云芝多糖对巨噬细胞氧化LDL的抑制作用与iNOS基因表达*
作者：王瑾雯 陈瑗 周玫 莫永炎 张宝
单位：第一军医大学分子生物学研究所自由基医学研究室，广州，510515
关键词：云芝多糖；低密度脂蛋白氧化；巨噬细胞；诱导型一氧化氮合酶；
第一军医大学学报990402 摘要：目的和方法 为揭示云芝多糖(PSK)的抗动脉粥样硬化机理，用RT-PCR和Western blot等方法研究了PSK对巨噬细胞氧化低密度脂蛋白(LDL)的影响。结果 PSK处理小鼠的巨噬细胞对LDL的氧化作用明显降低，NO分泌明显增加；PSK增强了IFN-γ对巨噬细胞LDL的抑制作用，减弱了一氧化氮合酶抑制剂N-Arg和DPI对细胞氧化LDL的增强作用；同时PSK能增强IFN-γ对细胞分泌NO的诱导作用，减弱N-Arg对细胞分泌NO的抑制作用； PSK能增强Raw264.7细胞iNOS mRNA和蛋白表达。结论 PSK能抑制巨噬细胞对LDL的氧化，其作用机制可能与其能诱导iNOS基因表达有关。
, 百拇医药
基因表达
中图分类号：Q34
Effect of protein-bound polysaccharide on inhibition of LDL oxidation induced by macrophages and their relation with iNOS gene expression
Wang Jinwen，Chen Yuan，Zhou Mei，Mo Yongyan，Zhang Bao
(Research Laboratory of Free Radical Medicine，Department of Biochemistry，First Military Medical University，Guangzhou，510515)
, http://www.100md.com
Abstract：Objective and Methods To explore the mechanism of anti-atherosclerosis of protein bound polysaccharide (PSK)，the effect of PSK on oxidation of low density lipoprotein (LDL) by macrophages were investigated using RT-PCR and Western blot techniques and by assay of contents of nitrite and hydyoperoxide.Results Ability of PSK-treated macrophage to oxidize LDL was decreased markedly and production of NO was increased significantly.PSK-treated macrophage could enhance the inhibition of LDL oxidation and induction of NO production by IFN-γ，alleviate the increment of LDL oxidation and inhibition of NO production by Nω-nitro-L-arginine and diphenylene iodonium.Meanwhile，iNOS mRNA and protein expressions induced by PSK，the expression induced by IFN-γin Raw264.7 cells were enhanced by PSK.Conclusion The oxidation of LDL induced by macrophages could be inhibited by PSK，the mechanism may be related to its induction of iNOS gene expression.
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Key words：protein bound polysaccharide；low density lipoprotein；macrophage；gene expression；inducible nitric oxide synthase
我们先前的研究发现云芝多糖(PSK)体内注射能增加巨噬细胞抗氧化酶的活性以及防止和降低氧化修饰LDL(Ox-LDL)所致的巨噬细胞脂质过氧化物积聚、泡沫样变和一氧化氮合酶(iNOS)基因表达抑制[1,2]。因此，探讨PSK对巨噬细胞氧化LDL的影响对进一步揭示PSK的抗AS机理具有重要作用。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1实验动物 雄性昆明鼠(清洁级，4～5周龄，18～20 g)，购自本校实验动物中心。
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1.1.2实验试剂 有关试剂购自美国Gibco Brl，Sigma，Boehringer Biotechology公司。PSK由我室从云芝子实体提取，用生理盐水配成1.5%的溶液(LPS含量在50 ng/L以下)。根据Genebank中小鼠iNOS和β-actin的DNA序列设计引物，引物由美国Gibco Brl公司合成。iNOS：5’-AGA CA-T GGC TTG CCC CTG G-3’和5’-GAT CAG GAG GGA TTT CAA AGA CCT-3’，扩增片段为674 bp；β-actin：5’-TCA TGA AGT GTG ACG TTG ACA TCC GTA AAG-3’和5’-CCT AGA AGC ATT TGC GGT-3’，扩增片段为285 bp。有些试剂为国产分析纯。
1.2 实验方法
1.2.1 LDL的分离 新鲜人血由南方医院血库提供，低速离心分离血清，采用一次性密度梯度离心法[3]制备LDL(ρ=1.040～1.063)。
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1.2.2 动物处理与腹腔巨噬细胞的提取 PSK处理组和对照组。PSK处理组腹腔注射PSK 0.2ml/d，连续3 d，对照组等量注射生理盐水。2 d后，用PBS灌洗腹腔收集腹腔巨噬细胞，沉淀细胞用含10%的1640制成悬液，调整细胞浓度，接种于24孔细胞培养板。置37℃、5%CO2的孵箱中培养，2 h后洗去未贴壁细胞，根据需要加入含不同成份的培养基继续培养。
1.2.3 Raw264.7小鼠巨噬细胞系培养 用含10%小牛血清的无酚红DMEM培养基，接种于100 ml培养瓶，孵箱中培养，根据需要加入10万 U/L IFN-γ或100 mg/L PSK处理24 h。
1.2.4 氢过氧化物含量的测定 采用FOX法[4]。取50 μl培养上清液加至950 μlFOX反应液
(100μmol/L二甲酚橙，250 μmol/L Fe2+，25 mmol/LH2SO4和4 mmol/LBHT)中，室温反应30min，560 nm处测光吸收度。用tbOOH作标准参考。
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1.2.5 亚硝酸盐测定 细胞接种于96孔板，经不同因素处理后，取无酚红DMEM细胞培养上清液150μl，加入等量的Griess试剂(1%对氨基苯磺酸，0.1% N-萘基二乙胺，2.5%磷酸)，室温下反应10 min，于560 nm处比色，用NaNO2作标准参考。
1.2.6 蛋白含量测定 采用Lowry法[5]，以酪蛋白为标准参考。
1.2.7 细胞总RNA的提取 方法参照文献[6]。所提RNA样品测A260、A280的D(λ)值，要求A260/A280>1.95。将RNA样品的浓度调为1 g/L。
1.2.8 RT-PCR[7] 将含100 ng RNA样品加入以下逆转录体系中：Oligo (dT) 2 μmol/L，dNTPs各500 μmol/L，5×逆转录缓冲液 5 μl，AMV-RT酶5 U,总体积25 μl，混匀后42℃孵育1 h，95℃变性5 min，冰浴2 min。取2 μl逆转录产物加至PCR扩增反应体系中：iNOS和β-actin两对引物各20 pmol/L，dNTPs 200 μmol/L，Taq DNA聚合酶1 U，2.5μl 10×PCR缓冲液，总体积25μl，混匀、95℃预变性5 min。扩增条件是：94℃变性45 s，55℃退火1 min，72℃延伸2min，循环30次，最后延伸10 min。反应结束后取5 μl于2%琼脂糖凝胶中电泳，紫外透射反应仪上观察、拍照。
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1.2.9 Western印迹 采用方法见文献[7]。
1.2.10 统计学处理 采用两样本均数比较的t检验。
2 结果
2.1 巨噬细胞对LDL的氧化 正常不含EDTA的LDL(终浓度为0.1 g/L)与小鼠腹腔巨噬细胞在无血清的DMEM/F12培养液中共同温育，自8 h开始，随着时间的延长，氢过氧化物含量不断增加(图1)。氢过氧化物为脂质过氧化产物，其含量反映的是LDL氧化程度。结果说明巨噬细胞对LDL氧化随时间而增强。
图1 巨噬细胞诱导LDL氧化
Fig.1 Oxidation of LDL induced by macrophages(mean±SD，n=3)
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2.2 PSK对巨噬细胞氧化LDL的抑制作用 由图2可见，经与不经PSK处理小鼠相比，PSK能明显地抑制巨噬细胞对LDL氧化(对照组)。与对照组相比，IFN-γ能明显抑制巨噬细胞对LDL氧化，N-Arg能明显地增强LDL氧化，与对照组一样，在这些组中经PSK处理的细胞氧化LDL的程度明显降低。
图2 不同处理因素对巨噬细胞诱导的LDL氧化的影响
Fig.2 Effects of different treatments on oxidation of LDL induced by macrophages
P<0.05，PSK vs non PSK (mean±SD，n=3)
2.3 PSK对巨噬细胞生成NO的影响 PSK处理能明显增加巨噬细胞NO(NO2-)的生成(图3)。IFN-γ能增强巨噬细胞NO2-生成，而iNOS抑制剂N-Arg和DPI则明显地抑制NO2-生成。但不论是对照组，还是其它组PSK处理都较未经PSK处理细胞生成NO2-量为明显。
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图3 不同处理因素对巨噬细胞NO生成的影响
Fig.3 Effects of different treatmentS on NO production of macrophages
P<0.05，PSK vs non PSK (mean±SD，n=3)
2.4 PSK对Raw264.7巨噬细胞iNOS mRNA表达的影响 RT-PCR检测iNOS基因表达的结果如图4所示，正常细胞(4A.1)无mRNA表达，PSK(4B.1)和IFN-γ(4A.2)都能诱导细胞mRNA表达，PSK能增强IFN-γ的诱导作用(4B.2)。
图4 PSK对巨噬细胞iNOS mRNA表达的影响
, 百拇医药
Fig.4 Effects of PSK on iNOS mRNA expression of Raw264.7 cells assessed by RT-PCR
A:non-PSK;B:PSK;1:DNA mark;2:Control;3:IFN-γ
2.5 PSK对Raw264.7巨噬细胞iNOS蛋白表达的影响 PSK对Raw264.7巨噬细胞iNOS蛋白表达的影响(图5)如同对mRNA表达一样，PSK和IFN-γ都能诱导iNOS蛋白表达，PSK能增强IFN-γ的诱导作用。
图5 PSK对巨噬细胞iNOS蛋白表达的影响
Fig.5 Effects of PSK on iNOS protein expression of Raw264.7 cells assessed by Western blot
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A:non-PSK;B:PSK;1:Control;2:IFN-γ;Left band:molecular weight marker
3 讨论
与组成型一氧化氮合酶(cNOS)不同，iNOS表达是在基因水平上受转录调控的，巨噬细胞iNOS基因启动子区含有与IFN-γ有关的转录因子元件与LPS有关的应答元件，IFN-γ和LPS常单独或联合应用作为研究iNOS基因表达调控的试剂。本研究显示IFN-γ诱导巨噬细胞NO分泌增加，而NOS抑制剂N-Arg和DPI抑制NO分泌(图3)，同时观察到IFN-γ抑制巨噬细胞对LDL的氧化，而N-Arg增强LDL氧化(图2)。结果说明巨噬细胞分泌的NO影响着它对LDL的氧化。已有文献报道[8]，NO不但能抑制Cu2+和过氧基诱导的LDL氧化，而且对巨噬细胞诱导的LDL氧化也有明显的抑制作用。
PSK在抑制巨噬细胞对LDL氧化(图2)的同时增加NO分泌(图3)。此外，PSK能增强IFN-γ对巨噬细胞诱导NO作用和减弱NOS抑制剂N-Arg和DPI对NO生成的抑制作用(图3)，以及PSK能增强IFN-γ抑制LDL氧化作用和减弱N-Arg增加LDL氧化作用。结果说明PSK能抑制巨噬细胞对LDL氧化以及此作用是通过诱导NO的生成。本研究用PSK和IFN-γ单独或联合应用诱导和增强Raw264.7巨噬细胞iNOS mRNA表达(图4)和iNOS蛋白表达(图5)所得的结果与诱导NO分泌(图3)相一致，这进一步说明PSK抑制巨噬细胞对LDL氧化与其能诱导iNOS基因表达有关。
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Xia等[9]最近用电子顺磁共振(ESR)技术揭示NOS能同时催化NO和O2-生成，这是因为NOS分子中的还原酶结构与细胞色素P450还原酶结构相似，具有该酶的许多功能性特征。NO和O2-反应能生成介导LDL氧化的ONOOH*。Rubbo等[10]的研究说明NO诱导或抑制脂质过氧化主要取决于NO/ O2-的比值。考虑到PSK能使巨噬细胞锰超氧化物歧化酶(MnSOD)基因表达增加，而SOD能清除O2-，由此使NO相对含量增加。因此PSK致的MnSOD基因表达增加在其抗巨噬细胞氧化LDL的NO机制中亦应有所贡献。
*国家自然科学基金资助(39570867)
作者简介：王瑾雯,女,1969年出生:1999年毕业于第一军医大学:博士
, 百拇医药
参考文献
1 Chen Y，Zhou M，Liu SX et al.PSK protects macrophages from lipoperoxide accumulation and foam cell formation caused by oxidatively modified low density lipoprotein.Atherosclerosis，1996,124:171
2 Zhou M，Chen Y，Liu SX et al.Protective effect of PSK on the inhibition of lipopolysaccharide-induced nitric oxide production in macrophages caused by oxidized low density lipoprotein.Med Sci Res，1997,25(8):507
, 百拇医药
3 张林华,刘秉文.一次性密度梯度超速离心分离人血浆脂蛋白.生物化学和生物物理学报，1992，21(3):257
4 Woff SP.Ferrous ion oxidation in presence of ferric ion indicator xylenol orange for the measurement of hydroperoxide.Methods in Enzymology，1994，223:182
5 Lowry OH，Rosebroug N，Farr AL.Protein measurement with Folin phenol regent.J Biol Chem，1957,193:265
6 Piotr C，Nicoletta S.Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.Anal Biochem.1987，162:156
, http://www.100md.com
7 金冬雁，黎孟枫等译.分子克隆实验指南.第二版.北京:科学出版社，1998.345～897
8 Hogg N，Struck A，Goss SPA et al.Inhibition of macrophage-dependent low density lipoprotein oxidation by nitric oxide donors.J Lipid Res,1995,36:1756
9 Xia Y，Dawson VL，Dawson TM et al.Nitric oxide synthase generates superoxide and nitric oxide in arginine depleted cells leading to peroxynitric mediated cellular injury.Proc Natl Acad Sci USA，1996，93:6770
10 Rubbo H，Radi R，Tryjillo M et al.Nitric oxide regulation of superoxide and peroxynitrite-dependent lipid peroxidation.Formation of novel nitrogen-containing oxidized lipid derivatives.J Biol Chem,1994，269(42): 26066
(收稿日期:1999-06-25), http://www.100md.com
单位：第一军医大学分子生物学研究所自由基医学研究室，广州，510515
关键词：云芝多糖；低密度脂蛋白氧化；巨噬细胞；诱导型一氧化氮合酶；
第一军医大学学报990402 摘要：目的和方法 为揭示云芝多糖(PSK)的抗动脉粥样硬化机理，用RT-PCR和Western blot等方法研究了PSK对巨噬细胞氧化低密度脂蛋白(LDL)的影响。结果 PSK处理小鼠的巨噬细胞对LDL的氧化作用明显降低，NO分泌明显增加；PSK增强了IFN-γ对巨噬细胞LDL的抑制作用，减弱了一氧化氮合酶抑制剂N-Arg和DPI对细胞氧化LDL的增强作用；同时PSK能增强IFN-γ对细胞分泌NO的诱导作用，减弱N-Arg对细胞分泌NO的抑制作用； PSK能增强Raw264.7细胞iNOS mRNA和蛋白表达。结论 PSK能抑制巨噬细胞对LDL的氧化，其作用机制可能与其能诱导iNOS基因表达有关。
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基因表达
中图分类号：Q34
Effect of protein-bound polysaccharide on inhibition of LDL oxidation induced by macrophages and their relation with iNOS gene expression
Wang Jinwen，Chen Yuan，Zhou Mei，Mo Yongyan，Zhang Bao
(Research Laboratory of Free Radical Medicine，Department of Biochemistry，First Military Medical University，Guangzhou，510515)
, http://www.100md.com
Abstract：Objective and Methods To explore the mechanism of anti-atherosclerosis of protein bound polysaccharide (PSK)，the effect of PSK on oxidation of low density lipoprotein (LDL) by macrophages were investigated using RT-PCR and Western blot techniques and by assay of contents of nitrite and hydyoperoxide.Results Ability of PSK-treated macrophage to oxidize LDL was decreased markedly and production of NO was increased significantly.PSK-treated macrophage could enhance the inhibition of LDL oxidation and induction of NO production by IFN-γ，alleviate the increment of LDL oxidation and inhibition of NO production by Nω-nitro-L-arginine and diphenylene iodonium.Meanwhile，iNOS mRNA and protein expressions induced by PSK，the expression induced by IFN-γin Raw264.7 cells were enhanced by PSK.Conclusion The oxidation of LDL induced by macrophages could be inhibited by PSK，the mechanism may be related to its induction of iNOS gene expression.
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Key words：protein bound polysaccharide；low density lipoprotein；macrophage；gene expression；inducible nitric oxide synthase
我们先前的研究发现云芝多糖(PSK)体内注射能增加巨噬细胞抗氧化酶的活性以及防止和降低氧化修饰LDL(Ox-LDL)所致的巨噬细胞脂质过氧化物积聚、泡沫样变和一氧化氮合酶(iNOS)基因表达抑制[1,2]。因此，探讨PSK对巨噬细胞氧化LDL的影响对进一步揭示PSK的抗AS机理具有重要作用。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1实验动物 雄性昆明鼠(清洁级，4～5周龄，18～20 g)，购自本校实验动物中心。
, 百拇医药
1.1.2实验试剂 有关试剂购自美国Gibco Brl，Sigma，Boehringer Biotechology公司。PSK由我室从云芝子实体提取，用生理盐水配成1.5%的溶液(LPS含量在50 ng/L以下)。根据Genebank中小鼠iNOS和β-actin的DNA序列设计引物，引物由美国Gibco Brl公司合成。iNOS：5’-AGA CA-T GGC TTG CCC CTG G-3’和5’-GAT CAG GAG GGA TTT CAA AGA CCT-3’，扩增片段为674 bp；β-actin：5’-TCA TGA AGT GTG ACG TTG ACA TCC GTA AAG-3’和5’-CCT AGA AGC ATT TGC GGT-3’，扩增片段为285 bp。有些试剂为国产分析纯。
1.2 实验方法
1.2.1 LDL的分离 新鲜人血由南方医院血库提供，低速离心分离血清，采用一次性密度梯度离心法[3]制备LDL(ρ=1.040～1.063)。
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1.2.2 动物处理与腹腔巨噬细胞的提取 PSK处理组和对照组。PSK处理组腹腔注射PSK 0.2ml/d，连续3 d，对照组等量注射生理盐水。2 d后，用PBS灌洗腹腔收集腹腔巨噬细胞，沉淀细胞用含10%的1640制成悬液，调整细胞浓度，接种于24孔细胞培养板。置37℃、5%CO2的孵箱中培养，2 h后洗去未贴壁细胞，根据需要加入含不同成份的培养基继续培养。
1.2.3 Raw264.7小鼠巨噬细胞系培养 用含10%小牛血清的无酚红DMEM培养基，接种于100 ml培养瓶，孵箱中培养，根据需要加入10万 U/L IFN-γ或100 mg/L PSK处理24 h。
1.2.4 氢过氧化物含量的测定 采用FOX法[4]。取50 μl培养上清液加至950 μlFOX反应液
(100μmol/L二甲酚橙，250 μmol/L Fe2+，25 mmol/LH2SO4和4 mmol/LBHT)中，室温反应30min，560 nm处测光吸收度。用tbOOH作标准参考。
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1.2.5 亚硝酸盐测定 细胞接种于96孔板，经不同因素处理后，取无酚红DMEM细胞培养上清液150μl，加入等量的Griess试剂(1%对氨基苯磺酸，0.1% N-萘基二乙胺，2.5%磷酸)，室温下反应10 min，于560 nm处比色，用NaNO2作标准参考。
1.2.6 蛋白含量测定 采用Lowry法[5]，以酪蛋白为标准参考。
1.2.7 细胞总RNA的提取 方法参照文献[6]。所提RNA样品测A260、A280的D(λ)值，要求A260/A280>1.95。将RNA样品的浓度调为1 g/L。
1.2.8 RT-PCR[7] 将含100 ng RNA样品加入以下逆转录体系中：Oligo (dT) 2 μmol/L，dNTPs各500 μmol/L，5×逆转录缓冲液 5 μl，AMV-RT酶5 U,总体积25 μl，混匀后42℃孵育1 h，95℃变性5 min，冰浴2 min。取2 μl逆转录产物加至PCR扩增反应体系中：iNOS和β-actin两对引物各20 pmol/L，dNTPs 200 μmol/L，Taq DNA聚合酶1 U，2.5μl 10×PCR缓冲液，总体积25μl，混匀、95℃预变性5 min。扩增条件是：94℃变性45 s，55℃退火1 min，72℃延伸2min，循环30次，最后延伸10 min。反应结束后取5 μl于2%琼脂糖凝胶中电泳，紫外透射反应仪上观察、拍照。
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1.2.9 Western印迹 采用方法见文献[7]。
1.2.10 统计学处理 采用两样本均数比较的t检验。
2 结果
2.1 巨噬细胞对LDL的氧化 正常不含EDTA的LDL(终浓度为0.1 g/L)与小鼠腹腔巨噬细胞在无血清的DMEM/F12培养液中共同温育，自8 h开始，随着时间的延长，氢过氧化物含量不断增加(图1)。氢过氧化物为脂质过氧化产物，其含量反映的是LDL氧化程度。结果说明巨噬细胞对LDL氧化随时间而增强。
图1 巨噬细胞诱导LDL氧化
Fig.1 Oxidation of LDL induced by macrophages(mean±SD，n=3)
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2.2 PSK对巨噬细胞氧化LDL的抑制作用 由图2可见，经与不经PSK处理小鼠相比，PSK能明显地抑制巨噬细胞对LDL氧化(对照组)。与对照组相比，IFN-γ能明显抑制巨噬细胞对LDL氧化，N-Arg能明显地增强LDL氧化，与对照组一样，在这些组中经PSK处理的细胞氧化LDL的程度明显降低。
图2 不同处理因素对巨噬细胞诱导的LDL氧化的影响
Fig.2 Effects of different treatments on oxidation of LDL induced by macrophages
P<0.05，PSK vs non PSK (mean±SD，n=3)
2.3 PSK对巨噬细胞生成NO的影响 PSK处理能明显增加巨噬细胞NO(NO2-)的生成(图3)。IFN-γ能增强巨噬细胞NO2-生成，而iNOS抑制剂N-Arg和DPI则明显地抑制NO2-生成。但不论是对照组，还是其它组PSK处理都较未经PSK处理细胞生成NO2-量为明显。
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图3 不同处理因素对巨噬细胞NO生成的影响
Fig.3 Effects of different treatmentS on NO production of macrophages
P<0.05，PSK vs non PSK (mean±SD，n=3)
2.4 PSK对Raw264.7巨噬细胞iNOS mRNA表达的影响 RT-PCR检测iNOS基因表达的结果如图4所示，正常细胞(4A.1)无mRNA表达，PSK(4B.1)和IFN-γ(4A.2)都能诱导细胞mRNA表达，PSK能增强IFN-γ的诱导作用(4B.2)。
图4 PSK对巨噬细胞iNOS mRNA表达的影响
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Fig.4 Effects of PSK on iNOS mRNA expression of Raw264.7 cells assessed by RT-PCR
A:non-PSK;B:PSK;1:DNA mark;2:Control;3:IFN-γ
2.5 PSK对Raw264.7巨噬细胞iNOS蛋白表达的影响 PSK对Raw264.7巨噬细胞iNOS蛋白表达的影响(图5)如同对mRNA表达一样，PSK和IFN-γ都能诱导iNOS蛋白表达，PSK能增强IFN-γ的诱导作用。
图5 PSK对巨噬细胞iNOS蛋白表达的影响
Fig.5 Effects of PSK on iNOS protein expression of Raw264.7 cells assessed by Western blot
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3 讨论
与组成型一氧化氮合酶(cNOS)不同，iNOS表达是在基因水平上受转录调控的，巨噬细胞iNOS基因启动子区含有与IFN-γ有关的转录因子元件与LPS有关的应答元件，IFN-γ和LPS常单独或联合应用作为研究iNOS基因表达调控的试剂。本研究显示IFN-γ诱导巨噬细胞NO分泌增加，而NOS抑制剂N-Arg和DPI抑制NO分泌(图3)，同时观察到IFN-γ抑制巨噬细胞对LDL的氧化，而N-Arg增强LDL氧化(图2)。结果说明巨噬细胞分泌的NO影响着它对LDL的氧化。已有文献报道[8]，NO不但能抑制Cu2+和过氧基诱导的LDL氧化，而且对巨噬细胞诱导的LDL氧化也有明显的抑制作用。
PSK在抑制巨噬细胞对LDL氧化(图2)的同时增加NO分泌(图3)。此外，PSK能增强IFN-γ对巨噬细胞诱导NO作用和减弱NOS抑制剂N-Arg和DPI对NO生成的抑制作用(图3)，以及PSK能增强IFN-γ抑制LDL氧化作用和减弱N-Arg增加LDL氧化作用。结果说明PSK能抑制巨噬细胞对LDL氧化以及此作用是通过诱导NO的生成。本研究用PSK和IFN-γ单独或联合应用诱导和增强Raw264.7巨噬细胞iNOS mRNA表达(图4)和iNOS蛋白表达(图5)所得的结果与诱导NO分泌(图3)相一致，这进一步说明PSK抑制巨噬细胞对LDL氧化与其能诱导iNOS基因表达有关。
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Xia等[9]最近用电子顺磁共振(ESR)技术揭示NOS能同时催化NO和O2-生成，这是因为NOS分子中的还原酶结构与细胞色素P450还原酶结构相似，具有该酶的许多功能性特征。NO和O2-反应能生成介导LDL氧化的ONOOH*。Rubbo等[10]的研究说明NO诱导或抑制脂质过氧化主要取决于NO/ O2-的比值。考虑到PSK能使巨噬细胞锰超氧化物歧化酶(MnSOD)基因表达增加，而SOD能清除O2-，由此使NO相对含量增加。因此PSK致的MnSOD基因表达增加在其抗巨噬细胞氧化LDL的NO机制中亦应有所贡献。
*国家自然科学基金资助(39570867)
作者简介：王瑾雯,女,1969年出生:1999年毕业于第一军医大学:博士
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参考文献
1 Chen Y，Zhou M，Liu SX et al.PSK protects macrophages from lipoperoxide accumulation and foam cell formation caused by oxidatively modified low density lipoprotein.Atherosclerosis，1996,124:171
2 Zhou M，Chen Y，Liu SX et al.Protective effect of PSK on the inhibition of lipopolysaccharide-induced nitric oxide production in macrophages caused by oxidized low density lipoprotein.Med Sci Res，1997,25(8):507
, 百拇医药
3 张林华,刘秉文.一次性密度梯度超速离心分离人血浆脂蛋白.生物化学和生物物理学报，1992，21(3):257
4 Woff SP.Ferrous ion oxidation in presence of ferric ion indicator xylenol orange for the measurement of hydroperoxide.Methods in Enzymology，1994，223:182
5 Lowry OH，Rosebroug N，Farr AL.Protein measurement with Folin phenol regent.J Biol Chem，1957,193:265
6 Piotr C，Nicoletta S.Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.Anal Biochem.1987，162:156
, http://www.100md.com
7 金冬雁，黎孟枫等译.分子克隆实验指南.第二版.北京:科学出版社，1998.345～897
8 Hogg N，Struck A，Goss SPA et al.Inhibition of macrophage-dependent low density lipoprotein oxidation by nitric oxide donors.J Lipid Res,1995,36:1756
9 Xia Y，Dawson VL，Dawson TM et al.Nitric oxide synthase generates superoxide and nitric oxide in arginine depleted cells leading to peroxynitric mediated cellular injury.Proc Natl Acad Sci USA，1996，93:6770
10 Rubbo H，Radi R，Tryjillo M et al.Nitric oxide regulation of superoxide and peroxynitrite-dependent lipid peroxidation.Formation of novel nitrogen-containing oxidized lipid derivatives.J Biol Chem,1994，269(42): 26066
(收稿日期:1999-06-25), http://www.100md.com