慢性肝病和肝癌中丙型肝炎病毒感染的病理学研究
作者：马韵 邓卓霖 罗虹 丁志敏 阮伶
单位：广西医科大学病理学教研室 南宁 530021
关键词：丙型肝炎病毒；肝细胞癌；肝炎
广西医科大学学报990403
摘要 目的：研究广西肝细胞癌(HCC)及慢性肝病病变组织中丙型肝炎病毒(HCV)感染状况。探讨HCV 感染在肝癌发病中的地位。方法：用免疫组化SP法，检查201例病变肝组织中丙肝病毒核心区抗原(Hepatitis C Core Antigen，HCAg)和乙肝病毒表面抗原(HBsAg)，分析各种肝脏病变中HCV的感染状况及其与病变程度的关系。结果：116例HCC和85例慢性肝病中的HCV感染率分别是44.8%和28.2%。肝癌病例中HCV感染80.8 %是以与HBV双重感染的形式存在，单一与HCV相关的HCC仅占全部病例的8.4%。伴有HCV感染的病例，癌旁肝组织中炎症较明显。结论：HCV感染虽非HCC的主要发病因素，HCV引起肝细胞损伤，增加肝细胞对HBV 及其它致癌因素如黄曲霉毒素的敏感性，加快肝癌发生进程。故控制HCV感染，可能降低肝癌的发病率。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 R512.6；R735.7
HISTOPATHOLOGY OF HEPATITIS C VIRUS INFECTION IN HEPATOCELLULAR CARCINOMA AND CHRONIC HEPATOPATHY
Ma Yun,Deng Zhuolin,Luo Hong,et al
(Department of pathology,Guangxi Medical University,Nanning 530021)
Abstract Objective:To investigate the frequency of Hepatitis C virus (HCV) infection in hepatocellular carcinoma(HCC) and chronic hepatopathy in Guangxi.Method:116 cases of HCC and 85 cases of chronic hepatitis and cirrhosis were studied.The HCV core antigen and HBsAg were detected in formalin fixed and paraffin embedded tissues by streptavidin peroxdase conjugated method.Results:The positive rates of HCV in HCC and chronic hepatopathy were 44.8% and 28.2%,respectively,meanwhile HBsAg positive rates in those same cases were 80.2% and 83.5%.Most of HCV positive cases (80.8%) showed co-infection with HBV,only 8.4% of HCC cases were sololy associated with HCV infection.The inflammation activity was more severe in liver tissues when both HBV and HCV were present in hepatocytes.Conclusion:In these prevalent areas of HBV infection and risky regions of HCC,HCV has not become the main and sole etiogenic,neither is it a rare phenomenon.HCV damages hepatocytes,and may enhance the carcinogenesis of HBV and/or aflatoxin B1.
, 百拇医药
Key words hepatitis C virus；hepatocellular carcinoma；histopathology
近年来，HCV感染与HCC之间的关系逐渐受到各国学者的关注。在HBV感染率低的地区如日本，其肝癌病例中76%有抗HCV抗体[1]，HCV与HCC的发生密切相关。我国为HBV感染流行区，HBV与肝癌发生之间的密切关系已从各方面得到证实。有关HCV与HCC之间的关系亦见诸多报道，但多数是用间接的方法检测HCC及对照组血清抗HCV抗体，且各地检测结果不尽一致。HCV的致癌机制尚不明确。我们用免疫组化方法直接检测肝组织中HCV抗原，观察在各种类型肝病中HCV的感染状况及其与病变的相互关系，从组织学角度探索HCV致肝癌的可能机理。
1 材料与方法
1.1 标本来源：病变肝组织201例，其中116例肝细胞癌为外科手术切除标本，均含癌及癌旁肝组织，45例肝硬化病例中，20例为尸检，余为外科手术切除标本；40例慢性肝炎为肝脏穿刺组织标本；所有标本均经中性福尔马林固定，石蜡包埋，各切5μm厚连续切片，分别进行HE、Masson染色及免疫组化染色。
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1.2 免疫组化染色：免疫组化染色用SP法。SP试剂盒及HBsAg一抗为Maxim产品；按常规操作。抗HCV-C区的单克隆抗体由中国药品生物制品检定所提供。染色主要步骤如下：切片脱蜡至水，质量浓度为3%H2O2甲醇30 min；微波抗原修复；体积分数为0.5%胰酶37℃消化10 min，加一抗(1∶100)室温1 h后置4℃过夜；以后步骤按SP试剂盒说明操作。DAB显色，苏木素复染。
1.3 对照：空白对照用PBS代替一抗。
1.4 统计学处理：χ2 检验，用华西医科大学PEMS统计软件包进行数据处理。
2 结 果
2.1 HCC临床及病理资料分析：116例HCC中，男95例，女21例。癌旁病变分别为肝硬化、慢性活动性肝炎和慢性持续性肝炎。癌旁组织中肝炎病毒抗原表达状况见表1。其中HCV阳性病例为52/116(44.8%)；将HCV阳性组与HB&HC阳性组合并，并与HBV阳性组比较，当有HCV感染时，癌旁病变类型表现为病变较重的慢活肝或肝硬化(P<0.05)；同样，在癌旁肝硬化病例组中，HCAg阳性病例假小叶中肝细胞变性、坏死明显，间隔中淋巴细胞数量较多和(或)淋巴滤泡形成，并有胆管破坏现象(P<0.01)，见表2。
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表1 不同抗原标志组HCC临床和病理资料 组别
n
平均年
龄(岁)
癌旁病变(例)
慢持肝
慢活肝
肝硬化
HCV阳性组
10
48.7
4
6
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HBV阳性组
51
45.3
7
16
28
HB&HC阳性组
42
42.4
11
31
HB&HC阴性组
13
, 百拇医药
45.1
1
5
7
合 计
116
44.45
8
36
72
注：将HCV组与HB&HC阳性组合并，与HBV阳性组比较，χ2=8.269 5，P=0.016 0，即HCV感染状态对癌旁病变构成有影响表2 丙肝病毒抗原在癌旁肝硬化中的分布(例，%) 组别
, 百拇医药
n
肝硬化活动期
HCV阳性
37
23(62.2)
HCV阴性
35
11(31.4)
合 计
72
34
χ2=6.816 6,P=0.009 0
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2.2 HCAg在癌旁肝中的分布：HCAg位于肝细胞浆内，可呈：①局限于胞浆的一部分，界限较清楚；②散在的细颗粒状均匀分布于胞浆；③聚集在胞膜下或核周；不同形式常混合存在。偶见肝细胞核内有阳性物质表达。HCAg阳性的肝细胞在小叶内多呈散在分布，各小叶内阳性细胞数量不均衡，但小叶周边区及被炎症细胞包绕或分割的肝细胞内常见HCAg存在。10.3%(12/116)同时在癌组织中检出HCAg。
2.3 慢性肝病中肝炎病毒抗原的表达状况见表3。HBsAg阳性83.5%(71/85)，HCAg阳性28.2%(24/85)，其中79.2%(19例)合并乙肝病毒感染。
表3 肝炎病毒抗原在各型慢性肝病中的分布(例) 组 别
n
慢持肝
慢活肝
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肝硬化
HCV阳性组
5
1
4
HBV阳性组
52
6
21
25
HB&HC阳性组
19
9
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10
HB&HC阴性组
9
3
6
合 计
85
6
34
45
2.4 空白对照未见阳性物质表达。3 讨 论
已往大量研究已证实广西肝癌高发与HBV感染以及黄曲霉毒素高污染有密切关系。自90年代起，陆续有人研究HCC中HCV感染的问题。张振权等[2]检测78例HCC中血清抗HCV抗体，阳性率为33.3%。我们前期在52例HCC组织中检测HCAg的表达，阳性率为15.4%[3]。进一步的研究发现HCC病例中，HCV在癌旁肝的检出率高于癌组织，且阳性物质染色较深，易于判断结果，故本研究全部采用有足够癌旁肝的病例进行研究，结果HCV的检出率显著提高，癌旁肝组织中HCV感染率为44.8%，HBV感染率为80.2%，肝癌病例中有HBV和(或)HCV感染者占88.80%(103/116)，显示出这两种肝炎病毒感染是目前肝癌发生的最重要因素，其中又以HBV的感染居主导地位。HCV感染大多数(80.8%)是以与HBV双重感染的形式存在，单一与HCV相关的肝癌仅占病例的8.4%,与王春杰等[4]的研究结果类似。这说明在HBV感染流行区内，单独HCV感染尚未成为HCC发病的主要因素。但随着乙肝疫苗的广泛接种，HBV感染率将有可能逐步下降，而目前制备HCV疫苗仍有较大困难，感染HCV人数有可能增加，将来HCV与HCC之间的关系会比目前突出。
, 百拇医药
到目前为止，尚未有确切的迹象表明HCV基因组可以整合入人的基因组，也没有足够的证据显示HCV有任何已知的癌基因活性。HCV也不能激活癌基因或灭活抑癌基因。HCV感染可引起肝细胞损伤，本研究发现单一或合并HCV感染的病例，无论肝癌抑或是慢性肝病，其肝脏病变均为较严重的慢活肝或活动性肝硬化，而无一例慢持肝。含HCV抗原的肝细胞常坏死或变性，其周围常有淋巴细胞浸润。且病变严重程度与病毒数量相关，与Kato和Hiramatsu的观察结果一致[5，6]；有HCAg表达的癌旁肝硬化病例，其淋巴滤泡形成多于无HCAg表达者，这些现象提示HCV感染易导致肝细胞损伤并激发免疫反应。在病毒和免疫反应的双重攻击下，肝组织病变易于慢性进行性发展以至形成肝硬变。由于HCV属RNA病毒，难以通过整合改变细胞基因组，且感染HCV后的肝细胞往往受免疫攻击而坏死，因此其出现传代性基因突变的可能性小于感染HBV者；此外我们观察到在不典型增生的肝细胞以及癌细胞内，较少表达HCAg或表达的抗原浓度较低，显示出HCV的蛋白产物可能无直接刺激细胞增生的作用，这些现象表明HCV在肝癌发生过程中很可能作为一促发因素，如引起肝细胞损伤，使基因组对其它致癌物的敏感性增高。
, 百拇医药
我们前期的研究已揭示影响本地肝癌发病率的首要因素为黄曲霉毒素[7]。但流行病学调查结果显示，HBV和HCV双重感染者患HCC的危险性明显高于单一HBV或HCV感染者[8]，本研究也发现HBV和HCV双重感染较单一HCV感染者，HCC的平均年龄较低。由此可见，HCV可加快HBV或其它致癌因素的致癌进程。预防和治疗HCV感染，将成为降低肝癌发病率的一个重要措施。
参考文献
1 Kaneko S,Masashi V,Masaya T,et al.The role of hepatitis C virus in hepatocellular carcinomar in Japen.Intervirology，1994,37:108
2 张振权，周桂英，黄天壬，等.丙型肝炎病毒感染与原发性肝癌关系的病例-对照研究.中华肿瘤杂志，1994，16(5):327～329
, 百拇医药
3 邓卓霖，马 韵，郎淑慧，等.广西肝细胞癌与丙型肝炎病毒的关系.广西科学，1996，3(4)：38～39
4 王春杰，王文亮，王伯云.肝硬变和肝癌组织内HCV RNA及HBV X基因的存在及意义.癌症，1996，15(2)：99～101
5 Kato N,Yokosuka O,Hosoda K,et al.Quantification of hepatitis C virus by competitive reverse transcription polymerase chain reaction:Increase of the virus in advanced liver disease.Hepatology,1993，18:16～20
6 Hiramatsu N,Hayashi N,Haruna Y,et al.Immunohistochemical detection of hepatitis C virus infected hepacytes in chronic liver disease with monoclonal antibodies to core,envelope and NS3 regions of the hepatitis C virus genome Hepatology，1992，16(2)306～311
7 邓卓霖,马 韵,潘朗星，等.肝细胞癌P53基因特异点突变的分子流行病学意义.中国癌症杂志，1997，7(3)：155～157
8 俞顺章，资小林，陈 刚，等.我国四个地区肝炎病毒感染与肝癌的病例对照研究.中华流行病学杂志，1997，18(4):214～216
收稿日期：1998-10-12, 百拇医药
单位：广西医科大学病理学教研室 南宁 530021
关键词：丙型肝炎病毒；肝细胞癌；肝炎
广西医科大学学报990403
摘要 目的：研究广西肝细胞癌(HCC)及慢性肝病病变组织中丙型肝炎病毒(HCV)感染状况。探讨HCV 感染在肝癌发病中的地位。方法：用免疫组化SP法，检查201例病变肝组织中丙肝病毒核心区抗原(Hepatitis C Core Antigen，HCAg)和乙肝病毒表面抗原(HBsAg)，分析各种肝脏病变中HCV的感染状况及其与病变程度的关系。结果：116例HCC和85例慢性肝病中的HCV感染率分别是44.8%和28.2%。肝癌病例中HCV感染80.8 %是以与HBV双重感染的形式存在，单一与HCV相关的HCC仅占全部病例的8.4%。伴有HCV感染的病例，癌旁肝组织中炎症较明显。结论：HCV感染虽非HCC的主要发病因素，HCV引起肝细胞损伤，增加肝细胞对HBV 及其它致癌因素如黄曲霉毒素的敏感性，加快肝癌发生进程。故控制HCV感染，可能降低肝癌的发病率。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 R512.6；R735.7
HISTOPATHOLOGY OF HEPATITIS C VIRUS INFECTION IN HEPATOCELLULAR CARCINOMA AND CHRONIC HEPATOPATHY
Ma Yun,Deng Zhuolin,Luo Hong,et al
(Department of pathology,Guangxi Medical University,Nanning 530021)
Abstract Objective:To investigate the frequency of Hepatitis C virus (HCV) infection in hepatocellular carcinoma(HCC) and chronic hepatopathy in Guangxi.Method:116 cases of HCC and 85 cases of chronic hepatitis and cirrhosis were studied.The HCV core antigen and HBsAg were detected in formalin fixed and paraffin embedded tissues by streptavidin peroxdase conjugated method.Results:The positive rates of HCV in HCC and chronic hepatopathy were 44.8% and 28.2%,respectively,meanwhile HBsAg positive rates in those same cases were 80.2% and 83.5%.Most of HCV positive cases (80.8%) showed co-infection with HBV,only 8.4% of HCC cases were sololy associated with HCV infection.The inflammation activity was more severe in liver tissues when both HBV and HCV were present in hepatocytes.Conclusion:In these prevalent areas of HBV infection and risky regions of HCC,HCV has not become the main and sole etiogenic,neither is it a rare phenomenon.HCV damages hepatocytes,and may enhance the carcinogenesis of HBV and/or aflatoxin B1.
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Key words hepatitis C virus；hepatocellular carcinoma；histopathology
近年来，HCV感染与HCC之间的关系逐渐受到各国学者的关注。在HBV感染率低的地区如日本，其肝癌病例中76%有抗HCV抗体[1]，HCV与HCC的发生密切相关。我国为HBV感染流行区，HBV与肝癌发生之间的密切关系已从各方面得到证实。有关HCV与HCC之间的关系亦见诸多报道，但多数是用间接的方法检测HCC及对照组血清抗HCV抗体，且各地检测结果不尽一致。HCV的致癌机制尚不明确。我们用免疫组化方法直接检测肝组织中HCV抗原，观察在各种类型肝病中HCV的感染状况及其与病变的相互关系，从组织学角度探索HCV致肝癌的可能机理。
1 材料与方法
1.1 标本来源：病变肝组织201例，其中116例肝细胞癌为外科手术切除标本，均含癌及癌旁肝组织，45例肝硬化病例中，20例为尸检，余为外科手术切除标本；40例慢性肝炎为肝脏穿刺组织标本；所有标本均经中性福尔马林固定，石蜡包埋，各切5μm厚连续切片，分别进行HE、Masson染色及免疫组化染色。
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1.2 免疫组化染色：免疫组化染色用SP法。SP试剂盒及HBsAg一抗为Maxim产品；按常规操作。抗HCV-C区的单克隆抗体由中国药品生物制品检定所提供。染色主要步骤如下：切片脱蜡至水，质量浓度为3%H2O2甲醇30 min；微波抗原修复；体积分数为0.5%胰酶37℃消化10 min，加一抗(1∶100)室温1 h后置4℃过夜；以后步骤按SP试剂盒说明操作。DAB显色，苏木素复染。
1.3 对照：空白对照用PBS代替一抗。
1.4 统计学处理：χ2 检验，用华西医科大学PEMS统计软件包进行数据处理。
2 结 果
2.1 HCC临床及病理资料分析：116例HCC中，男95例，女21例。癌旁病变分别为肝硬化、慢性活动性肝炎和慢性持续性肝炎。癌旁组织中肝炎病毒抗原表达状况见表1。其中HCV阳性病例为52/116(44.8%)；将HCV阳性组与HB&HC阳性组合并，并与HBV阳性组比较，当有HCV感染时，癌旁病变类型表现为病变较重的慢活肝或肝硬化(P<0.05)；同样，在癌旁肝硬化病例组中，HCAg阳性病例假小叶中肝细胞变性、坏死明显，间隔中淋巴细胞数量较多和(或)淋巴滤泡形成，并有胆管破坏现象(P<0.01)，见表2。
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表1 不同抗原标志组HCC临床和病理资料 组别
n
平均年
龄(岁)
癌旁病变(例)
慢持肝
慢活肝
肝硬化
HCV阳性组
10
48.7
4
6
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HBV阳性组
51
45.3
7
16
28
HB&HC阳性组
42
42.4
11
31
HB&HC阴性组
13
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45.1
1
5
7
合 计
116
44.45
8
36
72
注：将HCV组与HB&HC阳性组合并，与HBV阳性组比较，χ2=8.269 5，P=0.016 0，即HCV感染状态对癌旁病变构成有影响表2 丙肝病毒抗原在癌旁肝硬化中的分布(例，%) 组别
, 百拇医药
n
肝硬化活动期
HCV阳性
37
23(62.2)
HCV阴性
35
11(31.4)
合 计
72
34
χ2=6.816 6,P=0.009 0
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2.2 HCAg在癌旁肝中的分布：HCAg位于肝细胞浆内，可呈：①局限于胞浆的一部分，界限较清楚；②散在的细颗粒状均匀分布于胞浆；③聚集在胞膜下或核周；不同形式常混合存在。偶见肝细胞核内有阳性物质表达。HCAg阳性的肝细胞在小叶内多呈散在分布，各小叶内阳性细胞数量不均衡，但小叶周边区及被炎症细胞包绕或分割的肝细胞内常见HCAg存在。10.3%(12/116)同时在癌组织中检出HCAg。
2.3 慢性肝病中肝炎病毒抗原的表达状况见表3。HBsAg阳性83.5%(71/85)，HCAg阳性28.2%(24/85)，其中79.2%(19例)合并乙肝病毒感染。
表3 肝炎病毒抗原在各型慢性肝病中的分布(例) 组 别
n
慢持肝
慢活肝
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肝硬化
HCV阳性组
5
1
4
HBV阳性组
52
6
21
25
HB&HC阳性组
19
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HB&HC阴性组
9
3
6
合 计
85
6
34
45
2.4 空白对照未见阳性物质表达。3 讨 论
已往大量研究已证实广西肝癌高发与HBV感染以及黄曲霉毒素高污染有密切关系。自90年代起，陆续有人研究HCC中HCV感染的问题。张振权等[2]检测78例HCC中血清抗HCV抗体，阳性率为33.3%。我们前期在52例HCC组织中检测HCAg的表达，阳性率为15.4%[3]。进一步的研究发现HCC病例中，HCV在癌旁肝的检出率高于癌组织，且阳性物质染色较深，易于判断结果，故本研究全部采用有足够癌旁肝的病例进行研究，结果HCV的检出率显著提高，癌旁肝组织中HCV感染率为44.8%，HBV感染率为80.2%，肝癌病例中有HBV和(或)HCV感染者占88.80%(103/116)，显示出这两种肝炎病毒感染是目前肝癌发生的最重要因素，其中又以HBV的感染居主导地位。HCV感染大多数(80.8%)是以与HBV双重感染的形式存在，单一与HCV相关的肝癌仅占病例的8.4%,与王春杰等[4]的研究结果类似。这说明在HBV感染流行区内，单独HCV感染尚未成为HCC发病的主要因素。但随着乙肝疫苗的广泛接种，HBV感染率将有可能逐步下降，而目前制备HCV疫苗仍有较大困难，感染HCV人数有可能增加，将来HCV与HCC之间的关系会比目前突出。
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到目前为止，尚未有确切的迹象表明HCV基因组可以整合入人的基因组，也没有足够的证据显示HCV有任何已知的癌基因活性。HCV也不能激活癌基因或灭活抑癌基因。HCV感染可引起肝细胞损伤，本研究发现单一或合并HCV感染的病例，无论肝癌抑或是慢性肝病，其肝脏病变均为较严重的慢活肝或活动性肝硬化，而无一例慢持肝。含HCV抗原的肝细胞常坏死或变性，其周围常有淋巴细胞浸润。且病变严重程度与病毒数量相关，与Kato和Hiramatsu的观察结果一致[5，6]；有HCAg表达的癌旁肝硬化病例，其淋巴滤泡形成多于无HCAg表达者，这些现象提示HCV感染易导致肝细胞损伤并激发免疫反应。在病毒和免疫反应的双重攻击下，肝组织病变易于慢性进行性发展以至形成肝硬变。由于HCV属RNA病毒，难以通过整合改变细胞基因组，且感染HCV后的肝细胞往往受免疫攻击而坏死，因此其出现传代性基因突变的可能性小于感染HBV者；此外我们观察到在不典型增生的肝细胞以及癌细胞内，较少表达HCAg或表达的抗原浓度较低，显示出HCV的蛋白产物可能无直接刺激细胞增生的作用，这些现象表明HCV在肝癌发生过程中很可能作为一促发因素，如引起肝细胞损伤，使基因组对其它致癌物的敏感性增高。
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我们前期的研究已揭示影响本地肝癌发病率的首要因素为黄曲霉毒素[7]。但流行病学调查结果显示，HBV和HCV双重感染者患HCC的危险性明显高于单一HBV或HCV感染者[8]，本研究也发现HBV和HCV双重感染较单一HCV感染者，HCC的平均年龄较低。由此可见，HCV可加快HBV或其它致癌因素的致癌进程。预防和治疗HCV感染，将成为降低肝癌发病率的一个重要措施。
参考文献
1 Kaneko S,Masashi V,Masaya T,et al.The role of hepatitis C virus in hepatocellular carcinomar in Japen.Intervirology，1994,37:108
2 张振权，周桂英，黄天壬，等.丙型肝炎病毒感染与原发性肝癌关系的病例-对照研究.中华肿瘤杂志，1994，16(5):327～329
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3 邓卓霖，马 韵，郎淑慧，等.广西肝细胞癌与丙型肝炎病毒的关系.广西科学，1996，3(4)：38～39
4 王春杰，王文亮，王伯云.肝硬变和肝癌组织内HCV RNA及HBV X基因的存在及意义.癌症，1996，15(2)：99～101
5 Kato N,Yokosuka O,Hosoda K,et al.Quantification of hepatitis C virus by competitive reverse transcription polymerase chain reaction:Increase of the virus in advanced liver disease.Hepatology,1993，18:16～20
6 Hiramatsu N,Hayashi N,Haruna Y,et al.Immunohistochemical detection of hepatitis C virus infected hepacytes in chronic liver disease with monoclonal antibodies to core,envelope and NS3 regions of the hepatitis C virus genome Hepatology，1992，16(2)306～311
7 邓卓霖,马 韵,潘朗星，等.肝细胞癌P53基因特异点突变的分子流行病学意义.中国癌症杂志，1997，7(3)：155～157
8 俞顺章，资小林，陈 刚，等.我国四个地区肝炎病毒感染与肝癌的病例对照研究.中华流行病学杂志，1997，18(4):214～216
收稿日期：1998-10-12, 百拇医药