Wang HB et al.Leflunomide inhibits cytokine induced DNA synthesis of rabbit synovial cells in culture.Chung Kuo Yao Li Hsueh Pao，1994，15：223
11 Matsumiya G，Shirakura R，Miyagawa S et al.Inhibitory effect of the complement receptor-specific monoclonal antibody on the induced antibody response and the role of CD4+ and CD8+ T-cells in the rat to mouse xenotransplantation.Transplant Proc，1993，25：405
(1998-11-19收稿，1999-02-15修回), 百拇医药