TT病毒在非甲～庚型和重型肝炎中感染的研究
作者：庄立琳 黄其炯 夏宁邵 张军 沈春奇 饶日春
单位：363000 福建省漳州市，中国人民解放军第一七五医院(庄立琳、黄其 炯、饶日春)；厦门大学肿瘤细胞工程国家专业实验室(夏宁邵、张军、沈春奇)
关键词：
中华医学杂志/990411 我们根据日本报道的TT病毒(TTV)DNA序列[1]，设计合成两对特异性聚合 酶链反应(PCR)引物，用巢式PCR(nested-PCR)对非甲～庚型和重型肝炎患者感染TTV情况进行研究。对其中1份TTV-DNA阳性的PCR产物进行纯化、克隆、测序，与日 本报道的TTV-DNA序列进行同源性比较。并对感染TT病毒的重型肝炎病人临床特点 进行分析。
一、对象和方法
1.病人血清：127份血清标本均采自1997年1月至1998年3月住我院的肝炎病人。按1995 年第五次全国传染病寄生虫病学术会议修订的病毒性肝炎诊断标准诊断，急性肝炎30例 ，慢性肝炎58例，重型肝炎39例。88例急、慢性肝炎均为非甲～庚型(以下称非甲～庚型肝炎) 。39例重型肝炎中非甲～ 庚型5例，甲型3例，乙型16例，戊型5例，甲型+乙型、乙型+丙型+戊型和乙型+丁型 +庚型各2例，乙型+丙型、乙型+丁型、丙型+戊型和戊型+庚型各1例。
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2.肝炎病毒标志物检测：病人血清均进行6种肝炎病毒标志物检测 ，其中甲型肝炎病毒抗体(抗HAV-IgM)、乙型肝炎病毒抗体(抗HBV-IgM )和 丁型肝炎病毒抗体(抗HDV-IgG)用ELISA法检测，HBV-DNA、HCV-RNA、HEV-RNA和HGV- RNA用PCR法检测。
3.设计合成TTV-DNA巢式PCR引物：外引物对：TTVF1：5′-TGCTACGTC ACTAACCAC-3′(n t5-22)，TTVR1：5′-CTCCTCTGCGGCGTCTCCTTA-3′(nt733-713)，扩增片段长度为729 b p 。内侧引物对：TTVF2：5′-GTGCACTTCCGAATGGC-3′(nt95- 111)，TTVR2:5′-GTAATGC CTGCCAATAAAC-3′(nt283-265)，扩增片段长度为189 bp。
4.巢式PCR检测TTV-DNA：除将第一次PCR产物1 μl进行第二次PCR反应外 ，其它操作参照文献[2]。
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5.PCR产物纯化、克隆、测序：将其中1份扩增片段(TS1)用Wizard(r)PCR Preps D NA纯化系统(Promega公司)纯化，克隆入pGEM-TEasy载体，转化大肠杆菌DH5α株。采用双 链模板测序，双链模板提取采用碱裂解，RNaseA消化，氯仿2次抽提，异丙醇第一次沉淀，R EG-8000第二次沉淀提取。提取的双链模板，采用双脱氧链终止法，用T7启动子引物(5′- TAATAGGACTCACTATAGGG-3′)在ABIPRISMTM 377型DNA测序仪上进行Dye Terminator 反应，测序所用成套试剂为美国ABI公司产品。每份标本测3个克隆，纠正偏差后获得一段199 bp 的序列。所获序列输入计算机，用DNASIS软件(Hitachi Software Engineering Co.1992) 与TTV作同源性比较。
二、结果
1.88例非甲～庚型肝炎病人TTV-DNA阳性16例(18%)，男12例，女4例，年龄4～67岁，平 均(41±17)岁。其中急性肝炎5例(31.3%)，慢性肝炎11例(68.7%)。
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2.39例重型肝炎病人中TTV-DNA阳性16例(41%)，男14例，女2例；年龄25～83岁，平均(50±16)岁；急性重型肝炎4例(25%)，亚急性重型肝炎3例(19%)，慢性重型肝炎9 例(56%)；病原分型,非甲～庚型3例(19%)，甲型2例(13%)，乙型5例(31%)，戊型、 甲型+乙型、丙型+戊型、戊型+庚型、乙型+丙型+戊型和乙型+丁型+庚型各1例(6% )。
3.TS1序列与TTV相应片段的同源性为87%，见图1。
*注：#插入 -相同序列
图1 TTV与TS1的DNA序列比较
三、讨论
1997年日本学者Nishizawa等[1]从一个输血后非甲～庚型肝炎病人血清中克隆 到一 段未知DNA序列，经进一步研究表明该序列为单链DNA，与一般病毒相似，命名为TTV。迄今 基因库中检索到的TTV序列仅有1条，为该研究小组发表的部分DNA序列(收录号：AB008394) ，长3 739 bp，有两个开放读码框架(ORF)，分别编码172个氨基酸(CRF2)和774个氨基酸(OR F1)[3]。将该序列及编码氨基酸与已知核酸、氨基酸比较，均未见任何较大同源性 。
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TS1与TTV相应片段的同源性为87%，127例肝炎患者TTV-DNA阳性32例，证实了我国肝炎病 人中存在TTV-DNA感染。日本学者Nishizawa等报告的TTV-DNA阳性的肝炎病人均为输血后肝炎，我们检测TTV-DNA阳性的32例肝炎病人中仅7例有输血史(22%)，而25例(78%)无输血史，说明除输血途径外，其它途径也可以感染TTV。重型肝炎病人TTV阳性率为41%，非甲～庚型肝炎病人为18%，重型肝炎病人感染率明显高 于非甲～庚肝炎病人(P<0.01)。在肝炎病人中TTV感染者年龄普遍偏大，除1例4岁患 儿外，其他病人均在21岁以上，其中大于30岁有27人，占84%，老年人(≥60岁)有9人 ，占28%。平均年龄重型肝炎病人为50岁，非甲～庚型肝炎病人为43岁，重型肝炎病人年龄 明显大于非甲～庚型肝炎病人(P<0.05)。重型肝炎病人中单一TTV感染的3例，说明T T V感染可能造成重型肝炎。3例单一TTV感染的重型肝炎患者临床症状相对较轻，3例均为治 愈或好转，治愈好转率为100%。而TTV合并其它肝炎病毒感染的13例重肝患者，5例治愈 或好转，治愈好转率为36%。治愈好转率单一TTV感染重肝病人显著高于TTV合并其它肝炎病 毒感染的重肝病人(P<0.05)。
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参考文献
[1] Nishizawa T, Okamoto H, Konishi K. et al. A novel DNA v irus(TTV) associated with elevated transaminase levels in posttransfsi on hepati tis of unknown etiology. Biochem Biophys Res Commun，1997,241:92-97.
[2] 戴利成，施柏年，钱志尧，等.套式聚合酶链反应检测伤寒杆菌DNA 及 其临床应用.中华传染病杂志，1995；2：77-79.
[3] Okamoto H, Nishizawa T, Kato N. et al. Molecular cloning and ch aracterization of a novel DNA Virus(TTV) associated with posttransfusion hepatit is of unknown etiology. Hepatol Res，1998,10:1-16.
(收稿：1998-06-23 修回：1998-12-16), 百拇医药
单位：363000 福建省漳州市，中国人民解放军第一七五医院(庄立琳、黄其 炯、饶日春)；厦门大学肿瘤细胞工程国家专业实验室(夏宁邵、张军、沈春奇)
关键词：
中华医学杂志/990411 我们根据日本报道的TT病毒(TTV)DNA序列[1]，设计合成两对特异性聚合 酶链反应(PCR)引物，用巢式PCR(nested-PCR)对非甲～庚型和重型肝炎患者感染TTV情况进行研究。对其中1份TTV-DNA阳性的PCR产物进行纯化、克隆、测序，与日 本报道的TTV-DNA序列进行同源性比较。并对感染TT病毒的重型肝炎病人临床特点 进行分析。
一、对象和方法
1.病人血清：127份血清标本均采自1997年1月至1998年3月住我院的肝炎病人。按1995 年第五次全国传染病寄生虫病学术会议修订的病毒性肝炎诊断标准诊断，急性肝炎30例 ，慢性肝炎58例，重型肝炎39例。88例急、慢性肝炎均为非甲～庚型(以下称非甲～庚型肝炎) 。39例重型肝炎中非甲～ 庚型5例，甲型3例，乙型16例，戊型5例，甲型+乙型、乙型+丙型+戊型和乙型+丁型 +庚型各2例，乙型+丙型、乙型+丁型、丙型+戊型和戊型+庚型各1例。
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2.肝炎病毒标志物检测：病人血清均进行6种肝炎病毒标志物检测 ，其中甲型肝炎病毒抗体(抗HAV-IgM)、乙型肝炎病毒抗体(抗HBV-IgM )和 丁型肝炎病毒抗体(抗HDV-IgG)用ELISA法检测，HBV-DNA、HCV-RNA、HEV-RNA和HGV- RNA用PCR法检测。
3.设计合成TTV-DNA巢式PCR引物：外引物对：TTVF1：5′-TGCTACGTC ACTAACCAC-3′(n t5-22)，TTVR1：5′-CTCCTCTGCGGCGTCTCCTTA-3′(nt733-713)，扩增片段长度为729 b p 。内侧引物对：TTVF2：5′-GTGCACTTCCGAATGGC-3′(nt95- 111)，TTVR2:5′-GTAATGC CTGCCAATAAAC-3′(nt283-265)，扩增片段长度为189 bp。
4.巢式PCR检测TTV-DNA：除将第一次PCR产物1 μl进行第二次PCR反应外 ，其它操作参照文献[2]。
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5.PCR产物纯化、克隆、测序：将其中1份扩增片段(TS1)用Wizard(r)PCR Preps D NA纯化系统(Promega公司)纯化，克隆入pGEM-TEasy载体，转化大肠杆菌DH5α株。采用双 链模板测序，双链模板提取采用碱裂解，RNaseA消化，氯仿2次抽提，异丙醇第一次沉淀，R EG-8000第二次沉淀提取。提取的双链模板，采用双脱氧链终止法，用T7启动子引物(5′- TAATAGGACTCACTATAGGG-3′)在ABIPRISMTM 377型DNA测序仪上进行Dye Terminator 反应，测序所用成套试剂为美国ABI公司产品。每份标本测3个克隆，纠正偏差后获得一段199 bp 的序列。所获序列输入计算机，用DNASIS软件(Hitachi Software Engineering Co.1992) 与TTV作同源性比较。
二、结果
1.88例非甲～庚型肝炎病人TTV-DNA阳性16例(18%)，男12例，女4例，年龄4～67岁，平 均(41±17)岁。其中急性肝炎5例(31.3%)，慢性肝炎11例(68.7%)。
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2.39例重型肝炎病人中TTV-DNA阳性16例(41%)，男14例，女2例；年龄25～83岁，平均(50±16)岁；急性重型肝炎4例(25%)，亚急性重型肝炎3例(19%)，慢性重型肝炎9 例(56%)；病原分型,非甲～庚型3例(19%)，甲型2例(13%)，乙型5例(31%)，戊型、 甲型+乙型、丙型+戊型、戊型+庚型、乙型+丙型+戊型和乙型+丁型+庚型各1例(6% )。
3.TS1序列与TTV相应片段的同源性为87%，见图1。
*注：#插入 -相同序列
图1 TTV与TS1的DNA序列比较
三、讨论
1997年日本学者Nishizawa等[1]从一个输血后非甲～庚型肝炎病人血清中克隆 到一 段未知DNA序列，经进一步研究表明该序列为单链DNA，与一般病毒相似，命名为TTV。迄今 基因库中检索到的TTV序列仅有1条，为该研究小组发表的部分DNA序列(收录号：AB008394) ，长3 739 bp，有两个开放读码框架(ORF)，分别编码172个氨基酸(CRF2)和774个氨基酸(OR F1)[3]。将该序列及编码氨基酸与已知核酸、氨基酸比较，均未见任何较大同源性 。
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TS1与TTV相应片段的同源性为87%，127例肝炎患者TTV-DNA阳性32例，证实了我国肝炎病 人中存在TTV-DNA感染。日本学者Nishizawa等报告的TTV-DNA阳性的肝炎病人均为输血后肝炎，我们检测TTV-DNA阳性的32例肝炎病人中仅7例有输血史(22%)，而25例(78%)无输血史，说明除输血途径外，其它途径也可以感染TTV。重型肝炎病人TTV阳性率为41%，非甲～庚型肝炎病人为18%，重型肝炎病人感染率明显高 于非甲～庚肝炎病人(P<0.01)。在肝炎病人中TTV感染者年龄普遍偏大，除1例4岁患 儿外，其他病人均在21岁以上，其中大于30岁有27人，占84%，老年人(≥60岁)有9人 ，占28%。平均年龄重型肝炎病人为50岁，非甲～庚型肝炎病人为43岁，重型肝炎病人年龄 明显大于非甲～庚型肝炎病人(P<0.05)。重型肝炎病人中单一TTV感染的3例，说明T T V感染可能造成重型肝炎。3例单一TTV感染的重型肝炎患者临床症状相对较轻，3例均为治 愈或好转，治愈好转率为100%。而TTV合并其它肝炎病毒感染的13例重肝患者，5例治愈 或好转，治愈好转率为36%。治愈好转率单一TTV感染重肝病人显著高于TTV合并其它肝炎病 毒感染的重肝病人(P<0.05)。
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参考文献
[1] Nishizawa T, Okamoto H, Konishi K. et al. A novel DNA v irus(TTV) associated with elevated transaminase levels in posttransfsi on hepati tis of unknown etiology. Biochem Biophys Res Commun，1997,241:92-97.
[2] 戴利成，施柏年，钱志尧，等.套式聚合酶链反应检测伤寒杆菌DNA 及 其临床应用.中华传染病杂志，1995；2：77-79.
[3] Okamoto H, Nishizawa T, Kato N. et al. Molecular cloning and ch aracterization of a novel DNA Virus(TTV) associated with posttransfusion hepatit is of unknown etiology. Hepatol Res，1998,10:1-16.
(收稿：1998-06-23 修回：1998-12-16), 百拇医药