ELISA测定Alzheimer病患者脑脊液中tau蛋白的含量
作者：王 磊 袁锦楣 郝洪军 李海峰 金弘敏 冀成君
单位：王 磊 100034 北京医科大学第一医院神经科免疫室；袁锦楣 郝洪军 李海峰；金弘敏 翼成君 北京回龙观医院老年科
关键词：
中华皮肤科杂志990421
系统性红斑狼疮(SLE)的主要死亡原因之一是狼疮肾炎，目前以皮质类固醇和免疫抑制剂为主要治疗手段，但两者均有严重的不良反应。故有必要探讨新的有效而不良反应较轻的治疗手段。我们应用单味大黄、黄芪和两药混合剂治疗BXSB小鼠，观察相关实验室指标的变化，以了解两药单用或混合应用对鼠SLE的治疗作用和对人类SLE的应用前景。
一、材料和方法
(一)材料：
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1.实验材料：选择2月龄BXSB雄鼠36只，体重18～22g。北京医科大学附属第三医院陈学荣教授惠赠，饲养在本院动物室层流柜中。
2.药物：①中药：大黄(RheumPalmatumL)产于甘肃，黄芪(AstragalusmongholicusBunge)产于内蒙古。两药均在本实验室自制成煎剂。煎制方法采用传统中药煎制法[1]。配制黄芪煎剂(相当1g/mL生药黄芪)，大黄煎剂(相当1g/mL生药大黄)，混合煎剂(相当生药黄芪1g/mL，大黄0.5g/mL)置于4℃冰箱中保存备用。②地塞米松(DXM)注射剂：扬州制药厂生产。③环磷酰胺(CTX)注射剂：天津金世化工制药有限公司生产。
3.试剂：①考马斯亮蓝：美国Fluka公司生产。②标准白蛋白：武汉生物制品研究所免疫室提供。③FITC标记的羊抗鼠IgG：武汉生物制品研究所免疫室提供。④0.01mol/L磷酸缓冲液(PBS)。
, 百拇医药
4.仪器设备：精密天平，721分光光度计，水浴箱，荧光显微镜，鲍金7000生化自动分析仪。
(二)方法：
1.给药方法：BXSB雄鼠36只，随机分成6组，每组6只。第1组：黄芪组；第2组：大黄组；第3组：混合剂组；第4组：地塞米松组；第5组：环磷酰胺组；第6组：空白对照组，给予等量生理盐水灌胃和等量注射用水腹腔注射，每日1次，上述各组连续用药3个月。
2.实验室指标检测：尿蛋白含量：用尿蛋白定量考马斯亮蓝染料法检测；血清抗核抗体(ANA)：间接免疫荧光法检测；血清尿素氮(BUN)和血肌酐(sCr)水平：酶法在鲍金生化自动分析仪上检测；肾脏免疫病理及观察：新鲜小鼠肾脏冰冻切片后，直接免疫荧光法观察肾脏免疫沉积情况。
二、结果
1.尿蛋白含量检测：见表1。5月龄BXSB雄鼠肾功能明显异常，与对照组比较中药能减轻其损害(P<0.01)，且中药各组与地塞米松组和CTX组间差异无显著性0.05)。
, 百拇医药
表1 BXSB小鼠尿蛋白含量、血清ANA水平检测结果(6只)
组别
剂量(g·kg-1·d-1×90d)
途径
尿蛋白量(mg/L)
血清ANA水平
±st
t值±st
t值
黄芪组
, 百拇医药
1.8
灌胃
1492.9±66.7
22.45*
1.230±0.316
3.98*
大黄组
0.6
灌胃
1811.6±654.1
3.01*
1.178±0.246
, 百拇医药
4.97*
混合组
1.7
灌胃
1542.5±333.3
4.76*
1.129±0.296
3.91*
地塞米松组
0.001
腹腔注射
1645.8±236.6
, 百拇医药 6.98*
0.778±0.301
2.85**
环磷酰胺组
0.025
腹腔注射
1667.0±201.8
8.76*
1.230±0.252
4.89*
空白对照组
-
, http://www.100md.com -
3227.6±655.0
-
1.899±0.517
-
注：与空白对照组比较，*P<0.01,**P<0.05；各用药组两两比较，差异均无显著性。血清ANA水平值为其滴度的对数
2.血清ANA水平检测：见表1。5月龄BXSB雄鼠免疫系统明显异常，而中药、地塞米松、CTX均显著降低ANA水平(P<0.05)，且各用药组间差异无显著性0.05)。
3.血清BUN和sCr水平：见表2。5月龄BXSB雄鼠肾功能损害明显，而中药、地塞米松、CTX均对肾功能有显著改善作用(P<0.05)，且各用药组间差异无显著性0.05)。
, 百拇医药
表2 BXSB小鼠血清尿素氮和血肌酐水平(6只)
组别
剂量(g·kg-1·d-1×90d)
途径
尿素氮(mmol/L)
血肌酐(umol/L)±st
t值±st
t值
黄芪组
, http://www.100md.com
1.8
灌胃
6.42±1.26
5.20
76.19±21.40
3.65*
大黄组
0.6
灌胃
6.83±1.26
5.62**
93.28±11.24
, 百拇医药
8.68*
混合组
1.7
灌胃
6.96±0.14
49.98**
68.39±3.06
22.53*
地塞米松组
0.001
腹腔注射
5.89±0.79
, http://www.100md.com
7.64**
96.40±12.54
7.96*
环磷酰胺组
0.025
腹腔注射
5.99±0.86
7.16**
111.30±12.40
8.96*
空白对照组
-
, 百拇医药
-
8.84±1.35
-
145.44±17.40
-
注：与空白对照组比较，*P<0.01,**P<0.05；各用药组两两比较，差异均无显著性。
4.肾脏免疫病理：6只5月龄BXSB雄鼠肾脏免疫复合物(IC)沉积明显，除黄芪组、CTX组6只中5只阳性外，另4组每组6只均阳性，荧光强度+～+++，但对照组荧光强度+++～++++。肾小球系膜区呈片状荧光，毛细血管壁呈点线状荧光，其荧光强度和累及范围高于用药组。说明5月龄BXSB小鼠肾组织呈明显的免疫复合物性肾炎，而药物在一定程度上减轻肾组织IC沉积。且各用药组间荧光强度经秩和检验差异无显著性(P>0.05)。
, 百拇医药
三、讨论
国外学者已用MRL/Lpr和NZB/NZWF1狼疮鼠模型[2]研究了CTX、皮质类固醇对SLE的治疗效果，证实能显著减少TNF-α的量和IL-1βmRNA水平而改善肾损害。也有报道[3]CTX用于人类肾炎的治疗，疗效明显。已证实[4，5]，大黄、黄芪对机体免疫调节具有双向性，大剂量抑制机体免疫功能，小剂量则增强机体免疫功能。基于上述研究，我们选用大黄、黄芪及其混合剂治疗以免疫调节异常为发病原因的SLE疾病。本实验提示：中药大黄、黄芪在一定条件下，可改善SLE模型BXSB小鼠的实验室指标，同时肾脏免疫病理结果显示5月龄BXSB小鼠有明显的免疫复合物沉积导致的肾小球肾炎，说明鼠SLE的发病机理可能为免疫调节紊乱所致免疫复合物形成。
参考文献
1 王景先.影响汤剂药物有效成分诸因素探析.北京中医,1995，2:38-39.
, 百拇医药
2 Kiberd BA, Yong ID. Modulation of glomerular structure and function in murine lupus nephritis by methylprednisolone and cyclophosphamide. J Lab Med, 1994,124:496- 503.
3 尹广,黎磊石.大剂量环磷酰胺静脉注射治疗狼疮肾炎.中华肾脏病杂志,1994,10:310-313.
4 张京玲,胡萍,白凤菊,等.大承气汤及大黄对小鼠体液免疫功能影响的初探.中国实验临床免疫学杂志,1996,8:32-35.
5 邵启祥,徐苏红,夏圣，等.黄芪对小鼠体液免疫功能的调节作用.中国实验临床免疫学杂志，1996，8:48-50.
收稿：1998-08-04修回：1999-03-08, 百拇医药
单位：王 磊 100034 北京医科大学第一医院神经科免疫室；袁锦楣 郝洪军 李海峰；金弘敏 翼成君 北京回龙观医院老年科
关键词：
中华皮肤科杂志990421
系统性红斑狼疮(SLE)的主要死亡原因之一是狼疮肾炎，目前以皮质类固醇和免疫抑制剂为主要治疗手段，但两者均有严重的不良反应。故有必要探讨新的有效而不良反应较轻的治疗手段。我们应用单味大黄、黄芪和两药混合剂治疗BXSB小鼠，观察相关实验室指标的变化，以了解两药单用或混合应用对鼠SLE的治疗作用和对人类SLE的应用前景。
一、材料和方法
(一)材料：
, http://www.100md.com
1.实验材料：选择2月龄BXSB雄鼠36只，体重18～22g。北京医科大学附属第三医院陈学荣教授惠赠，饲养在本院动物室层流柜中。
2.药物：①中药：大黄(RheumPalmatumL)产于甘肃，黄芪(AstragalusmongholicusBunge)产于内蒙古。两药均在本实验室自制成煎剂。煎制方法采用传统中药煎制法[1]。配制黄芪煎剂(相当1g/mL生药黄芪)，大黄煎剂(相当1g/mL生药大黄)，混合煎剂(相当生药黄芪1g/mL，大黄0.5g/mL)置于4℃冰箱中保存备用。②地塞米松(DXM)注射剂：扬州制药厂生产。③环磷酰胺(CTX)注射剂：天津金世化工制药有限公司生产。
3.试剂：①考马斯亮蓝：美国Fluka公司生产。②标准白蛋白：武汉生物制品研究所免疫室提供。③FITC标记的羊抗鼠IgG：武汉生物制品研究所免疫室提供。④0.01mol/L磷酸缓冲液(PBS)。
, 百拇医药
4.仪器设备：精密天平，721分光光度计，水浴箱，荧光显微镜，鲍金7000生化自动分析仪。
(二)方法：
1.给药方法：BXSB雄鼠36只，随机分成6组，每组6只。第1组：黄芪组；第2组：大黄组；第3组：混合剂组；第4组：地塞米松组；第5组：环磷酰胺组；第6组：空白对照组，给予等量生理盐水灌胃和等量注射用水腹腔注射，每日1次，上述各组连续用药3个月。
2.实验室指标检测：尿蛋白含量：用尿蛋白定量考马斯亮蓝染料法检测；血清抗核抗体(ANA)：间接免疫荧光法检测；血清尿素氮(BUN)和血肌酐(sCr)水平：酶法在鲍金生化自动分析仪上检测；肾脏免疫病理及观察：新鲜小鼠肾脏冰冻切片后，直接免疫荧光法观察肾脏免疫沉积情况。
二、结果
1.尿蛋白含量检测：见表1。5月龄BXSB雄鼠肾功能明显异常，与对照组比较中药能减轻其损害(P<0.01)，且中药各组与地塞米松组和CTX组间差异无显著性0.05)。
, 百拇医药
表1 BXSB小鼠尿蛋白含量、血清ANA水平检测结果(6只)
组别
剂量(g·kg-1·d-1×90d)
途径
尿蛋白量(mg/L)
血清ANA水平
±stt值
±stt值
黄芪组
, 百拇医药
1.8
灌胃
1492.9±66.7
22.45*
1.230±0.316
3.98*
大黄组
0.6
灌胃
1811.6±654.1
3.01*
1.178±0.246
, 百拇医药
4.97*
混合组
1.7
灌胃
1542.5±333.3
4.76*
1.129±0.296
3.91*
地塞米松组
0.001
腹腔注射
1645.8±236.6
, 百拇医药 6.98*
0.778±0.301
2.85**
环磷酰胺组
0.025
腹腔注射
1667.0±201.8
8.76*
1.230±0.252
4.89*
空白对照组
-
, http://www.100md.com -
3227.6±655.0
-
1.899±0.517
-
注：与空白对照组比较，*P<0.01,**P<0.05；各用药组两两比较，差异均无显著性。血清ANA水平值为其滴度的对数
2.血清ANA水平检测：见表1。5月龄BXSB雄鼠免疫系统明显异常，而中药、地塞米松、CTX均显著降低ANA水平(P<0.05)，且各用药组间差异无显著性0.05)。
3.血清BUN和sCr水平：见表2。5月龄BXSB雄鼠肾功能损害明显，而中药、地塞米松、CTX均对肾功能有显著改善作用(P<0.05)，且各用药组间差异无显著性0.05)。
, 百拇医药
表2 BXSB小鼠血清尿素氮和血肌酐水平(6只)
组别
剂量(g·kg-1·d-1×90d)
途径
尿素氮(mmol/L)
血肌酐(umol/L)
±stt值
±stt值
黄芪组
, http://www.100md.com
1.8
灌胃
6.42±1.26
5.20
76.19±21.40
3.65*
大黄组
0.6
灌胃
6.83±1.26
5.62**
93.28±11.24
, 百拇医药
8.68*
混合组
1.7
灌胃
6.96±0.14
49.98**
68.39±3.06
22.53*
地塞米松组
0.001
腹腔注射
5.89±0.79
, http://www.100md.com
7.64**
96.40±12.54
7.96*
环磷酰胺组
0.025
腹腔注射
5.99±0.86
7.16**
111.30±12.40
8.96*
空白对照组
-
, 百拇医药
-
8.84±1.35
-
145.44±17.40
-
注：与空白对照组比较，*P<0.01,**P<0.05；各用药组两两比较，差异均无显著性。
4.肾脏免疫病理：6只5月龄BXSB雄鼠肾脏免疫复合物(IC)沉积明显，除黄芪组、CTX组6只中5只阳性外，另4组每组6只均阳性，荧光强度+～+++，但对照组荧光强度+++～++++。肾小球系膜区呈片状荧光，毛细血管壁呈点线状荧光，其荧光强度和累及范围高于用药组。说明5月龄BXSB小鼠肾组织呈明显的免疫复合物性肾炎，而药物在一定程度上减轻肾组织IC沉积。且各用药组间荧光强度经秩和检验差异无显著性(P>0.05)。
, 百拇医药
三、讨论
国外学者已用MRL/Lpr和NZB/NZWF1狼疮鼠模型[2]研究了CTX、皮质类固醇对SLE的治疗效果，证实能显著减少TNF-α的量和IL-1βmRNA水平而改善肾损害。也有报道[3]CTX用于人类肾炎的治疗，疗效明显。已证实[4，5]，大黄、黄芪对机体免疫调节具有双向性，大剂量抑制机体免疫功能，小剂量则增强机体免疫功能。基于上述研究，我们选用大黄、黄芪及其混合剂治疗以免疫调节异常为发病原因的SLE疾病。本实验提示：中药大黄、黄芪在一定条件下，可改善SLE模型BXSB小鼠的实验室指标，同时肾脏免疫病理结果显示5月龄BXSB小鼠有明显的免疫复合物沉积导致的肾小球肾炎，说明鼠SLE的发病机理可能为免疫调节紊乱所致免疫复合物形成。
参考文献
1 王景先.影响汤剂药物有效成分诸因素探析.北京中医,1995，2:38-39.
, 百拇医药
2 Kiberd BA, Yong ID. Modulation of glomerular structure and function in murine lupus nephritis by methylprednisolone and cyclophosphamide. J Lab Med, 1994,124:496- 503.
3 尹广,黎磊石.大剂量环磷酰胺静脉注射治疗狼疮肾炎.中华肾脏病杂志,1994,10:310-313.
4 张京玲,胡萍,白凤菊,等.大承气汤及大黄对小鼠体液免疫功能影响的初探.中国实验临床免疫学杂志,1996,8:32-35.
5 邵启祥,徐苏红,夏圣，等.黄芪对小鼠体液免疫功能的调节作用.中国实验临床免疫学杂志，1996，8:48-50.
收稿：1998-08-04修回：1999-03-08, 百拇医药