PCR法检测EB病毒BNLF1基因
作者：彭晓帆 银平章
单位：彭晓帆 银平章(河南省人民医院病理科，郑州 450003)
关键词：疱疹病毒4型；人；EBV-BNLF1；DNA；聚合酶链反应
临床与实验病理学杂志990430
分类号 R392.3； R373.9 文献标识码 A
文章编号 1001-7399(1999)04-0354-02
目前已建立分子杂交和PCR检测Epstein-Barr病毒(EBV) DNA的方法。近年来研究发现EBV致癌作用与LMP1蛋白的表达密切相关〔1〕。为此，我们针对EBV表达LMP1蛋白的BNLF1基因片段建立PCR检测方法。
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1 材料与方法
1.1 标准病毒和对照病毒 含有EBV的Raji细胞系和带有PGEMI-BNLF1的菌种有美国国立卫生研究院(NIH) Jackson博士赠送。HCMV AD169、HSV-Ⅰ、VZV购自于上海第二医科大学。
1.2 主要试剂与仪器 限制性内切酶StyI，Marker购自华美公司。Taq酶、4×dNTP购于Promega公司。琼脂糖购于Sigma公司，PCR扩增仪(Perkin Elmer Cuttes 480, USA)。EBV DNA试剂盒购于华美公司。
1.3 EBV-BNLF1 DNA提取与纯化 将带有PGEMI-BNLF1质粒的菌种接种在含有氨苄青霉素的LB中培养，按照Treiman的碱裂解法提取质粒，聚乙二醇沉淀法纯化质粒〔2〕。
1.4 病毒DNA提取 EBV、HCMV、HSVI、VZV在病毒悬液中加入终浓度为1%SDS，蛋白酶K终浓度为250 mg.L-1，EDTA终浓度为0.005 mol.L-1，42℃水浴过夜。然后用酚-氯仿抽提2次。最后得到的病毒DNA溶解在TE中，-20℃备用。
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1.5 人基因组DNA的制备 参照《Molecular Clonng》从血细胞中分离DNA的方法，得到人基因组DNA〔3〕。用TB稀释成1 ng.μl-1，-20℃备用。
1.6 引物 利用计算机和一系列分析及设计软件，在EBV保守区BNLF1〔4〕中独立设计出一对引物。在Genbank中作同源性检索，与其它序列无显著同源。有上海细胞所391型DNA合成仪合成。EBV中BNLF1引物序列为：正链引物P1 5′ATCCCCAGAAACACGCGTTACTC 3′，负链引物P2 5′-GCTACAGCCTGTCCGTGC-3′，扩增产物为505 bp。
1.7 PCR扩增 10×缓冲液5 μl，2种引物各2 μl，5 mmol*L-1 4×dNTP 2 μl，Taq酶2 U，模板DNA 5 μl，去离子水补足50 μl体积，30 μl液体石蜡封顶。扩增反应参数：预变性94℃ 3 min；94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 60 s，三温循环35次；最后72℃延伸7 min。
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1.8 电泳分析 取10 μl PCR扩增产物作2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外透射仪观察结果。
2 结果
2.1 敏感度测定 将纯化的PGEM 1-BNLF1质粒作梯度稀释，使EBV BNLF1 DNA含量从每微升1 ng到0.1 fg，以其为模板，去离子水为阴性对照进行扩增。结果在扩增体系中含有1 fg EBV-BNLF1 DNA时仍能检出(图1)。同时用华美公司EBV DNA PCR检测试剂盒扩增以上模板，其最小能检出0.1 pg EBV DNA(图2)。
图1 引物设计的敏感度实验
A：分子量标准(1543，994，695，515，237 bp)
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B：浓度为10 pg的EBV-BNLF1 DNA
C：浓度为1 pg的EBV-BNLF1 DNA
D：浓度为0.1 pg的EBV-BNLF1 DNA
E：浓度为0.01 pg的EBV-BNLF1 DNA
F：浓度为1 fg的EBV-BNLF1 DNA
图2 EBV DNA PCR KIT敏感度扩增结果
A：分子量标准(1543，994，695，515，237 bp)
B：浓度为10 pg的EBV-BNLF1 DNA
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C：浓度为1 pg的EBV-BNLF1 DNA
D：浓度为0.1 pg的EBV-BNLF1 DNA
E：浓度为0.01 pg的EBV-BNLF1 DNA
F：浓度为1 fg的EBV-BNLF1 DNA
2.2 特异性测定 分别以EBV DNA，人基因组DNA， HCMV DNA， HSVI DNA、VZVI DNA为模板进行扩增。结果仅EBV DNA有505 bp靶片段出现，其它均无扩增产物(图3)。
图3 设计引物对EB病毒的特异性扩增结果
A：分子量标准(1543，994，695，515，237 bp)
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B：标准EB病毒 C：HSV-I
D：HCMV E：VZV
F：人基因组DNA
G：去离子水阴性对照
2.3 产物酶切分析 扩增产物经乙醇沉淀后用去离子水溶解，然后用限制性内切酶StyI、AvaII和NcoI进行消化，2.5%琼脂糖凝胶电泳。3种酶切结果与计算机分析靶片段结果一致(图4～6)。
图4 扩增产物
AvaⅡ酶切结果
M：分子量标准(1543，994，695，515，377，237 bp)
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A：未被酶消化扩增产物
B：扩增产物AvaⅡ酶切结果
图5 扩增产物
NcoⅠ酶切结果
M：分子量标准(1543，994，695，515，377，237 bp)
A：扩增产物NcoⅠ酶切结果
图6 扩增产物StyⅠ酶切结果
A：分子量标准(1543，994，695，515，377，237 bp)
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B、D、E、F为阳性标本扩增产物酶切结果
(E、D与EBV酶切结果相同，B、F与标准EBV酶切结果不同)
C：标准病毒扩增产物酶切结果
3 讨论
3.1 设计引物敏感度 1 fg EBV-BNLF1的敏感度远优于华美公司0.1 pg EBV DNA PCR检测试剂盒。可能因为是引物和扩增区域不同所致。笔者设计引物扩增片段为505 bp，华美公司试剂盒扩增片段为269 bp，利用引物设计软件对EBV-BNLF1区域进行详细分析、优选，有计算机提供出最佳扩增参考值，避免参数选择的盲目性。3.2 特异性实验 引物一般为15～30 bp，可以保证其特异性的要求，即使偶然发生交叉，扩增片段的长度与特异性靶片段的长度恰好一样的概率极小。因此许多学者对引物设计只作同源性检索，而不作特异性实验。但是在PCR扩增中，由于反应条件的不严格，可以产生非特异扩增，干扰结果的判断。为了使扩增产物单一，产物更易判断，笔者认为作特异性实验对于检测为目的引物是有意义的。
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3.3 检测EBV-BNLF1意义 目前用PCR方法检测EBV DNA扩增区域为Bam HIW。本实验设计引物扩增区域为BNLF1，是表达LMP1蛋白的基因区域，LMP1是重要的转化蛋白，具有肿瘤基因产物的特性，是EBV致癌变的重要物质〔1〕。因此建立检测EBV BNLF1的PCR方法，对研究EBV致癌机制比扩增其它区域的方法更优越、更有意义。
基金项目：河南省科技攻关项目(No 971200132)
参考文献
1，Knecht H, Bachmann E, Brousset P et al. Deletions within the LMP2 oncogene of epstein-Barr virus are clustered in Hodgkins disease and identical to those observed innaspharyngeal carcinoma. Blood,1993;82:2937
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2，Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning. New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989:138～141
3，Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989:917～919
4，Li-Fu Hu, Eugeng R, Zabarovsky et al. Isolation and sequencing of the Epstein-Barr virus BNLF1 gene (LMP1) from A Chineses nasopharyngeal carcinoma. J G Virol, 1991;72:2399～2409
收稿日期：1998-12-30, http://www.100md.com
单位：彭晓帆 银平章(河南省人民医院病理科，郑州 450003)
关键词：疱疹病毒4型；人；EBV-BNLF1；DNA；聚合酶链反应
临床与实验病理学杂志990430
分类号 R392.3； R373.9 文献标识码 A
文章编号 1001-7399(1999)04-0354-02
目前已建立分子杂交和PCR检测Epstein-Barr病毒(EBV) DNA的方法。近年来研究发现EBV致癌作用与LMP1蛋白的表达密切相关〔1〕。为此，我们针对EBV表达LMP1蛋白的BNLF1基因片段建立PCR检测方法。
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1 材料与方法
1.1 标准病毒和对照病毒 含有EBV的Raji细胞系和带有PGEMI-BNLF1的菌种有美国国立卫生研究院(NIH) Jackson博士赠送。HCMV AD169、HSV-Ⅰ、VZV购自于上海第二医科大学。
1.2 主要试剂与仪器 限制性内切酶StyI，Marker购自华美公司。Taq酶、4×dNTP购于Promega公司。琼脂糖购于Sigma公司，PCR扩增仪(Perkin Elmer Cuttes 480, USA)。EBV DNA试剂盒购于华美公司。
1.3 EBV-BNLF1 DNA提取与纯化 将带有PGEMI-BNLF1质粒的菌种接种在含有氨苄青霉素的LB中培养，按照Treiman的碱裂解法提取质粒，聚乙二醇沉淀法纯化质粒〔2〕。
1.4 病毒DNA提取 EBV、HCMV、HSVI、VZV在病毒悬液中加入终浓度为1%SDS，蛋白酶K终浓度为250 mg.L-1，EDTA终浓度为0.005 mol.L-1，42℃水浴过夜。然后用酚-氯仿抽提2次。最后得到的病毒DNA溶解在TE中，-20℃备用。
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1.5 人基因组DNA的制备 参照《Molecular Clonng》从血细胞中分离DNA的方法，得到人基因组DNA〔3〕。用TB稀释成1 ng.μl-1，-20℃备用。
1.6 引物 利用计算机和一系列分析及设计软件，在EBV保守区BNLF1〔4〕中独立设计出一对引物。在Genbank中作同源性检索，与其它序列无显著同源。有上海细胞所391型DNA合成仪合成。EBV中BNLF1引物序列为：正链引物P1 5′ATCCCCAGAAACACGCGTTACTC 3′，负链引物P2 5′-GCTACAGCCTGTCCGTGC-3′，扩增产物为505 bp。
1.7 PCR扩增 10×缓冲液5 μl，2种引物各2 μl，5 mmol*L-1 4×dNTP 2 μl，Taq酶2 U，模板DNA 5 μl，去离子水补足50 μl体积，30 μl液体石蜡封顶。扩增反应参数：预变性94℃ 3 min；94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 60 s，三温循环35次；最后72℃延伸7 min。
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1.8 电泳分析 取10 μl PCR扩增产物作2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外透射仪观察结果。
2 结果
2.1 敏感度测定 将纯化的PGEM 1-BNLF1质粒作梯度稀释，使EBV BNLF1 DNA含量从每微升1 ng到0.1 fg，以其为模板，去离子水为阴性对照进行扩增。结果在扩增体系中含有1 fg EBV-BNLF1 DNA时仍能检出(图1)。同时用华美公司EBV DNA PCR检测试剂盒扩增以上模板，其最小能检出0.1 pg EBV DNA(图2)。
图1 引物设计的敏感度实验
A：分子量标准(1543，994，695，515，237 bp)
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B：浓度为10 pg的EBV-BNLF1 DNA
C：浓度为1 pg的EBV-BNLF1 DNA
D：浓度为0.1 pg的EBV-BNLF1 DNA
E：浓度为0.01 pg的EBV-BNLF1 DNA
F：浓度为1 fg的EBV-BNLF1 DNA
图2 EBV DNA PCR KIT敏感度扩增结果
A：分子量标准(1543，994，695，515，237 bp)
B：浓度为10 pg的EBV-BNLF1 DNA
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C：浓度为1 pg的EBV-BNLF1 DNA
D：浓度为0.1 pg的EBV-BNLF1 DNA
E：浓度为0.01 pg的EBV-BNLF1 DNA
F：浓度为1 fg的EBV-BNLF1 DNA
2.2 特异性测定 分别以EBV DNA，人基因组DNA， HCMV DNA， HSVI DNA、VZVI DNA为模板进行扩增。结果仅EBV DNA有505 bp靶片段出现，其它均无扩增产物(图3)。
图3 设计引物对EB病毒的特异性扩增结果
A：分子量标准(1543，994，695，515，237 bp)
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B：标准EB病毒 C：HSV-I
D：HCMV E：VZV
F：人基因组DNA
G：去离子水阴性对照
2.3 产物酶切分析 扩增产物经乙醇沉淀后用去离子水溶解，然后用限制性内切酶StyI、AvaII和NcoI进行消化，2.5%琼脂糖凝胶电泳。3种酶切结果与计算机分析靶片段结果一致(图4～6)。
图4 扩增产物
AvaⅡ酶切结果
M：分子量标准(1543，994，695，515，377，237 bp)
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A：未被酶消化扩增产物
B：扩增产物AvaⅡ酶切结果
图5 扩增产物
NcoⅠ酶切结果
M：分子量标准(1543，994，695，515，377，237 bp)
A：扩增产物NcoⅠ酶切结果
图6 扩增产物StyⅠ酶切结果
A：分子量标准(1543，994，695，515，377，237 bp)
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B、D、E、F为阳性标本扩增产物酶切结果
(E、D与EBV酶切结果相同，B、F与标准EBV酶切结果不同)
C：标准病毒扩增产物酶切结果
3 讨论
3.1 设计引物敏感度 1 fg EBV-BNLF1的敏感度远优于华美公司0.1 pg EBV DNA PCR检测试剂盒。可能因为是引物和扩增区域不同所致。笔者设计引物扩增片段为505 bp，华美公司试剂盒扩增片段为269 bp，利用引物设计软件对EBV-BNLF1区域进行详细分析、优选，有计算机提供出最佳扩增参考值，避免参数选择的盲目性。3.2 特异性实验 引物一般为15～30 bp，可以保证其特异性的要求，即使偶然发生交叉，扩增片段的长度与特异性靶片段的长度恰好一样的概率极小。因此许多学者对引物设计只作同源性检索，而不作特异性实验。但是在PCR扩增中，由于反应条件的不严格，可以产生非特异扩增，干扰结果的判断。为了使扩增产物单一，产物更易判断，笔者认为作特异性实验对于检测为目的引物是有意义的。
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3.3 检测EBV-BNLF1意义 目前用PCR方法检测EBV DNA扩增区域为Bam HIW。本实验设计引物扩增区域为BNLF1，是表达LMP1蛋白的基因区域，LMP1是重要的转化蛋白，具有肿瘤基因产物的特性，是EBV致癌变的重要物质〔1〕。因此建立检测EBV BNLF1的PCR方法，对研究EBV致癌机制比扩增其它区域的方法更优越、更有意义。
基金项目：河南省科技攻关项目(No 971200132)
参考文献
1，Knecht H, Bachmann E, Brousset P et al. Deletions within the LMP2 oncogene of epstein-Barr virus are clustered in Hodgkins disease and identical to those observed innaspharyngeal carcinoma. Blood,1993;82:2937
, 百拇医药
2，Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning. New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989:138～141
3，Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989:917～919
4，Li-Fu Hu, Eugeng R, Zabarovsky et al. Isolation and sequencing of the Epstein-Barr virus BNLF1 gene (LMP1) from A Chineses nasopharyngeal carcinoma. J G Virol, 1991;72:2399～2409
收稿日期：1998-12-30, http://www.100md.com