载脂蛋白E对血脂代谢的调节作用
作者：朱铁兵 杨志健 杨 兵 贾永平 马根山 孔祥清 曹克将 张馥敏 马文珠
单位：南京医科大学第一附属医院心脏科 邮政编码：210029
关键词：载脂蛋白类 血浆 脂蛋白类 多聚酶链反应
江苏医药990410 摘要 应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析法，测定131例健康正常人和131例冠心病患者的载脂蛋白E(ApoE)基因型，并分析该基因对两组受试者的血浆血脂、脂蛋白水平的影响。结果显示ApoE等位基因对血脂具有显著的调节作用，ApoE4等位基因具有升高总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的作用；而ApoE2等位基因则有相反的作用，ApoE4平均升高TC约0.32～0.58mmol/L；ApoE2平均降低TC约0.34～0.61mmol/L，提示ApoE等位基因导致个体间血脂水平的明显差异。
, 百拇医药
载脂蛋白E ApoE是一种多态性蛋白质，由一个基因位点的三个等位基因所编码。三种异构体(E2、E3、E4)的受体结合活性及自身代谢速率存在明显的差异，可能导致个体间血脂水平的差异，并与高脂血症和冠心病发生可能有关[1]。因此，用简便的方法检测人群中ApoE等位基因，探讨其对血脂、脂蛋白水平的影响，具有重要的临床意义。
对象与方法
一、对象：
我院1992年～1997年住院存活的本市心肌梗塞病人(均经心电图和心肌酶谱检查，符合1981年制定全国诊断标准)101例，经皮冠状动脉造影证实的冠心病人30例；按1∶1与本市某企业及同期来院体检的性别相同，年龄相差不超过2岁，无慢性肝、肾、肿瘤及其他疾病的正常健康人131例作配对对照。两组样本的吸烟程度无差别。
, 百拇医药
二、方法：
1、血脂及脂蛋白测定：TC、甘油三酯(TG)酶法测定，HDL-C采用磷钨酸镁沉淀法。
2、ApoE基因型的分析：(1)外周血白细胞DNA提取：酚氯法。(2)ApoE基因扩增：引物1：5′-TAAGCTTGGCACGGCTGTCCAAG-GA-3′，2：5′-ACAGAATTCGCCCCGGCCTG-GTACAC-3′各50ρmol/L，dNTPS 0.2mmol/L(包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP)，1×Buffer缓冲液、DNA1μg，Taq DNA多聚酶2U配成50μl的反应体系。按下列条件进行扩增：95℃预变性10分钟，95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min30Sec，30循环周期，最后72℃延伸10分钟。反应结束后，用2%琼脂糖鉴定PCR产物是否是244bp，如是取10μl的产物加10U的核酸内切酶HhaI在37℃条件下消化4小时。(3)聚丙烯酰胺凝胶电泳分析ApoE的基因型：将消化的PCR产物全部上样，凝胶浓度8%，玻板长25cm，宽20cm，厚度5mm，采用50mA恒流电泳3小时。
, 百拇医药
3、统计方法：不同ApoE等位基因的脂质水平差异用方差分析，两者间比较用t检验。
结果
一、ApoE基因型鉴定方法：根据酶切片段不同而将ApoE各种基因型鉴别分开。E3/3有91、48bp，E4/3有91、72、48bp，E4/4有72、48bp、E3/2有91、83、48bp，E2/2有91、93bp，E4/2有91、83、72、48bp。
二、ApoE各等位基因对脂质、脂蛋白的关系：三种不同ApoE等位基因间TC、LDL-C有明显差别，依次为E4>E3>E2，组间TG关系为E2>E3，E2>E4，未发现E4、E3之间的差别。冠心病组分析结果基本相同，但未发现组间TG的差别，可能与冠心病病人经过了调脂治疗有关，见表1。
, http://www.100md.com
三、ApoE等位基因对血浆TC、LDL-C水平的平均作用：参照Sing和Davignon于1985年提出的有关ApoE等位基因对血脂水平的平均作用计算公式，与E3相比，E4等位基因具有升高血浆TC、LDL-C的作用，而ApoE2则有降低TC、LDL-C的水平的作用，见表2。
表1 健康人ApoE等位基因对脂质参数的影响
E2
E3
E4
E2/2
E3/2
E3/3
, 百拇医药
E4/4
E4/3
n＝1
n＝15
n＝98
n＝3
n＝14
TC
4.17±0.38*
4.81±0.45
5.46±0.31*
LDL-C
, 百拇医药
2.29±0.45*
2.85±0.54
3.56±0.43*
TG
1.86±0.95*
1.05±0.85
1.03±0.69*
HDL-C
1.50±0.42
1.48±0.37
1.52±0.61
, 百拇医药
与E3相比 *P<0.05表2 健康人ApoE等位基因对TC、LDL-C的平均作用
TC(mmol/L)
LDL-C(mmol/L)
E2
-0.34～0.61
-0.38～0.59
E4
+0.32～0.58
+0.29～0.54
讨论
, 百拇医药 人类ApoE基因定位于19号染色体。已知有3个等位基因E2、E3、E4构成人群中的6种ApoE基因型，分别编码出6种不同ApoE表型。
Utermann等首先观察到正常人群中E2等位基因携带者(即ApoE2/2和ApoE3/2)血浆TC、LDL-C水平明显低于ApoE3/3者。随后Sing等报告正常人群ApoE4携带者(即ApoE4/4和ApoE3/4)血浆TC、LDL-C水平明显高于ApoE3/3者。大量的人群流行病学研究证实上述结果的正确性。Davignon和Sing等基于一些研究结果，提出了ApoE某一等位基因对TC、LDL-C的平均作用计算公式，他们发现，与E3相比，E4升TC、LDL-C约10～20mg/dL，降TC、LDL-C约5～10mg/dL。目前尚未发现其他等位基因对人群血脂水平的如此调节作用。本文资料亦显示与上述相同的结果。有关ApoE等位基因对TG的代谢调节虽不一致，但目前多数观点认为E2携带者TG血浆水平较高。
, 百拇医药
ApoE等位基因对个体的血脂调节可能与各ApoE异构体的受体结合活性和自身体内代谢速率明显差异有关[2]。已知乳糜微粒(CM)残体和极低密度脂蛋白(VLDL)均利用ApoE作为连接物与ApoE或ApoBE(LDL受体)受体结合，参与体内的脂质代谢，而且中间密度脂蛋白(IDL)向LDL转化时必须有ApoE参与。有人发现纯合子E2/2不论其体内血浆TC的浓度如何，其体外受体活性都只是E3/3的1%～2%。E2的自身代谢速率缓慢，而E4在体内代谢速率较E3增快，这样E4与受体结合活性相对较E3高。由于E2受体结合功能低下，引起CM和VLDL残粒分解代谢延缓，造成这些残粒在体内蓄积，同时IDL向LDL转化减少，结果是细胞内游离TC含量减少，反馈性调节肝细胞表面的ApoBE受体，受体上调后加速了LDL分解代谢，使血浆LDL浓度下降。如果没有其他可引起血浆脂质升高的遗传和环境因素，ApoE2则使TG水平的增高，而血浆TC水平降低[3]。与此相反，E4与受体结合能力相对较强，其结果是血浆CM和VLDL残粒浓度减少，而在正常情况下CM和VLDL已是很低，因而E4对其影响难以察觉。结果ApoE4净效应是造成血浆TC浓度升高，而对TG的影响不大。
, 百拇医药
ApoE异构体还可能通过影响HDL对TC的逆向转运而影响机体对膳食TC的摄取[4]。存在空腹血浆HDL中的ApoE，在餐后大部分转移到CM和VLDL中，使后者能通过肝脏识别和摄取。在HDL中，ApoE和ApoAⅡ通过二硫键形式结合，这涉及到ApoE中半胱氨酸(CYS)的有无和多少。E4不含CYS，因而与ApoA Ⅱ结合疏松，其转移穿梭速度最快，机体对TC的吸收亦就最快。
本文观察对象的血浆TC和TG水平偏低，基本上反映中国人的血脂平均水平。在这种血脂水平偏低的人群，同样观察到ApoE基因对个体血脂水平有影响，主要表现为ApoE4等位基因能升高TC、LDL-C水平。这些作用可能表明E4与冠心病有一定的关联[5]。
参考文献
[1] Wilson PW, et al. Arterioscler Throm Vasc Biol 1996；10(1)：48.
[2] Nestrack AC, et al. Metabolism 1993；42：743.
[3] Dsepres JP, et al. Diabetes 1995；42：1474.
[4] Miettinen TA, et al. Arterioscler Thormb 1994；11：1303.
[5] Peter WF, et al. JAMA 1994；272：1666.
(1998年8月10日收稿 同年11月2日修回), http://www.100md.com
单位：南京医科大学第一附属医院心脏科 邮政编码：210029
关键词：载脂蛋白类 血浆 脂蛋白类 多聚酶链反应
江苏医药990410 摘要 应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析法，测定131例健康正常人和131例冠心病患者的载脂蛋白E(ApoE)基因型，并分析该基因对两组受试者的血浆血脂、脂蛋白水平的影响。结果显示ApoE等位基因对血脂具有显著的调节作用，ApoE4等位基因具有升高总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的作用；而ApoE2等位基因则有相反的作用，ApoE4平均升高TC约0.32～0.58mmol/L；ApoE2平均降低TC约0.34～0.61mmol/L，提示ApoE等位基因导致个体间血脂水平的明显差异。
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载脂蛋白E ApoE是一种多态性蛋白质，由一个基因位点的三个等位基因所编码。三种异构体(E2、E3、E4)的受体结合活性及自身代谢速率存在明显的差异，可能导致个体间血脂水平的差异，并与高脂血症和冠心病发生可能有关[1]。因此，用简便的方法检测人群中ApoE等位基因，探讨其对血脂、脂蛋白水平的影响，具有重要的临床意义。
对象与方法
一、对象：
我院1992年～1997年住院存活的本市心肌梗塞病人(均经心电图和心肌酶谱检查，符合1981年制定全国诊断标准)101例，经皮冠状动脉造影证实的冠心病人30例；按1∶1与本市某企业及同期来院体检的性别相同，年龄相差不超过2岁，无慢性肝、肾、肿瘤及其他疾病的正常健康人131例作配对对照。两组样本的吸烟程度无差别。
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二、方法：
1、血脂及脂蛋白测定：TC、甘油三酯(TG)酶法测定，HDL-C采用磷钨酸镁沉淀法。
2、ApoE基因型的分析：(1)外周血白细胞DNA提取：酚氯法。(2)ApoE基因扩增：引物1：5′-TAAGCTTGGCACGGCTGTCCAAG-GA-3′，2：5′-ACAGAATTCGCCCCGGCCTG-GTACAC-3′各50ρmol/L，dNTPS 0.2mmol/L(包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP)，1×Buffer缓冲液、DNA1μg，Taq DNA多聚酶2U配成50μl的反应体系。按下列条件进行扩增：95℃预变性10分钟，95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min30Sec，30循环周期，最后72℃延伸10分钟。反应结束后，用2%琼脂糖鉴定PCR产物是否是244bp，如是取10μl的产物加10U的核酸内切酶HhaI在37℃条件下消化4小时。(3)聚丙烯酰胺凝胶电泳分析ApoE的基因型：将消化的PCR产物全部上样，凝胶浓度8%，玻板长25cm，宽20cm，厚度5mm，采用50mA恒流电泳3小时。
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3、统计方法：不同ApoE等位基因的脂质水平差异用方差分析，两者间比较用t检验。
结果
一、ApoE基因型鉴定方法：根据酶切片段不同而将ApoE各种基因型鉴别分开。E3/3有91、48bp，E4/3有91、72、48bp，E4/4有72、48bp、E3/2有91、83、48bp，E2/2有91、93bp，E4/2有91、83、72、48bp。
二、ApoE各等位基因对脂质、脂蛋白的关系：三种不同ApoE等位基因间TC、LDL-C有明显差别，依次为E4>E3>E2，组间TG关系为E2>E3，E2>E4，未发现E4、E3之间的差别。冠心病组分析结果基本相同，但未发现组间TG的差别，可能与冠心病病人经过了调脂治疗有关，见表1。
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三、ApoE等位基因对血浆TC、LDL-C水平的平均作用：参照Sing和Davignon于1985年提出的有关ApoE等位基因对血脂水平的平均作用计算公式，与E3相比，E4等位基因具有升高血浆TC、LDL-C的作用，而ApoE2则有降低TC、LDL-C的水平的作用，见表2。
表1 健康人ApoE等位基因对脂质参数的影响
E2
E3
E4
E2/2
E3/2
E3/3
, 百拇医药
E4/4
E4/3
n＝1
n＝15
n＝98
n＝3
n＝14
TC
4.17±0.38*
4.81±0.45
5.46±0.31*
LDL-C
, 百拇医药
2.29±0.45*
2.85±0.54
3.56±0.43*
TG
1.86±0.95*
1.05±0.85
1.03±0.69*
HDL-C
1.50±0.42
1.48±0.37
1.52±0.61
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与E3相比 *P<0.05表2 健康人ApoE等位基因对TC、LDL-C的平均作用
TC(mmol/L)
LDL-C(mmol/L)
E2
-0.34～0.61
-0.38～0.59
E4
+0.32～0.58
+0.29～0.54
讨论
, 百拇医药 人类ApoE基因定位于19号染色体。已知有3个等位基因E2、E3、E4构成人群中的6种ApoE基因型，分别编码出6种不同ApoE表型。
Utermann等首先观察到正常人群中E2等位基因携带者(即ApoE2/2和ApoE3/2)血浆TC、LDL-C水平明显低于ApoE3/3者。随后Sing等报告正常人群ApoE4携带者(即ApoE4/4和ApoE3/4)血浆TC、LDL-C水平明显高于ApoE3/3者。大量的人群流行病学研究证实上述结果的正确性。Davignon和Sing等基于一些研究结果，提出了ApoE某一等位基因对TC、LDL-C的平均作用计算公式，他们发现，与E3相比，E4升TC、LDL-C约10～20mg/dL，降TC、LDL-C约5～10mg/dL。目前尚未发现其他等位基因对人群血脂水平的如此调节作用。本文资料亦显示与上述相同的结果。有关ApoE等位基因对TG的代谢调节虽不一致，但目前多数观点认为E2携带者TG血浆水平较高。
, 百拇医药
ApoE等位基因对个体的血脂调节可能与各ApoE异构体的受体结合活性和自身体内代谢速率明显差异有关[2]。已知乳糜微粒(CM)残体和极低密度脂蛋白(VLDL)均利用ApoE作为连接物与ApoE或ApoBE(LDL受体)受体结合，参与体内的脂质代谢，而且中间密度脂蛋白(IDL)向LDL转化时必须有ApoE参与。有人发现纯合子E2/2不论其体内血浆TC的浓度如何，其体外受体活性都只是E3/3的1%～2%。E2的自身代谢速率缓慢，而E4在体内代谢速率较E3增快，这样E4与受体结合活性相对较E3高。由于E2受体结合功能低下，引起CM和VLDL残粒分解代谢延缓，造成这些残粒在体内蓄积，同时IDL向LDL转化减少，结果是细胞内游离TC含量减少，反馈性调节肝细胞表面的ApoBE受体，受体上调后加速了LDL分解代谢，使血浆LDL浓度下降。如果没有其他可引起血浆脂质升高的遗传和环境因素，ApoE2则使TG水平的增高，而血浆TC水平降低[3]。与此相反，E4与受体结合能力相对较强，其结果是血浆CM和VLDL残粒浓度减少，而在正常情况下CM和VLDL已是很低，因而E4对其影响难以察觉。结果ApoE4净效应是造成血浆TC浓度升高，而对TG的影响不大。
, 百拇医药
ApoE异构体还可能通过影响HDL对TC的逆向转运而影响机体对膳食TC的摄取[4]。存在空腹血浆HDL中的ApoE，在餐后大部分转移到CM和VLDL中，使后者能通过肝脏识别和摄取。在HDL中，ApoE和ApoAⅡ通过二硫键形式结合，这涉及到ApoE中半胱氨酸(CYS)的有无和多少。E4不含CYS，因而与ApoA Ⅱ结合疏松，其转移穿梭速度最快，机体对TC的吸收亦就最快。
本文观察对象的血浆TC和TG水平偏低，基本上反映中国人的血脂平均水平。在这种血脂水平偏低的人群，同样观察到ApoE基因对个体血脂水平有影响，主要表现为ApoE4等位基因能升高TC、LDL-C水平。这些作用可能表明E4与冠心病有一定的关联[5]。
参考文献
[1] Wilson PW, et al. Arterioscler Throm Vasc Biol 1996；10(1)：48.
[2] Nestrack AC, et al. Metabolism 1993；42：743.
[3] Dsepres JP, et al. Diabetes 1995；42：1474.
[4] Miettinen TA, et al. Arterioscler Thormb 1994；11：1303.
[5] Peter WF, et al. JAMA 1994；272：1666.
(1998年8月10日收稿 同年11月2日修回), http://www.100md.com