抗伤寒杆菌Fe-SOD血清对鼠伤寒杆菌攻击小鼠的免疫保护作用
作者：徐军发 唐湘涓 陈小芳 吕世静
单位：广东医学院检验系，湛江 524023
关键词：伤寒杆菌；鼠伤寒杆菌；Fe-SOD；免疫血清；免疫保护
广东医学院学报990403 摘要 目的：制备兔抗伤寒杆菌Fe-SOD血清，并研究其对鼠伤寒杆菌攻击小鼠的免疫保护作用，探讨SOD与沙门氏菌致病性的关系。方法：用纯化的伤寒杆菌Fe-SOD免疫家兔，制备兔抗SOD血清，并用ELISA法检测抗血清效价；免疫电泳、双向琼脂扩散试验和抗血清对酶活性抑制试验检测抗血清的特异性。将所制备的抗血清与鼠伤寒杆菌混合，放37℃30 min，经腹腔注入小鼠体内，并观察3 d和7 d小鼠的存活情况，以确定抗血清的免疫保护作用。结果：抗血清的ELISA效价为1：10240，免疫电泳结果显示抗血清与纯化的伤寒杆菌Fe-SOD及无细胞溶解物在相同位置各只形成一条沉淀线；双向琼脂扩散试验结果显示抗血清不与牛红细胞SOD形成沉淀线，但抗血清对酶活性抑制试验结果显示抗血清可抑制24.92%的红细胞SOD活性，说明伤寒杆菌Fe-SOD与牛红细胞SOD有低度交叉反应。抗血清可抑制42.58%～73.38%的沙门氏菌无细胞溶解物中SOD活性。经抗血清处理过的5LD50鼠伤寒杆菌攻击的小鼠3 d和7 d的存活率分别为90%和60%，均明显高于对照组(P<0.01或P<0.05)。结论：抗伤寒杆菌Fe-SOD血清对受鼠伤寒杆菌攻击的小鼠具有交叉免疫保护作用，SOD可能是沙门氏菌共同的保护性抗原。提示SOD与沙门氏菌的致病性有关。
, 百拇医药
Immunoprotective effect of anti-Salmonella typhi Fe-SOD serum
on mice challenged by Salmonella typhimurium
Xu Junfa Tang Xiangjuan Chen Xiaofanget al
Department of Laboratory Medicine，Guandong Medical College，Zhanjiang 524023
Absiract Objective：To prepare rabbit anti-Salmonella typhi Fe-SOD serum，study its immunoprotection from mice challenged by Salmonella typhimurium and the relationship between superoxide dismutose(SOD)and the pathogenicity of Salmonella.Methods：The anti-Salmonella typhi Fe-SOD serum was prepared from rabbit immunized with purified S.typhi Fe-SOD.The titer and the specificity of the antiserum were determined by ELISA，immunoelectrophorisis，double agar diffusion and the inhibitory assay of enzyme activity.S.typhimurium in different dosages was incubated with anti-SOD serum of certain dosage for 30 min at 37℃，and then the mixture of bacteria and antiserum was injected intraperitonealy into the mice.The survival rates of the mice in different groups were observed on 3 days and 7 days.Results：The titer of the antiscrum was 1：10 240.The immunoclcctrophorcsis showed that the ccll-free extracts and the purified Fe-SOD of S.Typhi formed one precipitated line with the antiserum in the same area respectivedly.There was not precipitated line in the SOD from bovine erythrocyte with the anti-Fe-SOD，but 24.92% of SOD activities in bovine erythroeyte can be inhibited by the anti-serum，which indicated bovine erythrocyte SOD has low degree cross reactivity with the Fe-SOD of S.typhi.The 42.58%～73.38% of SOD activities in cell-free extracts from different Salmonella were inhibited by the antiserum in inhibitory test of enzyme activity.The survival rates of the mice challenged by 5 LD50 S.typhimurium incubated with anti-SOD serum were 90% and 60% after 3 days and 7 days，respectively.They were higher than those in the control groups(P<0.01 or P<0.05).Conclusion：The anti-Fe-SOD of S.typhi could protect the mice from challenged by S.typhimurium.Fe-SOD may be the common protective antigcn of Salmonella.The rcsults indicate that SOD could be related to the pathogenicity of Salmonella.
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Key words：S.typhi；S.typhimurium；Fe-SOD；immune sera；immunoprotection
超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，SOD)是某些细菌重要的毒力因子[1]，有报道星形奴卡氏菌[2，3]、结核分枝杆菌[4]、福氏志贺氏菌[5]、大肠杆菌[6]等的SOD与其毒力有关，且抗星形奴卡氏菌SOD抗体具有免疫保护作用[2，3]。我们发现伤寒杆菌与鼠伤寒杆菌的无细胞溶解物(cell-free extracts)经聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)后有3条SOD活性带[7]。为了进一步研究沙门氏菌的SOD与其毒力的关系，我们在纯化了伤寒杆菌Fe-SOD的基础上制备了兔抗伤寒杆菌Fe-SOD血清，并研究其对鼠伤寒杆菌攻击小鼠的免疫保护作用。
, http://www.100md.com 1 材料和方法
1.1动物和菌株 新西兰白兔、昆明种小鼠均由广东医学院实验动物中心提供；4株野生型伤寒杆菌(分别简称为Stw1、Stw2、Stw3和Stw4，抗原类型均为O9ViHd)、伤寒杆菌H901(简称为H901)、疫苗候选株(ty21a)、及鼠伤寒杆菌毒力株(Stm，抗原类型为O4.5.12Hi.1.2)均由贵阳医学院免疫学教研室唐俊杰教授赠送。
1.2 仪器和试剂 DG3022A酶标仪(国营华东电子管厂产)，伤寒杆菌Fe-SOD(Stw1 Fe-SOD)(由贵阳医学院免疫学教研室提供，比活性为3270U/mg[7])，抗伤寒杆菌O901血清(本室自制，凝集效价为1：1280)，牛红细胞SOD(Sigma，比活性为3000U/mg)，卡介苗(兰州生物制品研究所)，羊抗兔IgG酶标抗体(北京生物制品研究所)等。
1.3 抗Stw1 Fe-SOD血清的制备 将纯化的Stw1 Fe-SOD加弗氏完全佐剂免疫家兔，每周免疫一次，每次用量500 μg/只，共免疫5次。前两次分别在后足掌及窝淋巴结内注射，以后各次均采用背部皮下多点注射。末次免疫后第10天抽心血，分离血清。用ELISA法检测血清效价，免疫电泳检测抗血清纯度。
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1.4 抗血清特异性鉴定
1.4.1 双向琼脂扩散试验 用纯化的Fe-SOD和牛红细胞SOD与抗Fe-SOD血清作双向琼脂扩散试验。
1.4.2 抗血清对不同来源SOD活性的抑制作用 先对抗血清浓度进行选择。取含1 U SOD不同细菌无细胞溶解物及1 U牛红细胞SOD加入经选定浓度的抗血清量，37℃作用30 min后按NBT还原法检测SOD活性[8]，并计算其抑制率[4]。
1.5 抗Fe-SOD血清对鼠伤寒杆菌攻击小鼠的交叉免疫保护作用 先测定Stm的LD50，再参照文献[3]检测抗血清的交叉免疫保护作用。实验分3组，每组取5.0 mL兔抗Fe-SOD血清加入经生理盐水洗3次的Stm悬液，置37℃30 min。取8～10周龄昆明种小鼠，随机分成3组，每组10只，分别腹腔内注射上述3个稀释度的抗血清细菌悬液1.0 mL，使细菌终浓度分别为5 LD50、10LD50和20LD50，观察3 d和7 d小鼠存活数。同时设立两个对照组，分别以正常兔血清和兔抗伤寒杆菌O901血清代替抗SOD血清预先处理细菌。
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1.6 统计学处理 计量资料用
±s表示，组间比较用方差分析后再用q检验。计数资料采用四格表的确切概率法。
2 结果
2.1抗血清的效价和纯度 抗血清的ELISA效价为1：10240。图1显示抗Stw1Fe-SOD血清与纯化的Stw1Fe-SOD及Stw1无细胞溶解物在相同位置各只形成一条沉淀线。
图1 免疫电泳结果
a.纯化的Stw1 Fe-SOD，b.Stw1无细胞溶解物，c.兔抗Stw1 Fe-SOD血清
2.2 双向琼脂扩散实验结果 图2显示抗Stw1 Fe-SOD血清只与纯化的Stwi Fe-SOD形成沉淀线，与牛红细胞SOD之间不形成沉淀线。
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图2 双向琼脂扩散试验结果
a. 纯化的Stw 1 Fe-SOD，b.牛红细胞SOD，c.兔抗Stw1 Fe-SOD血清
2.3 兔抗Stw1 Fe-SOD血清对不同来源的SOD活性的抑制作用 图3显示当抗血清浓度为50 ELISA单位时，抗血清对1 U Stw1 Fe-SOD的抑制率已达高峰，故选择50 ELISA单位作酶活性抑制试验。表1表示50 ELISA单位的兔抗Stw1 Fe-SOD血清对1 U不同来源的SOD活性的抑制率。可见抗血清对不同株伤寒沙门氏菌1 U SOD活性的抑制率无明显差异(P>0.05)，对Stm SOD活性的抑制率低于伤寒沙门氏菌(P<0.05)，对牛红细胞SOD活性的抑制率仅有24.92%。
图3 不同浓度的抗血清对1U Stw1 SOD活性的抑制作用
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表1 抗Stw1 Fe-SOD血清对不同来源的
SOD活性的抑制作用 SOD来源
抑制率(±s)/%
Stw1
73.38±13.84
Stw2
71.26±15.39
Stw3
66.21±13.01
Stw4
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68.87±14.21
H901
69.32±14.22
ty21a
63.39±15.76
Stm
42.58±9.33*
牛红细胞SOD
24.92±7.64**
与Stw1比较，*P<0.05，** P<0.01
2.4 抗Stw1 Fe-SOD血清对Stm感染小鼠的交叉免疫保护作用 经测定Stm的LD50为105.12。表2显示抗Stw1 Fe-SOD血清处理过的5LD50Stm攻击的小鼠3 d和7d存活率分别为90%和60%，均明显高于正常兔血清对照组(P<0.01或P<0.05)，而抗O901血清组与正常兔血清对照组之间差异无显著性。
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表2 抗 Stw1 Fe-SOD血清对Stm感染小鼠的
交叉免疫保护作用 (存活数/总数)
3d
7d
5LD50
10LD50
20LD50
5LD50
10LD50
20LD50
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抗SOD
9/10*
4/10
1/10
6/10**
2/10
0/10
抗O901
3/10
1/10
0/10
1/10
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0/10
0/10
正常兔血清
1/10
0/10
0/10
0/10
0/10
0/10
与正常兔血清组比较，**P<0.01；*P<0.05
3 讨论
沙门氏菌被吞噬细胞吞噬后可以抵抗吞噬细胞的杀菌作用，形成不完全吞噬。关于沙门氏菌的抗吞噬作用机理尚未完全阐明，但SOD有可能与沙门氏菌的抗吞噬作用有关[9，10]。为了探讨SOD与沙门氏菌抗吞噬作用的关系，我们在纯化Stw1 Fe-SOD的基础上制备了兔抗Fe-SOD血清，并利用鼠伤寒杆菌感染小鼠模型证明抗SOD血清的免疫保护作用。
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免疫电泳结果显示：纯化的伤寒杆菌Fe-SOD及其无细胞溶解物与抗Fe-SOD在相同位置各只形成一条沉淀线，说明抗血清纯度较高，只与Fe-SOD反应，不与无细胞溶解物中其它成分起反应。双向琼脂扩散试验结果显示抗Stw1 Fe-SOD血清不与牛红细胞SOD形成沉淀线，而抗体对酶活性抑制试验结果显示抗Stw1 Fe-SOD血清只能抑制24.92%的牛红细胞SOD活性，说明牛红细胞SOD与Stw1 Fe-SOD有低度交叉反应。抗血清对不同株伤寒杆菌SOD活性的抑制率无明显差异，而对Stm SOD活性的抑制率为42.58%，低于对伤寒杆菌SOD的抑制率(P<0.01)，说明Stm Fe-SOD和Stw1 Fe-SOD的抗原性有差异或Stm无细胞溶解物中Fe-SOD含量较低。
抗Stw1 Fe-SOD血清能使受5 LD50的鼠伤寒杆菌攻击的小鼠3 d和7 d的存活率分别为90%和60%，明显高于正常兔血清对照组(P<0.01或P<0.05)。而抗伤寒杆菌O901血清组和正常兔血清组无差异(P>0.05)。抗Stw1 Fe-SOD血清可抑制Stm无细胞溶解物中42.58%的SOD活性[7]，当抗SOD抗体在体外与Stm作用时可与细菌的SOD结合，注入机体后一方面抑制细菌SOD活性，增强吞噬细胞对细菌的杀伤；另一方面可激活补体，并导致趋化、溶菌和调理吞噬作用。鼠伤寒杆菌和伤寒杆菌仅有O12为共同抗原，因此抗O901血清中抗O12的抗体量相应地少，故而缺乏保护作用。抗Stw1 Fe-SOD血清对鼠伤寒杆菌攻击的小鼠显示出明显的保护作用，除说明抗SOD血清确有交叉免疫保护作用外，同时也提示SOD可能是沙门氏菌共同的保护性抗原，并提示SOD与沙门氏菌的致病性有关。因为抗Stw1 Fe-SOD抗体只能抑制42.58%的鼠伤寒杆菌SOD活性，因而对较大剂量的Stm的攻击无保护作用。
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基金项目：广东医学院青年科学基金资助课题(批号：9504)
4 参考文献
1 Beaman L，Beaman BL.The role of oxygen and its derivatives in microbial pathogenesis and host defense.Annu Rev Microbiol，1984，38：27
2 Beaman BL，Black CM，Dought F，et al.Role of Superoxide dismutase and catalase as determinants of pathogenicity of Nocardia asteroids：Importance in resistance to microbicidal activities of human polymorphonuclear neutrophils.Infect Immun，1985，47：135
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3 Beaman L，Beaman BL.Monoclonal antibody demonstrates that superoxide dismutase contributes to protection of Nocardia asterides within the intact host.Infect Immun，1990，58：3122
4 Kusunose E，Kosuke I，Yojiro N，et al.Superoxide dismutase of Mycobacterium tuberculosis.J Biochem，1976，80：1343
5 Franzon VL，Arondel J，Sansonetti PJ.Contribution of superoxide dismutase and catalase activities to Shigella flexneri pathogenesis.Infect Immun，1990，58：529
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6 McManus DC，Josephy PD.Superoxide dismutase protects Escherichia coli against killing by human serum.Arch Biochem Biophys，1995，317：57
7 徐军发，凌天翼，唐俊杰.伤寒沙门氏菌超氧化物歧化酶的纯化及抗原性分析.生物化学杂志，1996，22：720.
8 徐军发，凌天翼，唐俊杰.用NBT还原法检测细菌无细胞溶解物中SOD活性.广东医学院学报，1998，16：12
9 Papp-Szabo E，Firtel M，Josephy PD.Comparison of sensitivities of Salmonella typhimurium oxyR and katG mutants to killing by human neutrophils.Infect Immun，1994，62：2662
10 Christman MF，Morgan RW，Jacobason FS，et al.Positive control of a regulon for defenses against oxidative stress and some heat shock proteins in Salmonella typhimurium.Cell，1985，41：753
收稿日期：1999-05-20, 百拇医药
单位：广东医学院检验系，湛江 524023
关键词：伤寒杆菌；鼠伤寒杆菌；Fe-SOD；免疫血清；免疫保护
广东医学院学报990403 摘要 目的：制备兔抗伤寒杆菌Fe-SOD血清，并研究其对鼠伤寒杆菌攻击小鼠的免疫保护作用，探讨SOD与沙门氏菌致病性的关系。方法：用纯化的伤寒杆菌Fe-SOD免疫家兔，制备兔抗SOD血清，并用ELISA法检测抗血清效价；免疫电泳、双向琼脂扩散试验和抗血清对酶活性抑制试验检测抗血清的特异性。将所制备的抗血清与鼠伤寒杆菌混合，放37℃30 min，经腹腔注入小鼠体内，并观察3 d和7 d小鼠的存活情况，以确定抗血清的免疫保护作用。结果：抗血清的ELISA效价为1：10240，免疫电泳结果显示抗血清与纯化的伤寒杆菌Fe-SOD及无细胞溶解物在相同位置各只形成一条沉淀线；双向琼脂扩散试验结果显示抗血清不与牛红细胞SOD形成沉淀线，但抗血清对酶活性抑制试验结果显示抗血清可抑制24.92%的红细胞SOD活性，说明伤寒杆菌Fe-SOD与牛红细胞SOD有低度交叉反应。抗血清可抑制42.58%～73.38%的沙门氏菌无细胞溶解物中SOD活性。经抗血清处理过的5LD50鼠伤寒杆菌攻击的小鼠3 d和7 d的存活率分别为90%和60%，均明显高于对照组(P<0.01或P<0.05)。结论：抗伤寒杆菌Fe-SOD血清对受鼠伤寒杆菌攻击的小鼠具有交叉免疫保护作用，SOD可能是沙门氏菌共同的保护性抗原。提示SOD与沙门氏菌的致病性有关。
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Immunoprotective effect of anti-Salmonella typhi Fe-SOD serum
on mice challenged by Salmonella typhimurium
Xu Junfa Tang Xiangjuan Chen Xiaofanget al
Department of Laboratory Medicine，Guandong Medical College，Zhanjiang 524023
Absiract Objective：To prepare rabbit anti-Salmonella typhi Fe-SOD serum，study its immunoprotection from mice challenged by Salmonella typhimurium and the relationship between superoxide dismutose(SOD)and the pathogenicity of Salmonella.Methods：The anti-Salmonella typhi Fe-SOD serum was prepared from rabbit immunized with purified S.typhi Fe-SOD.The titer and the specificity of the antiserum were determined by ELISA，immunoelectrophorisis，double agar diffusion and the inhibitory assay of enzyme activity.S.typhimurium in different dosages was incubated with anti-SOD serum of certain dosage for 30 min at 37℃，and then the mixture of bacteria and antiserum was injected intraperitonealy into the mice.The survival rates of the mice in different groups were observed on 3 days and 7 days.Results：The titer of the antiscrum was 1：10 240.The immunoclcctrophorcsis showed that the ccll-free extracts and the purified Fe-SOD of S.Typhi formed one precipitated line with the antiserum in the same area respectivedly.There was not precipitated line in the SOD from bovine erythrocyte with the anti-Fe-SOD，but 24.92% of SOD activities in bovine erythroeyte can be inhibited by the anti-serum，which indicated bovine erythrocyte SOD has low degree cross reactivity with the Fe-SOD of S.typhi.The 42.58%～73.38% of SOD activities in cell-free extracts from different Salmonella were inhibited by the antiserum in inhibitory test of enzyme activity.The survival rates of the mice challenged by 5 LD50 S.typhimurium incubated with anti-SOD serum were 90% and 60% after 3 days and 7 days，respectively.They were higher than those in the control groups(P<0.01 or P<0.05).Conclusion：The anti-Fe-SOD of S.typhi could protect the mice from challenged by S.typhimurium.Fe-SOD may be the common protective antigcn of Salmonella.The rcsults indicate that SOD could be related to the pathogenicity of Salmonella.
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Key words：S.typhi；S.typhimurium；Fe-SOD；immune sera；immunoprotection
超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，SOD)是某些细菌重要的毒力因子[1]，有报道星形奴卡氏菌[2，3]、结核分枝杆菌[4]、福氏志贺氏菌[5]、大肠杆菌[6]等的SOD与其毒力有关，且抗星形奴卡氏菌SOD抗体具有免疫保护作用[2，3]。我们发现伤寒杆菌与鼠伤寒杆菌的无细胞溶解物(cell-free extracts)经聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)后有3条SOD活性带[7]。为了进一步研究沙门氏菌的SOD与其毒力的关系，我们在纯化了伤寒杆菌Fe-SOD的基础上制备了兔抗伤寒杆菌Fe-SOD血清，并研究其对鼠伤寒杆菌攻击小鼠的免疫保护作用。
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1.1动物和菌株 新西兰白兔、昆明种小鼠均由广东医学院实验动物中心提供；4株野生型伤寒杆菌(分别简称为Stw1、Stw2、Stw3和Stw4，抗原类型均为O9ViHd)、伤寒杆菌H901(简称为H901)、疫苗候选株(ty21a)、及鼠伤寒杆菌毒力株(Stm，抗原类型为O4.5.12Hi.1.2)均由贵阳医学院免疫学教研室唐俊杰教授赠送。
1.2 仪器和试剂 DG3022A酶标仪(国营华东电子管厂产)，伤寒杆菌Fe-SOD(Stw1 Fe-SOD)(由贵阳医学院免疫学教研室提供，比活性为3270U/mg[7])，抗伤寒杆菌O901血清(本室自制，凝集效价为1：1280)，牛红细胞SOD(Sigma，比活性为3000U/mg)，卡介苗(兰州生物制品研究所)，羊抗兔IgG酶标抗体(北京生物制品研究所)等。
1.3 抗Stw1 Fe-SOD血清的制备 将纯化的Stw1 Fe-SOD加弗氏完全佐剂免疫家兔，每周免疫一次，每次用量500 μg/只，共免疫5次。前两次分别在后足掌及窝淋巴结内注射，以后各次均采用背部皮下多点注射。末次免疫后第10天抽心血，分离血清。用ELISA法检测血清效价，免疫电泳检测抗血清纯度。
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1.4 抗血清特异性鉴定
1.4.1 双向琼脂扩散试验 用纯化的Fe-SOD和牛红细胞SOD与抗Fe-SOD血清作双向琼脂扩散试验。
1.4.2 抗血清对不同来源SOD活性的抑制作用 先对抗血清浓度进行选择。取含1 U SOD不同细菌无细胞溶解物及1 U牛红细胞SOD加入经选定浓度的抗血清量，37℃作用30 min后按NBT还原法检测SOD活性[8]，并计算其抑制率[4]。
1.5 抗Fe-SOD血清对鼠伤寒杆菌攻击小鼠的交叉免疫保护作用 先测定Stm的LD50，再参照文献[3]检测抗血清的交叉免疫保护作用。实验分3组，每组取5.0 mL兔抗Fe-SOD血清加入经生理盐水洗3次的Stm悬液，置37℃30 min。取8～10周龄昆明种小鼠，随机分成3组，每组10只，分别腹腔内注射上述3个稀释度的抗血清细菌悬液1.0 mL，使细菌终浓度分别为5 LD50、10LD50和20LD50，观察3 d和7 d小鼠存活数。同时设立两个对照组，分别以正常兔血清和兔抗伤寒杆菌O901血清代替抗SOD血清预先处理细菌。
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1.6 统计学处理 计量资料用
±s表示，组间比较用方差分析后再用q检验。计数资料采用四格表的确切概率法。2 结果
2.1抗血清的效价和纯度 抗血清的ELISA效价为1：10240。图1显示抗Stw1Fe-SOD血清与纯化的Stw1Fe-SOD及Stw1无细胞溶解物在相同位置各只形成一条沉淀线。
图1 免疫电泳结果
a.纯化的Stw1 Fe-SOD，b.Stw1无细胞溶解物，c.兔抗Stw1 Fe-SOD血清
2.2 双向琼脂扩散实验结果 图2显示抗Stw1 Fe-SOD血清只与纯化的Stwi Fe-SOD形成沉淀线，与牛红细胞SOD之间不形成沉淀线。
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图2 双向琼脂扩散试验结果
a. 纯化的Stw 1 Fe-SOD，b.牛红细胞SOD，c.兔抗Stw1 Fe-SOD血清
2.3 兔抗Stw1 Fe-SOD血清对不同来源的SOD活性的抑制作用 图3显示当抗血清浓度为50 ELISA单位时，抗血清对1 U Stw1 Fe-SOD的抑制率已达高峰，故选择50 ELISA单位作酶活性抑制试验。表1表示50 ELISA单位的兔抗Stw1 Fe-SOD血清对1 U不同来源的SOD活性的抑制率。可见抗血清对不同株伤寒沙门氏菌1 U SOD活性的抑制率无明显差异(P>0.05)，对Stm SOD活性的抑制率低于伤寒沙门氏菌(P<0.05)，对牛红细胞SOD活性的抑制率仅有24.92%。
图3 不同浓度的抗血清对1U Stw1 SOD活性的抑制作用
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表1 抗Stw1 Fe-SOD血清对不同来源的
SOD活性的抑制作用 SOD来源
抑制率(
±s)/%Stw1
73.38±13.84
Stw2
71.26±15.39
Stw3
66.21±13.01
Stw4
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68.87±14.21
H901
69.32±14.22
ty21a
63.39±15.76
Stm
42.58±9.33*
牛红细胞SOD
24.92±7.64**
与Stw1比较，*P<0.05，** P<0.01
2.4 抗Stw1 Fe-SOD血清对Stm感染小鼠的交叉免疫保护作用 经测定Stm的LD50为105.12。表2显示抗Stw1 Fe-SOD血清处理过的5LD50Stm攻击的小鼠3 d和7d存活率分别为90%和60%，均明显高于正常兔血清对照组(P<0.01或P<0.05)，而抗O901血清组与正常兔血清对照组之间差异无显著性。
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表2 抗 Stw1 Fe-SOD血清对Stm感染小鼠的
交叉免疫保护作用 (存活数/总数)
3d
7d
5LD50
10LD50
20LD50
5LD50
10LD50
20LD50
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抗SOD
9/10*
4/10
1/10
6/10**
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抗O901
3/10
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正常兔血清
1/10
0/10
0/10
0/10
0/10
0/10
与正常兔血清组比较，**P<0.01；*P<0.05
3 讨论
沙门氏菌被吞噬细胞吞噬后可以抵抗吞噬细胞的杀菌作用，形成不完全吞噬。关于沙门氏菌的抗吞噬作用机理尚未完全阐明，但SOD有可能与沙门氏菌的抗吞噬作用有关[9，10]。为了探讨SOD与沙门氏菌抗吞噬作用的关系，我们在纯化Stw1 Fe-SOD的基础上制备了兔抗Fe-SOD血清，并利用鼠伤寒杆菌感染小鼠模型证明抗SOD血清的免疫保护作用。
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免疫电泳结果显示：纯化的伤寒杆菌Fe-SOD及其无细胞溶解物与抗Fe-SOD在相同位置各只形成一条沉淀线，说明抗血清纯度较高，只与Fe-SOD反应，不与无细胞溶解物中其它成分起反应。双向琼脂扩散试验结果显示抗Stw1 Fe-SOD血清不与牛红细胞SOD形成沉淀线，而抗体对酶活性抑制试验结果显示抗Stw1 Fe-SOD血清只能抑制24.92%的牛红细胞SOD活性，说明牛红细胞SOD与Stw1 Fe-SOD有低度交叉反应。抗血清对不同株伤寒杆菌SOD活性的抑制率无明显差异，而对Stm SOD活性的抑制率为42.58%，低于对伤寒杆菌SOD的抑制率(P<0.01)，说明Stm Fe-SOD和Stw1 Fe-SOD的抗原性有差异或Stm无细胞溶解物中Fe-SOD含量较低。
抗Stw1 Fe-SOD血清能使受5 LD50的鼠伤寒杆菌攻击的小鼠3 d和7 d的存活率分别为90%和60%，明显高于正常兔血清对照组(P<0.01或P<0.05)。而抗伤寒杆菌O901血清组和正常兔血清组无差异(P>0.05)。抗Stw1 Fe-SOD血清可抑制Stm无细胞溶解物中42.58%的SOD活性[7]，当抗SOD抗体在体外与Stm作用时可与细菌的SOD结合，注入机体后一方面抑制细菌SOD活性，增强吞噬细胞对细菌的杀伤；另一方面可激活补体，并导致趋化、溶菌和调理吞噬作用。鼠伤寒杆菌和伤寒杆菌仅有O12为共同抗原，因此抗O901血清中抗O12的抗体量相应地少，故而缺乏保护作用。抗Stw1 Fe-SOD血清对鼠伤寒杆菌攻击的小鼠显示出明显的保护作用，除说明抗SOD血清确有交叉免疫保护作用外，同时也提示SOD可能是沙门氏菌共同的保护性抗原，并提示SOD与沙门氏菌的致病性有关。因为抗Stw1 Fe-SOD抗体只能抑制42.58%的鼠伤寒杆菌SOD活性，因而对较大剂量的Stm的攻击无保护作用。
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基金项目：广东医学院青年科学基金资助课题(批号：9504)
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收稿日期：1999-05-20, 百拇医药