家兔脊髓缺血损伤后谷氨酸受体活性变化
作者：卓 豫 伍亚民 廖维宏 王正国 朱佩芳 陈恒胜
单位：第三军医大学大坪医院野战外科研究所五室 400042 重庆市
关键词：谷氨酸受体；脊髓损伤；缺血再灌流；家兔
中国脊柱脊髓杂志990410 摘要 目的：探讨谷氨酸(Glu)及其受体(GluR)在脊髓缺血过程中的量变特征在继发损伤中的作用及2-氨基-膦酸基戊酸(APV)的治疗作用。方法：选用体重2～2.5kg的日本大耳白家兔70只,用腰动脉分支阻断法建立脊髓缺血模型,用放射配基结合分析法检测脊髓缺血损伤后0.5～24h期间及在缺血60min时用APV处理后脊髓神经细胞膜的GluR活性(Bmax，KD)。结果：缺血60min后GluR的最大结合量降低，亲和力升高，开始再灌流后最大结合量迅速升高，至2h到达高峰，之后迅速下降，至再灌流4h降至最低，此后缓慢回升，而亲和力在再灌流0.5h时继续升高，然后下降，再灌流2h降至最低，此后趋势与最大结合量变化相反。APV在再流灌早期使受体活性增高，再灌流4h后无显著性差异。结论：Glu通过其受体中介参与了脊髓缺血再灌流损伤，但在缺血再灌流过程中GluR活性的变化可能具有不同的作用效应，同时也说明脊髓继发性损伤机制单以Glu兴奋性损伤是解释不了的。
, 百拇医药
The change of glutamate receptor activity after ischemic spinal cord injury in the rabbit
ZHUO YU,WU Yamin,LIAO Weihong,et al
Chinese Journal of Spine and Spinal Cord,1999,9(4):212～215
Abstract Objective:To investigate the role of glutamate and glutamate receptor in the secondary injury of spinal cord ischemia-reperfusion injury and its APV effects.Method:The model of ischemia and reperfusion of spinal cord was created by the 60 min occlusion of the lunbar artery in 70 rabbits with the weight of 2.25±0.25kg,the activity (Bmax,KD) of glutamate receptor (GluR) was measured by the radioligand binding assay in the injured group and 2-amino-5-phosphono-valerate(APV) treated group during the 0.5～24h of ischemia decreased.Result:Bmax increased remarkably at the beginning of reperfusion and reached to the peak at 2h of reperfusion and then decreased gradually to the lowest level at 4h of reperfusion.KD continued to drop at 0.5h of reperfusion,after that time,its change was the same as that of the Bmax.APV could improve the activity of GluR during the early period of reperfusion,but there was no significant effect after 4h of reperfusion.Conclusion:Glu involved in the secondary injury of spinal cord ischemia-reperfusion injury by its receptor.But the activity of GluR has different effects in the injury progression.It is suggested that Glu excited toxicity is not the only reasons of the secondary injury of spinal cord ischemia-reperfusion.
, 百拇医药
Author,s address Department Five,Research Institute of Surgery，Daping Hospital,The Third Military Medical University,Chongqing,400042
Key word Glutamate receptor Spinal cord injury Ischemia and reperfusion Rabbit
脊髓损伤(SCI)是威胁人类健康的常见创伤之一，其继发损伤致使原本可能恢复的感觉、运动功能变为不可逆的永久性功能障碍。谷氨酸(Glu)是一种典型的兴奋性氨基酸(EAA)，也是典型的兴奋性神经递质〔1、2 〕，脑损伤后早期细胞外Glu浓度明显升高，并具有神经毒性。其兴奋毒性作用主要是通过其受体介导〔3、4〕参与脑继发性损伤。谷氨酸受体(GluR)在脊髓创伤中，特别是在缺血再灌流损伤中的作用及其特征的研究的报道很少。作者用放射配基结合分析法着重研究了兔脊髓缺血损伤后脊髓内GluR活性变化及应用NMDA竞争性拮抗剂2-氨基-5-膦酸基戊酸(APV)治疗的效果，以探讨谷氨酸及其受体在脊髓缺血损伤过程中的量变特征和造成继发性损害的作用机理。
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1 材料和方法
1.1 实验动物分组
健康日本大耳白家兔70只，体重2～2.5kg，雌雄不拘，随机分成4组。Ⅰ组，正常对照组；Ⅱ组，缺血损伤组；Ⅲ组，再灌流损伤组；Ⅳ组，再灌流治疗组，以APV治疗。分别检测各组Glu受体活性，Ⅲ、Ⅳ组分别检测损伤再灌流后0.5h、1h、2h、4h、 8h、24h时谷氨酸受体的活性。
1.2 脊髓缺血损伤模型的建立
用3%戊巴比妥钠(40mg/kg iv)麻醉家兔后，左侧腹背部剪毛、备皮、消毒，在椎体旁纵切一长约6cm的切口，于腹腔后间隙钝性分离腹主动脉及其6支分支腰动脉(以左肾动脉为基准，其上一支腰动脉为上1，其下五支腰动脉依次为下1、下2、下3、下4、下5)，上1、下1、下3、下4、下5分别用1号丝线结扎，下2用血管夹阻断，60min后取走血管夹再灌流，造成腰段脊髓的缺血再灌流损伤。治疗组于结扎60min后即刻从延髓池推注APV(250μmol/50μl)后再取走血管夹。
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1.3 脊髓神经细胞膜GluR活性的测定
1.3.1 兔脊髓神经细胞膜蛋白的制备 参照Mecker〔3〕等方法并作改进。首先用冰生理盐水灌注家兔，分离出脊髓，立即取L4节段脊髓±60mg加入盛有1ml预冷HBS(pH7.4)的匀浆器中，在冰浴中手动匀浆。匀浆后在4℃下以2600～3400r/min离心5min，取上清液。再在冰浴下电动匀浆10min，4℃下4000r/min离心30min，取上清液。再加入适量HBS补充至3ml进行低速离心，条件同上,重复一次。然后低温高速离心(13500r/min)20min，留沉淀，去上清液。在沉淀中加入20倍沉渣体积的冰冻1mmol Tris-HCl(pH7.2)缓冲液反复离心3次，条件同上。最后的沉淀加入适量pH7.2冰冻50mmol Tris-HCl结合缓冲液以制成膜受体蛋白悬液，立即供实验使用。以Lawry法测定受体悬液蛋白浓度。
1.3.2 加样与温育 采用双平行管，按表1方法加样后，摇匀，在37℃恒温水浴中孵化40min，孵化后，立即取出样本，加入4℃ 1mmol Tris-HCl(pH7.4)5ml终止反应，并迅速抽滤，以防止受体-标记配基复合物解离。
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表1 GluR放射配基结合分析法加样 管号
3H-Glu
50pmol(μl)
50mmol Tris-HCl
(μl)
Glu
50nmol(μl)
样本
(μl)
1
5
195
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100
2
10
190
100
3
15
185
100
4
20
180
100
5
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25
175
100
6
30
170
100
7
40
160
100
8
50
150
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100
9
5
145
50
100
10
15
135
50
100
11
40
120
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50
100
12
50
100
50
100
注：1～8号管为总体结合管，9～12管为非特异结合管
1.3.3 分离和测量 反应后的样本，速以多头细胞收集器，双层69型玻璃纤维滤纸迭加负压抽滤，将与受体结合的标记配基和游离未结合的标记配基分开，然后再用1 mmol冰Tris-HCl 5ml反复冲洗膜3次，滤膜在80℃烘烤1h，剪下样本，依次放入盛有5ml PPO-POPOP-二甲苯闪烁液的闪烁瓶中，用多功能闪烁计数仪测定其放射活性(cpm)。以空白滤纸点样进行校正，仪器效率约为67%。
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1.3.4 数据处理 总结合管计数减去同一浓度非特异结合管的计数即为各点特异性结合计数(cpm)。再按下列公式计算：
以Scatchard作图，分别计算出脊髓神经细胞膜GluR的最大结合量(Bmax)和平衡解离常数(KD)，单位分别为pmol/mg蛋白和nmol/L。
2 结果
2.1 再灌流损伤脊髓神经细胞膜的GluR活性变化
GluR与配基的结合具有饱和性。当于一定量细胞膜蛋白制剂中加入递增浓度的放射性配基时，受体与配基的结合呈指数关系增加，当配基浓度达到一定量时，受体与配基的结合即可达到饱和。根据饱和曲线，可算出脊髓中GluR的Bmax及KD值，分别代表在结合测定中能与配体结合的受体量以及反映受体与配体结合的亲和力参数。正常对照组脊髓神经细胞膜GluR的Bmax为4.205±0.24pmol/mg蛋白，KD值为 2.532±0.51nmol/L。
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脊髓缺血损伤后脊髓神经细胞膜GluR的最大结合量(Bmax)显著下降(与正常对照组比P<0.01)，再灌流后早期显著升高，至再灌2h升至最高点，但仍显著低于正常值(与损伤对照组相比P<0.01，与正常组相比P<0.01)，然后大幅下降，至再灌流4h降至最低点(比正常对照组降低了84.4%，P<0.01，比损伤对照组降低了40%，P<0.01),之后略有回升但不显著。GluR的KD值在损伤后显著降低 (与正常组相比P<0.01)，再灌流0.5h继续大幅下降(与损伤对照组比P<0.01)，此后开始回升，变化趋势与GluR的最大结合量(Bmax)变化趋势相同(表2)。
2.2 APV对再灌流损伤脊髓神经细胞膜GluR的影响
APV处理组使GluR的Bmax在再灌初期显著升高(治疗组再灌0.5h、1h时与损伤再灌组同期相比P<0.01，2h与损伤再灌组同期相比P<0.05)，再灌4h后已无显著改变(P>0.05，表2)；对KD值无显著作用。
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表2 兔脊髓神经细胞膜GluR活性变化
(
±s) 组别
n
GluR
Bmax
(pmol/mg蛋白)
KD
(nmol/L)
Ⅰ组
5
4.205±0.24
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2.532±0.51
Ⅱ组
5
1.091±0.14①
0.717±0.07①
Ⅲ组再灌
0.5h
1h
2h
4
8
24
, 百拇医药
5
5
5
5
5
5
1.837±0.15①②
2.389±0.22①②
3.182±0.26①②
0.657±0.03①②
0.689±0.03①②
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0.764±0.12①②
0.415±0.05①②
1.415±0.27①②
1.442±0.25①②
0.132±0.06①②
0.379±0.04①②
0.402±0.08①②
Ⅳ组再灌
0.5h
1h
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2h
4
8
24
5
5
5
5
5
5
2.015±0.15③
3.233±0.24③
3.567±0.21④
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0.683±0.03
0.759±0.10
0.808±0.12
0.452±0.03
1.425±0.17
1.489±0.16
0.190±0.04
0.474±0.13
0.504±0.10
①与Ⅰ组比P<0.01，②与Ⅱ组比P<0.01，③与Ⅲ组同期相比P<0.01，④与Ⅲ组同期相比P<0.05
, 百拇医药 3 讨论
文献报道〔5～8〕，脊髓损伤后早期细胞外Glu浓度明显升高，Glu具有神经毒性，其毒性作用是由其受体介导的。GluR的活化引起神经细胞去极化，使神经细胞兴奋性增高，导致Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cl-等离子通道的通透性增加〔9、10〕，阳离子通道开放使Na+、Ca2+持续大量内流，Cl-和水被动内流造成急性水肿和细胞内Ca2+超载，使神经细胞的脂质和蛋白质代谢紊乱，一系列的变化引起不可逆性蛋白质变性而致神经细胞死亡，这可能是造成脊髓继发性损伤的原因之一。GluR在脊髓缺血再灌流过程中的量变特征及机制的研究目前尚未见报道。
目前对受体特性的研究主要是通过测定受体最大结合量(Bmax)和平衡解离常数(KD)来进行。一般认为Bmax与受体的密度正相关，KD值与受体-配体的亲和力呈负相关，KD值升高，说明受体对配体的亲和力下降。本文研究结果提示，GluR的最大结合量(Bmax)——受体的密度，在缺血损伤后明显降低，可能是缺血后机体的应激反应使EAA类特别是Glu释放增加，GluR对突然大幅度升高的Glu的抑制反应，对机体起一定的保护作用；但KD的降低，受体亲和力升高，导致受体与配体结合时间延长(受体-配体的内化作用增强而导致的)，减弱或部分削弱了Bmax降低的保护效应，致使高浓度的Glu发挥其强大的兴奋毒性作用。随后由于Glu过量释放使其受体激活，GluR的活化引起短期内Glu摄取的抑制，刺激Glu进一步释放，造成恶性循环。同时受体亲和力在0.5h 时继续升高，加重机体损伤。此后高浓度的Glu使GluR过度兴奋，使受体亲和力下降，受体与配体结合时间缩短，使受体-配体的内化作用减弱而导致受体密度升高，从而GluR对Glu的兴奋毒性起放大作用，加重了缺血神经元的损伤。再灌流2h后由于神经元不可逆的损伤、死亡以及创伤所引起的各种毒素的内化作用增强，使受体合成受抑制，且使部分受体加速分解以及变性，导致受体密度的大幅下降，至再灌流4h时降至最低。此后由于Glu释放的减少，受体亲和力的降低，而血液循环恢复不明显，缺氧状况改善有限，使受体密度虽略有升高，但不显著。缺血时GluR的减少可能是集体的代偿性神经保护作用，再灌流4h时明显下降可能是脊髓神经元明显受损的反应。因此，Glu通过其受体中介参与了脊髓缺血及再灌流损伤，GluR在缺血再灌流损伤过程中可能具有保护和损伤双重效应，这是一个值得深入认真探讨的问题。
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APV在再灌流早期能使GluR的密度显著升高，对KD值无显著作用。以往APV的研究多是离体的治疗作用，本研究显示该拮抗剂对在体的治疗作用在损伤早期不是很明显，反而有加重损伤的趋势，对远期治疗可能有一定作用。这也可能与缺血再灌流损伤的程度及APV用药的方式、剂量等因素有关。同时也说明脊髓继发性损伤机制单靠Glu兴奋性损伤是解释不了的。
4 参考文献
1 Demediuk P.Effect of impact trauma on neurotransmitter and nonneurotansmitter amino acids in rat spinal cord.J Neurotrauma,1997,14:677.
2 Shapiro S.Neurotransmission by neurons that use serotonin,noradrenaline,glutamate,glycine,and γ-aminobutyric acid in the normal and injured spinal cord.Neurosurg,1997,40:297.
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3 Mecker RB,Greenwood RS,Hayward JN.Glutamate receptors in the rat hypothalamus and pituitary.Endocrinology,1994,134(2):621.
4 Nicoletti F,Bruno V,Coani A,et al.Metabotroic glutamate receptors:a new target for the therapy of neurodegenerative disorders? TINS,1996,19:267.
5 Faden AJ,Chan P,Longar S.Alterations in lipid metabolism,Na+-K+-ATPase activity and tissue water content of spinal cord following experimental traumatic injury.J Neurochem,1987,48:1809.
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6 Obenovitch TP,Urenjak J.Is high extracellular glutamate the ke to excitotoxicity in traumatic brain injury? J Neurotrauma,1997,14:677.
7 Smith DH,Mclntosh TK.Traumatic brain injury and excitatory amino acids.In:Nataan RK,Wilberger JE,Povlishock JT,ed.Neurotrayuma.New York:McGraw-Hill,1996.1445-1458.
8 VON Euler M,Li-Li M,Whittemore S,et al.No Protective effect of the NMDA antagonist memantine in experimentalspinal cord injuries.J Neurotrauma,1997,14:53.
9 Choi DW.Excitotoxic cell death.J Neurobiol,1992,23:1261.
10 Choi DW.Ionic dependence of glutamate neurotoxicity.J Neurosci,1987;7:369
收稿日期：1998-07-27, 百拇医药
单位：第三军医大学大坪医院野战外科研究所五室 400042 重庆市
关键词：谷氨酸受体；脊髓损伤；缺血再灌流；家兔
中国脊柱脊髓杂志990410 摘要 目的：探讨谷氨酸(Glu)及其受体(GluR)在脊髓缺血过程中的量变特征在继发损伤中的作用及2-氨基-膦酸基戊酸(APV)的治疗作用。方法：选用体重2～2.5kg的日本大耳白家兔70只,用腰动脉分支阻断法建立脊髓缺血模型,用放射配基结合分析法检测脊髓缺血损伤后0.5～24h期间及在缺血60min时用APV处理后脊髓神经细胞膜的GluR活性(Bmax，KD)。结果：缺血60min后GluR的最大结合量降低，亲和力升高，开始再灌流后最大结合量迅速升高，至2h到达高峰，之后迅速下降，至再灌流4h降至最低，此后缓慢回升，而亲和力在再灌流0.5h时继续升高，然后下降，再灌流2h降至最低，此后趋势与最大结合量变化相反。APV在再流灌早期使受体活性增高，再灌流4h后无显著性差异。结论：Glu通过其受体中介参与了脊髓缺血再灌流损伤，但在缺血再灌流过程中GluR活性的变化可能具有不同的作用效应，同时也说明脊髓继发性损伤机制单以Glu兴奋性损伤是解释不了的。
, 百拇医药
The change of glutamate receptor activity after ischemic spinal cord injury in the rabbit
ZHUO YU,WU Yamin,LIAO Weihong,et al
Chinese Journal of Spine and Spinal Cord,1999,9(4):212～215
Abstract Objective:To investigate the role of glutamate and glutamate receptor in the secondary injury of spinal cord ischemia-reperfusion injury and its APV effects.Method:The model of ischemia and reperfusion of spinal cord was created by the 60 min occlusion of the lunbar artery in 70 rabbits with the weight of 2.25±0.25kg,the activity (Bmax,KD) of glutamate receptor (GluR) was measured by the radioligand binding assay in the injured group and 2-amino-5-phosphono-valerate(APV) treated group during the 0.5～24h of ischemia decreased.Result:Bmax increased remarkably at the beginning of reperfusion and reached to the peak at 2h of reperfusion and then decreased gradually to the lowest level at 4h of reperfusion.KD continued to drop at 0.5h of reperfusion,after that time,its change was the same as that of the Bmax.APV could improve the activity of GluR during the early period of reperfusion,but there was no significant effect after 4h of reperfusion.Conclusion:Glu involved in the secondary injury of spinal cord ischemia-reperfusion injury by its receptor.But the activity of GluR has different effects in the injury progression.It is suggested that Glu excited toxicity is not the only reasons of the secondary injury of spinal cord ischemia-reperfusion.
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Author,s address Department Five,Research Institute of Surgery，Daping Hospital,The Third Military Medical University,Chongqing,400042
Key word Glutamate receptor Spinal cord injury Ischemia and reperfusion Rabbit
脊髓损伤(SCI)是威胁人类健康的常见创伤之一，其继发损伤致使原本可能恢复的感觉、运动功能变为不可逆的永久性功能障碍。谷氨酸(Glu)是一种典型的兴奋性氨基酸(EAA)，也是典型的兴奋性神经递质〔1、2 〕，脑损伤后早期细胞外Glu浓度明显升高，并具有神经毒性。其兴奋毒性作用主要是通过其受体介导〔3、4〕参与脑继发性损伤。谷氨酸受体(GluR)在脊髓创伤中，特别是在缺血再灌流损伤中的作用及其特征的研究的报道很少。作者用放射配基结合分析法着重研究了兔脊髓缺血损伤后脊髓内GluR活性变化及应用NMDA竞争性拮抗剂2-氨基-5-膦酸基戊酸(APV)治疗的效果，以探讨谷氨酸及其受体在脊髓缺血损伤过程中的量变特征和造成继发性损害的作用机理。
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1 材料和方法
1.1 实验动物分组
健康日本大耳白家兔70只，体重2～2.5kg，雌雄不拘，随机分成4组。Ⅰ组，正常对照组；Ⅱ组，缺血损伤组；Ⅲ组，再灌流损伤组；Ⅳ组，再灌流治疗组，以APV治疗。分别检测各组Glu受体活性，Ⅲ、Ⅳ组分别检测损伤再灌流后0.5h、1h、2h、4h、 8h、24h时谷氨酸受体的活性。
1.2 脊髓缺血损伤模型的建立
用3%戊巴比妥钠(40mg/kg iv)麻醉家兔后，左侧腹背部剪毛、备皮、消毒，在椎体旁纵切一长约6cm的切口，于腹腔后间隙钝性分离腹主动脉及其6支分支腰动脉(以左肾动脉为基准，其上一支腰动脉为上1，其下五支腰动脉依次为下1、下2、下3、下4、下5)，上1、下1、下3、下4、下5分别用1号丝线结扎，下2用血管夹阻断，60min后取走血管夹再灌流，造成腰段脊髓的缺血再灌流损伤。治疗组于结扎60min后即刻从延髓池推注APV(250μmol/50μl)后再取走血管夹。
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1.3 脊髓神经细胞膜GluR活性的测定
1.3.1 兔脊髓神经细胞膜蛋白的制备 参照Mecker〔3〕等方法并作改进。首先用冰生理盐水灌注家兔，分离出脊髓，立即取L4节段脊髓±60mg加入盛有1ml预冷HBS(pH7.4)的匀浆器中，在冰浴中手动匀浆。匀浆后在4℃下以2600～3400r/min离心5min，取上清液。再在冰浴下电动匀浆10min，4℃下4000r/min离心30min，取上清液。再加入适量HBS补充至3ml进行低速离心，条件同上,重复一次。然后低温高速离心(13500r/min)20min，留沉淀，去上清液。在沉淀中加入20倍沉渣体积的冰冻1mmol Tris-HCl(pH7.2)缓冲液反复离心3次，条件同上。最后的沉淀加入适量pH7.2冰冻50mmol Tris-HCl结合缓冲液以制成膜受体蛋白悬液，立即供实验使用。以Lawry法测定受体悬液蛋白浓度。
1.3.2 加样与温育 采用双平行管，按表1方法加样后，摇匀，在37℃恒温水浴中孵化40min，孵化后，立即取出样本，加入4℃ 1mmol Tris-HCl(pH7.4)5ml终止反应，并迅速抽滤，以防止受体-标记配基复合物解离。
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表1 GluR放射配基结合分析法加样 管号
3H-Glu
50pmol(μl)
50mmol Tris-HCl
(μl)
Glu
50nmol(μl)
样本
(μl)
1
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100
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注：1～8号管为总体结合管，9～12管为非特异结合管
1.3.3 分离和测量 反应后的样本，速以多头细胞收集器，双层69型玻璃纤维滤纸迭加负压抽滤，将与受体结合的标记配基和游离未结合的标记配基分开，然后再用1 mmol冰Tris-HCl 5ml反复冲洗膜3次，滤膜在80℃烘烤1h，剪下样本，依次放入盛有5ml PPO-POPOP-二甲苯闪烁液的闪烁瓶中，用多功能闪烁计数仪测定其放射活性(cpm)。以空白滤纸点样进行校正，仪器效率约为67%。
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1.3.4 数据处理 总结合管计数减去同一浓度非特异结合管的计数即为各点特异性结合计数(cpm)。再按下列公式计算：
以Scatchard作图，分别计算出脊髓神经细胞膜GluR的最大结合量(Bmax)和平衡解离常数(KD)，单位分别为pmol/mg蛋白和nmol/L。
2 结果
2.1 再灌流损伤脊髓神经细胞膜的GluR活性变化
GluR与配基的结合具有饱和性。当于一定量细胞膜蛋白制剂中加入递增浓度的放射性配基时，受体与配基的结合呈指数关系增加，当配基浓度达到一定量时，受体与配基的结合即可达到饱和。根据饱和曲线，可算出脊髓中GluR的Bmax及KD值，分别代表在结合测定中能与配体结合的受体量以及反映受体与配体结合的亲和力参数。正常对照组脊髓神经细胞膜GluR的Bmax为4.205±0.24pmol/mg蛋白，KD值为 2.532±0.51nmol/L。
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脊髓缺血损伤后脊髓神经细胞膜GluR的最大结合量(Bmax)显著下降(与正常对照组比P<0.01)，再灌流后早期显著升高，至再灌2h升至最高点，但仍显著低于正常值(与损伤对照组相比P<0.01，与正常组相比P<0.01)，然后大幅下降，至再灌流4h降至最低点(比正常对照组降低了84.4%，P<0.01，比损伤对照组降低了40%，P<0.01),之后略有回升但不显著。GluR的KD值在损伤后显著降低 (与正常组相比P<0.01)，再灌流0.5h继续大幅下降(与损伤对照组比P<0.01)，此后开始回升，变化趋势与GluR的最大结合量(Bmax)变化趋势相同(表2)。
2.2 APV对再灌流损伤脊髓神经细胞膜GluR的影响
APV处理组使GluR的Bmax在再灌初期显著升高(治疗组再灌0.5h、1h时与损伤再灌组同期相比P<0.01，2h与损伤再灌组同期相比P<0.05)，再灌4h后已无显著改变(P>0.05，表2)；对KD值无显著作用。
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表2 兔脊髓神经细胞膜GluR活性变化
(
±s) 组别n
GluR
Bmax
(pmol/mg蛋白)
KD
(nmol/L)
Ⅰ组
5
4.205±0.24
, 百拇医药
2.532±0.51
Ⅱ组
5
1.091±0.14①
0.717±0.07①
Ⅲ组再灌
0.5h
1h
2h
4
8
24
, 百拇医药
5
5
5
5
5
5
1.837±0.15①②
2.389±0.22①②
3.182±0.26①②
0.657±0.03①②
0.689±0.03①②
, 百拇医药
0.764±0.12①②
0.415±0.05①②
1.415±0.27①②
1.442±0.25①②
0.132±0.06①②
0.379±0.04①②
0.402±0.08①②
Ⅳ组再灌
0.5h
1h
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2h
4
8
24
5
5
5
5
5
5
2.015±0.15③
3.233±0.24③
3.567±0.21④
, 百拇医药
0.683±0.03
0.759±0.10
0.808±0.12
0.452±0.03
1.425±0.17
1.489±0.16
0.190±0.04
0.474±0.13
0.504±0.10
①与Ⅰ组比P<0.01，②与Ⅱ组比P<0.01，③与Ⅲ组同期相比P<0.01，④与Ⅲ组同期相比P<0.05
, 百拇医药 3 讨论
文献报道〔5～8〕，脊髓损伤后早期细胞外Glu浓度明显升高，Glu具有神经毒性，其毒性作用是由其受体介导的。GluR的活化引起神经细胞去极化，使神经细胞兴奋性增高，导致Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cl-等离子通道的通透性增加〔9、10〕，阳离子通道开放使Na+、Ca2+持续大量内流，Cl-和水被动内流造成急性水肿和细胞内Ca2+超载，使神经细胞的脂质和蛋白质代谢紊乱，一系列的变化引起不可逆性蛋白质变性而致神经细胞死亡，这可能是造成脊髓继发性损伤的原因之一。GluR在脊髓缺血再灌流过程中的量变特征及机制的研究目前尚未见报道。
目前对受体特性的研究主要是通过测定受体最大结合量(Bmax)和平衡解离常数(KD)来进行。一般认为Bmax与受体的密度正相关，KD值与受体-配体的亲和力呈负相关，KD值升高，说明受体对配体的亲和力下降。本文研究结果提示，GluR的最大结合量(Bmax)——受体的密度，在缺血损伤后明显降低，可能是缺血后机体的应激反应使EAA类特别是Glu释放增加，GluR对突然大幅度升高的Glu的抑制反应，对机体起一定的保护作用；但KD的降低，受体亲和力升高，导致受体与配体结合时间延长(受体-配体的内化作用增强而导致的)，减弱或部分削弱了Bmax降低的保护效应，致使高浓度的Glu发挥其强大的兴奋毒性作用。随后由于Glu过量释放使其受体激活，GluR的活化引起短期内Glu摄取的抑制，刺激Glu进一步释放，造成恶性循环。同时受体亲和力在0.5h 时继续升高，加重机体损伤。此后高浓度的Glu使GluR过度兴奋，使受体亲和力下降，受体与配体结合时间缩短，使受体-配体的内化作用减弱而导致受体密度升高，从而GluR对Glu的兴奋毒性起放大作用，加重了缺血神经元的损伤。再灌流2h后由于神经元不可逆的损伤、死亡以及创伤所引起的各种毒素的内化作用增强，使受体合成受抑制，且使部分受体加速分解以及变性，导致受体密度的大幅下降，至再灌流4h时降至最低。此后由于Glu释放的减少，受体亲和力的降低，而血液循环恢复不明显，缺氧状况改善有限，使受体密度虽略有升高，但不显著。缺血时GluR的减少可能是集体的代偿性神经保护作用，再灌流4h时明显下降可能是脊髓神经元明显受损的反应。因此，Glu通过其受体中介参与了脊髓缺血及再灌流损伤，GluR在缺血再灌流损伤过程中可能具有保护和损伤双重效应，这是一个值得深入认真探讨的问题。
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APV在再灌流早期能使GluR的密度显著升高，对KD值无显著作用。以往APV的研究多是离体的治疗作用，本研究显示该拮抗剂对在体的治疗作用在损伤早期不是很明显，反而有加重损伤的趋势，对远期治疗可能有一定作用。这也可能与缺血再灌流损伤的程度及APV用药的方式、剂量等因素有关。同时也说明脊髓继发性损伤机制单靠Glu兴奋性损伤是解释不了的。
4 参考文献
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收稿日期：1998-07-27, 百拇医药