心肌细胞缺氧时肌浆网钙泵活力变化及药物作用*
作者：祝宝华 张寄南 马文珠 杨国平
单位：祝宝华 现在扬州市第一人民医院(225001)；张寄南 马文珠 杨国平 南京医科大学第一附属医院 邮政编码：210029
关键词：心肌细胞 肌浆网 钙ATP酶 缺氧
江苏医药990406 摘要 用培养乳鼠心肌细胞加代谢抑制剂Retenone制成心肌缺氧模型，心肌细胞缺氧50分钟时肌浆网上钙泵活力明显下降，心肌细胞搏动频率下降(P<0.01)。加入L-型钙通道拮抗剂Lacidipine使肌浆网钙泵活力上升，心肌细胞搏动频率增加(P<0.05)。提示心肌细胞缺氧 时肌浆网钙泵功能下降可能是心肌细胞缺氧损伤的重要因素。
心肌缺血时细胞内游离钙浓度升高，而心肌缺血细胞内钙超载是心肌细胞从可逆性损伤到不可逆性损伤的关键[1]。文献报道肌浆网钙泵(钙ATP酶)是 心肌细胞内游离钙浓度调节的重要因素[2]。为观察心肌缺血时胞内游离钙浓度的变化原因，我们用代谢抑制剂Retenone来抑制心肌细胞线粒体呼吸链的代谢，模拟出心肌细胞缺氧模型，观察缺氧心肌细胞肌浆网钙泵活力改变，并探讨钙拮抗剂乐息平(Lacidipine)的作用及机制。
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材料与方法
一、乳鼠心肌细胞的制备：取出生后1～4天的SD大鼠乳鼠。在无菌条件下取出心脏，去除残血，将心室肌剪成1～2mm3小块，加0.06%胰蛋白酶反复消化4～5次。分离的细胞置于含有10%胎牛血清及90%DMEM培养基的100ml培养瓶中，在5%CO2孵箱中培养90分钟按时差法去除已贴壁的成纤维细胞和其它杂质，将细胞悬液接种于培养皿中，接种密度5×106个/ml，在CO2孵箱中培养72小时备用。实验结束时将各组心肌细胞用Scraper收集，在20mM Hepes(pH7.2)、2mM EDTA、250mM蔗糖匀浆缓冲液中制备心肌细胞匀浆。
二、乳鼠心肌细胞缺氧模型的制备及分组：在培养3～5天的乳鼠心肌细胞培养皿中加入16μM Retenone培养50分钟，制成心肌缺氧模型，并分成(1)单纯缺氧组；(2)正常对照组；(3)缺氧+20μM 息乐平治疗组。
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三、心肌搏动频率的测量及胎盼兰染色计数：心肌细胞培养3天后彼此相接触形成细胞簇，细胞的自发性搏动逐渐形成同步搏动，心肌细胞经倒置显微镜放大后，选择一细胞簇计数每分钟搏动次数。在部分心肌细胞培养皿中加0.1%胎盼兰染色5分钟内计算100个细胞中的染色细胞数。
四、心肌细胞肌浆网钙ATP酶测定：用Larsen法[3]加以改进，心肌细胞匀浆中加20mM Hepes(pH7.4)，1mM MgCl2，1mM EGTA，0.01‰TritonX-100，100mM KCl，0.8mM CaCl2，37℃预温10分钟，再加10mM p-NPP37℃反应30分钟，410nm波长处比色。
五、动物及试剂：胰蛋白酶为进口分装，Retenone、p-nitrophenol phosphate(p-NPP，P-硝苯基磷酸)、EGTA、TritonX-100及DEME培养基为Sigma公司产品，乐息平为Glaxo Wellcome公司产品，小牛血清由上海动物血清制品所出品。SD大鼠乳鼠由南医大动物中心提供。
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六、统计学处理：数据表示用
±s，组间比较用F检验，两组间比较用q检验。
结果
一、培养乳鼠心肌细胞特征：原代培养2～3天后可观察到心肌细胞出现自发性搏动。5天后收缩呈同步化，细胞呈放射状或条索状排列。自发性搏动频率为40～60次/分，具有温度依赖性。心肌细胞占总培养细胞的70%～90%。
二、培养乳鼠心肌细胞在缺氧及药物作用下心肌细胞特征及肌浆网钙泵功能变化：在缺氧后50分钟可见培养乳鼠心肌细胞搏动频率下降(20±8次/分)，部分心肌细胞处于无搏动状态。胎盼兰染色可见<5%心肌细胞染色。给20μM息乐平后心肌细胞搏动频率上升(40±5次/分)，胎盼兰染色见心肌细胞染色数<5%。乳鼠心肌细胞在缺氧时肌浆网钙泵功能较正常组下降(2.76±0.41μmol.g.pro-1.min-1 vs1.26±0.58μmol.g.pro-1.min-1，P<0.01)；心肌细胞缺氧同时加20μM息乐平较单纯缺氧组心肌细胞肌浆网钙泵活力显著上升(1.26±0.58μmol.g.pro-1.min vs1.97±0.81μmol.g.pro-1.min-1，P<0.05)。
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讨论
体外培养的心肌细胞仍基本上保持在体时各种生理代谢功能，如兴奋、收缩、自发搏动等，同时避免了整体条件下神经、体液因素对心肌细胞的影响。因此，用培养的心肌细胞可比较精确地分析各种独立因素对心肌细胞的作用。用代谢抑制剂Retenone来模拟心肌细胞缺血模型，其能直接抑制心肌细胞的呼吸链，因而避免了其它心肌缺氧模型所产生的不完全性缺氧，以及代谢产物的严重堆积，且更重要的是此模型具有类似心肌缺血模型的特点[4]。
心肌缺血时细胞内钙失衡是心肌细胞损伤的中心环节，文献报道培养乳鼠心肌细胞在缺氧时胞内钙浓度升高，50分钟时细胞内钙超载已经产生而肌浆网钙释放通道尚保持释放钙的功能[5]，故本实验选择了代谢抑制剂Retenone作用时间为50分钟。本结果提示缺氧50分钟时心肌细胞搏动降低，但尚未见细胞膜破损明显增加(因缺氧前后心肌细胞胎盼兰染色无变化)，与文献报道心肌细胞缺氧60分钟时胞内钙浓度升高并非由于细胞膜破损所致细胞外钙流入、亦非通过细胞膜电压依赖性通道或Na+/Ca2+交换相一致[5]。因此，肌浆网钙泵对缺氧时钙超载可能起非常关键作用。因肌浆网钙泵对胞浆内钙的转运过程与p-NPP水解相偶连，因而可用p-NPP酶法来测定心肌细胞匀浆肌浆网钙泵活力，且利用心肌匀浆测定肌浆网钙泵活力避免了提纯肌浆网过程所造成的钙泵蛋白的丢失和活力的下降[3]。
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本实验结果表明心肌细胞在缺氧时肌浆网钙泵功能较正常组下降(P<0.01)。提示肌浆网钙泵活力的下降可能是细胞内游离钙浓度的升高、继而产生钙超载损伤的重要原因。钙泵活力下降的可能机制[4，6]：(1)心肌细胞缺氧时胞内pH值下降。当给予Retenone抑制线粒体氧化磷酸化时可导致细胞内酸中毒，而当pH从7.0下降至6.4时肌浆网钙ATP酶活力下降50%。(2)心肌细胞缺氧时ATP含量下降。由于ATP含量下降，腺苷酸减少、肌酸磷酸激酶代谢受限，从而导致肌浆网钙ATP酶活力下降。同时本结果表明：20μM乐息平可使肌浆网钙ATP酶活力显著上升(P<0.05)，这种上升可能使缺血心肌细胞内游离钙浓度上升得到缓解，减轻了钙超载所致的心肌细胞损伤。乐息平为细胞膜L-型钙通道拮抗剂，其使缺血心肌细胞内肌浆钙泵活力上升的原因：(1)细胞膜L-型钙通道参与钙诱导的钙释放机制(Ca2+induced Ca2+release)有关[7]。(2)乐息平参与维持心肌细胞内能量和底物的供给，使可利用的能量呈ATP形式，减少了ATP的降解和丢失[8]。
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*本课题由江苏省自然科学基金资助(编号BK97171)
参考文献
[1] Biordillon PD, et al. Circ Res 1982；50：360.
[2] 祝宝华，等.国外医学心血管分册 1997；24(2)：3.
[3] Larsen JS, et al. Basic Res Cardiol 1995；90：323.
[4] Hol CM, et al. Circ Res 192；70：716.
[5] Barrigon SJ, et al. Mol Cell Cardiol 1996；28：1329.
[6] Franson R, et al. Am J Phsiol 1986；251：H1017.
[7] Rannon F, et al. J Mol Cell Cardiol 1995；27：1225.
[8] Buser PT, et al. J Cardiovas Pharm 1991；18(Suppl)：S87.
(1998年5月28日收稿 同年8月25日修回), 百拇医药
单位：祝宝华 现在扬州市第一人民医院(225001)；张寄南 马文珠 杨国平 南京医科大学第一附属医院 邮政编码：210029
关键词：心肌细胞 肌浆网 钙ATP酶 缺氧
江苏医药990406 摘要 用培养乳鼠心肌细胞加代谢抑制剂Retenone制成心肌缺氧模型，心肌细胞缺氧50分钟时肌浆网上钙泵活力明显下降，心肌细胞搏动频率下降(P<0.01)。加入L-型钙通道拮抗剂Lacidipine使肌浆网钙泵活力上升，心肌细胞搏动频率增加(P<0.05)。提示心肌细胞缺氧 时肌浆网钙泵功能下降可能是心肌细胞缺氧损伤的重要因素。
心肌缺血时细胞内游离钙浓度升高，而心肌缺血细胞内钙超载是心肌细胞从可逆性损伤到不可逆性损伤的关键[1]。文献报道肌浆网钙泵(钙ATP酶)是 心肌细胞内游离钙浓度调节的重要因素[2]。为观察心肌缺血时胞内游离钙浓度的变化原因，我们用代谢抑制剂Retenone来抑制心肌细胞线粒体呼吸链的代谢，模拟出心肌细胞缺氧模型，观察缺氧心肌细胞肌浆网钙泵活力改变，并探讨钙拮抗剂乐息平(Lacidipine)的作用及机制。
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材料与方法
一、乳鼠心肌细胞的制备：取出生后1～4天的SD大鼠乳鼠。在无菌条件下取出心脏，去除残血，将心室肌剪成1～2mm3小块，加0.06%胰蛋白酶反复消化4～5次。分离的细胞置于含有10%胎牛血清及90%DMEM培养基的100ml培养瓶中，在5%CO2孵箱中培养90分钟按时差法去除已贴壁的成纤维细胞和其它杂质，将细胞悬液接种于培养皿中，接种密度5×106个/ml，在CO2孵箱中培养72小时备用。实验结束时将各组心肌细胞用Scraper收集，在20mM Hepes(pH7.2)、2mM EDTA、250mM蔗糖匀浆缓冲液中制备心肌细胞匀浆。
二、乳鼠心肌细胞缺氧模型的制备及分组：在培养3～5天的乳鼠心肌细胞培养皿中加入16μM Retenone培养50分钟，制成心肌缺氧模型，并分成(1)单纯缺氧组；(2)正常对照组；(3)缺氧+20μM 息乐平治疗组。
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三、心肌搏动频率的测量及胎盼兰染色计数：心肌细胞培养3天后彼此相接触形成细胞簇，细胞的自发性搏动逐渐形成同步搏动，心肌细胞经倒置显微镜放大后，选择一细胞簇计数每分钟搏动次数。在部分心肌细胞培养皿中加0.1%胎盼兰染色5分钟内计算100个细胞中的染色细胞数。
四、心肌细胞肌浆网钙ATP酶测定：用Larsen法[3]加以改进，心肌细胞匀浆中加20mM Hepes(pH7.4)，1mM MgCl2，1mM EGTA，0.01‰TritonX-100，100mM KCl，0.8mM CaCl2，37℃预温10分钟，再加10mM p-NPP37℃反应30分钟，410nm波长处比色。
五、动物及试剂：胰蛋白酶为进口分装，Retenone、p-nitrophenol phosphate(p-NPP，P-硝苯基磷酸)、EGTA、TritonX-100及DEME培养基为Sigma公司产品，乐息平为Glaxo Wellcome公司产品，小牛血清由上海动物血清制品所出品。SD大鼠乳鼠由南医大动物中心提供。
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六、统计学处理：数据表示用
±s，组间比较用F检验，两组间比较用q检验。结果
一、培养乳鼠心肌细胞特征：原代培养2～3天后可观察到心肌细胞出现自发性搏动。5天后收缩呈同步化，细胞呈放射状或条索状排列。自发性搏动频率为40～60次/分，具有温度依赖性。心肌细胞占总培养细胞的70%～90%。
二、培养乳鼠心肌细胞在缺氧及药物作用下心肌细胞特征及肌浆网钙泵功能变化：在缺氧后50分钟可见培养乳鼠心肌细胞搏动频率下降(20±8次/分)，部分心肌细胞处于无搏动状态。胎盼兰染色可见<5%心肌细胞染色。给20μM息乐平后心肌细胞搏动频率上升(40±5次/分)，胎盼兰染色见心肌细胞染色数<5%。乳鼠心肌细胞在缺氧时肌浆网钙泵功能较正常组下降(2.76±0.41μmol.g.pro-1.min-1 vs1.26±0.58μmol.g.pro-1.min-1，P<0.01)；心肌细胞缺氧同时加20μM息乐平较单纯缺氧组心肌细胞肌浆网钙泵活力显著上升(1.26±0.58μmol.g.pro-1.min vs1.97±0.81μmol.g.pro-1.min-1，P<0.05)。
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讨论
体外培养的心肌细胞仍基本上保持在体时各种生理代谢功能，如兴奋、收缩、自发搏动等，同时避免了整体条件下神经、体液因素对心肌细胞的影响。因此，用培养的心肌细胞可比较精确地分析各种独立因素对心肌细胞的作用。用代谢抑制剂Retenone来模拟心肌细胞缺血模型，其能直接抑制心肌细胞的呼吸链，因而避免了其它心肌缺氧模型所产生的不完全性缺氧，以及代谢产物的严重堆积，且更重要的是此模型具有类似心肌缺血模型的特点[4]。
心肌缺血时细胞内钙失衡是心肌细胞损伤的中心环节，文献报道培养乳鼠心肌细胞在缺氧时胞内钙浓度升高，50分钟时细胞内钙超载已经产生而肌浆网钙释放通道尚保持释放钙的功能[5]，故本实验选择了代谢抑制剂Retenone作用时间为50分钟。本结果提示缺氧50分钟时心肌细胞搏动降低，但尚未见细胞膜破损明显增加(因缺氧前后心肌细胞胎盼兰染色无变化)，与文献报道心肌细胞缺氧60分钟时胞内钙浓度升高并非由于细胞膜破损所致细胞外钙流入、亦非通过细胞膜电压依赖性通道或Na+/Ca2+交换相一致[5]。因此，肌浆网钙泵对缺氧时钙超载可能起非常关键作用。因肌浆网钙泵对胞浆内钙的转运过程与p-NPP水解相偶连，因而可用p-NPP酶法来测定心肌细胞匀浆肌浆网钙泵活力，且利用心肌匀浆测定肌浆网钙泵活力避免了提纯肌浆网过程所造成的钙泵蛋白的丢失和活力的下降[3]。
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本实验结果表明心肌细胞在缺氧时肌浆网钙泵功能较正常组下降(P<0.01)。提示肌浆网钙泵活力的下降可能是细胞内游离钙浓度的升高、继而产生钙超载损伤的重要原因。钙泵活力下降的可能机制[4，6]：(1)心肌细胞缺氧时胞内pH值下降。当给予Retenone抑制线粒体氧化磷酸化时可导致细胞内酸中毒，而当pH从7.0下降至6.4时肌浆网钙ATP酶活力下降50%。(2)心肌细胞缺氧时ATP含量下降。由于ATP含量下降，腺苷酸减少、肌酸磷酸激酶代谢受限，从而导致肌浆网钙ATP酶活力下降。同时本结果表明：20μM乐息平可使肌浆网钙ATP酶活力显著上升(P<0.05)，这种上升可能使缺血心肌细胞内游离钙浓度上升得到缓解，减轻了钙超载所致的心肌细胞损伤。乐息平为细胞膜L-型钙通道拮抗剂，其使缺血心肌细胞内肌浆钙泵活力上升的原因：(1)细胞膜L-型钙通道参与钙诱导的钙释放机制(Ca2+induced Ca2+release)有关[7]。(2)乐息平参与维持心肌细胞内能量和底物的供给，使可利用的能量呈ATP形式，减少了ATP的降解和丢失[8]。
, http://www.100md.com
*本课题由江苏省自然科学基金资助(编号BK97171)
参考文献
[1] Biordillon PD, et al. Circ Res 1982；50：360.
[2] 祝宝华，等.国外医学心血管分册 1997；24(2)：3.
[3] Larsen JS, et al. Basic Res Cardiol 1995；90：323.
[4] Hol CM, et al. Circ Res 192；70：716.
[5] Barrigon SJ, et al. Mol Cell Cardiol 1996；28：1329.
[6] Franson R, et al. Am J Phsiol 1986；251：H1017.
[7] Rannon F, et al. J Mol Cell Cardiol 1995；27：1225.
[8] Buser PT, et al. J Cardiovas Pharm 1991；18(Suppl)：S87.
(1998年5月28日收稿 同年8月25日修回), 百拇医药