信号调节蛋白与肝癌相关性的研究
作者：李宝安 王红阳 陈正军 吴孟超
单位：200438 上海 第二军医大学信号转导研究室，东方肝胆外科医院
关键词：癌，肝细胞；信号转递；基因表达
中华医学杂志/990408 【摘要】 目的 研究信号调节蛋白SIRPα与肝细胞肝癌的发生及侵袭之间的联系。方法 应用Northern杂交及免疫组织化学技术检测了42对肝细胞肝癌和相应癌旁肝组织内SIRPα基因表达的变化，并结合各组织标本的病理学特点进行分析。结果 SIRPα的3.9kb转录子及2.5kb转录子分别在21例、27例肝癌组织内表达水平明显下降。直径>5cm的大肝癌SIRPα的表达下降率显著高于直径≤5cm的小肝癌，有癌栓形成的肝癌SIRPα的表达下降率显著高于无癌栓的肝癌。SIRPα的表达下降与患者年龄、肿瘤分级、包膜完整性、血清AFP水平、是否有乙肝感染无明显相关性。免疫组织化学显示在正常肝细胞、胆管上皮细胞、Ito细胞、再生肝细胞、新生胆管细胞及部分肝细胞肝癌(HCC)细胞均有表达。表达下降的HCC细胞表现为阳性颗粒变淡、变少，部分HCC细胞或区域完全无染色。结论 SIRPα尤其是2.5kb转录子在肝癌内表达下降，与肝癌的生长、侵袭密切相关，可能为肝癌发生发展过程中一个重要的负调控因子。
, 百拇医药
The association between signal-regulatory protein α and hepatocellular carcinoma LI Baoan, WANG Hongyang, CHEN Zhengjun, et al. International Co-operative Laboratory for Signal Transduction, Second Military Medical University, Shanghai 200438
【Abstract】 Objective To study the roles of signal-regulatory protein α (SIRPα) in the development of hepatocellular carcinoma (HCC). Methods 42 pairs of HCC and the surrounding noncancerous hepatic tissues were used . The expression of SIRPα in various tissues was determined by Northern blot analysis and immunohistochemistry assay, by which together with the pathologic characteristics of each sample, the role of SIRPα was investigated. Results The expression of SIRPα significantly decreased in 21 cases of samples (50.0%) to the 3.9kb transcript and 27 cases of samples (64.3%) to the 2.5kb transcript respectively. The SIRPα decreasing rate in large HCC(>5cm in diameter)was higher than in small HCC (≤5cm in diameter) , and in HCC with cancer embolus was higher than that of without cancer embolus . No association was found between the SIRPα expression and the patient's age, tumor grade, tumor capsule, serum AFP level, and HBV infection. Immunohistochemistry showed that all the normal hepatocytes, cholangioepithelial cells, Ito cells, regenerated hepatocytes, new generated cholangioepithelial cells and part of HCC cells were positive. The HCC tissues in which SIRPα was down-regulated showed positive particles becoming weaker and less, and some tumor cells and area were completely negative. Conclusion The expression of SIRPα especially 2.5kb transcript is down-regulated in HCC, which is closely related with the tumor growth and invasiveness. SIRPα may be an important negative regulator of HCC.
, 百拇医药
【Key words】 Hepatocellular carcinoma Signal transduction Expression
(Natl Med J China, 1999,79:268-270)
Ras-MAPK信号通路与细胞生长、增殖、癌变过程密切相关，新近分离出的一种抑制性受体信号调节蛋白α(signal-regulatory protein α, SIRPα)则可以与含有SH2(Src homology 2)结构域的酪氨酸磷酸酯酶SHP-2结合，抑制该信号通路的传递[1]。但其与肿瘤间的关系尚未阐明,本研究应用Northern杂交及免疫组织化学技术检测了SIRPα在肿瘤内的表达状态，并探讨其与肝癌临床病理特征间的联系。
材料与方法
一、材料
, http://www.100md.com
1.标本：肝细胞肝癌(HCC)和相应癌旁肝组织来源于1996年11月至1997年5月上海东方肝胆外科医院手术切除标本，共42例，经病理证实；6例正常肝组织取自肝血管瘤患者。石蜡切片来源于同一组标本。
2.主要试剂：含人信号调节蛋白SIRPα1翻译区cDNA的质粒由德国马普生物化学研究所Ullrich教授提供，SIRPα胞内区-GST融合蛋白多克隆抗体由本室人员(王红阳等)制备，Oligo dT Cellulose为GIBCO BRL产品，DNA标记试剂盒、ABC试剂盒以及生物素化羊抗兔IgG为Promega产品。
二、方法
1.Northern杂交分析：探针标记采用随机引物法，以α-32P-dATP标记SIRPα1。提取组织总RNA[2]，过Oligo dT Cellulose柱，回收mRNA并定量。每个样品取2.5 μg上样，然后进行含甲醛的mRNA电泳、吸印、预杂交、杂交、洗膜及放射自显影。最后洗去探针，以β-actin为内参照，对同一标本进行杂交。用SX-100生物影像分析系统对杂交结果进行分析，以癌旁肝杂交信号相对灰度值为1，肝癌的相对灰度值与之比较。
, 百拇医药
由于T/N最大不超过1.25，因此，判定T/N<0.75为表达下降，T/N<0.5为表达明显下降。
2.免疫组织化学：采用ABC法，石蜡切片经常规脱蜡，0.3%H2O2甲醇去除内源性过氧化物酶，正常羊血清(1∶20)封闭，一抗用兔抗人SIRPα多抗(1∶400)，二抗用生物素标记羊抗兔IgG(1∶100)，DAB显色。阴性对照为PBS代替一抗，阳性对照为已知SIRPα阳性肝组织。
结果
一、SIRPα在肝癌组织内的表达
SIRPα共有3.9 kb、2.5kb 2个转录子，在42例肝癌组织内分别有27例(64.3%)、32例(76.2%)表达下降(T/N<0.75)；分别有21例(50.0%)、27例(64.3%)表达明显下降(T/N<0.5)。按21例表达明显下降的肿瘤标本进行分析，发现其2.5kb转录子的T/N值(0.21±0.03)显著低于3.9kb转录子的T/N值(0.34±0.07)(t检验，P<0.01)。按27例表达下降的肿瘤标本进行分析，亦有显著差异(图1)。
, 百拇医药
注：N癌旁肝组织；T肿瘤组织；2.5 kb转录子比3.9kb转录子表达下降更为明显
图1 SIRPα在肝癌及癌旁肝组织内的Northern杂交结果
二、肝癌组织中SIRPα表达与病理指标的关系
SIRPα表达与肿瘤直径及癌栓形成有明显相关性。未发现SIRPα表达与肿瘤分化程度、包膜完整性、血清AFP及乙肝感染之间的明确关系(表1)。
表1 SIRPα在肝癌内的表达与肝癌组织病理特征的关系 病理特点
总
例
数
肿瘤内表达
, http://www.100md.com
下降例数
肿瘤内表达
下降百分率
P值
(χ2检验)
3.9kb
转录子
2.5kb
转录子
3.9kb
转录子
2.5kb
转录子
, 百拇医药
肿瘤大小
≤5cm
17
5
7
29.4
41.2
>5cm
25
16
20
64.0
80.0
, 百拇医药
<0.05
肿瘤分化
Ⅰ～Ⅱ级
10
4
6
40.0
60.0
Ⅲ～Ⅳ级
32
17
21
53.1
, http://www.100md.com
65.6
>0.05
包膜完整
+
34
18
23
52.9
67.6
-
8
3
4
, http://www.100md.com 37.5
50.0
>0.05
癌栓形成
有
29
18
22
62.1
75.8
无
13
3
5
, http://www.100md.com
23.0
38.5
<0.05
AFP
≥25
23
13
16
56.5
69.6
<25
19
8
, 百拇医药
11
42.1
57.9
>0.05
乙肝感染
+
36
18
23
50.0
63.9
-
6
, 百拇医药 3
4
50.0
66.7
>0.05
三、免疫组织化学结果
显示，SIRPα在正常肝组织中肝细胞、胆管上皮细胞及Ito细胞内均呈阳性。癌旁肝多为肝硬化，硬化结节中的肝细胞、再生胆管呈阳性。肝癌细胞亦可见阳性表达，表达下降的肝癌组织内可见棕色颗粒变少变淡，部分癌细胞或部分肿瘤区域完全无染色。阳性细胞染色大部分位于细胞膜，部分在胞浆内散在分布(图2，3)。
图2 SIRPα在肝癌(右视野)及癌旁肝(左视野)
, 百拇医药
组织内免疫组织化学结果，肝癌组织阳性颗粒变淡变少 ×100
图3 部分肝癌细胞及区域完全阴性，癌旁肝组织阳性，主要位于细胞膜，少量胞浆内散在分布 ×400
讨论
已知许多生长因子的效应是通过高亲和性受体酪氨酸蛋白激酶(RTK)所介导，直到最近人们才对这一信号传递系统有了更进一步的认识。较为公认的信号途径是：生长因子受体(具有RTK活性)→SHP2→Grb2-SOS→Ras→MAPKKK(Raf)→MAPKK→MAPK(ERK)→生物学效应，SIRPα则通过与SHP-2的结合而可能抑制这一信号传递[1]。众所周知，肿瘤的基因变化涉及到上述信号通路的许多环节，从某种意义上讲，肿瘤的形成是由于信号转导系统失去控制，才导致细胞无限生长，并产生恶性表型。Chen和Kharitonenkow等[1]的体外实验已证明，在共转染v-fms(CSF-1受体突变)及SIRPα的NIH3T3细胞内，观察到SIRPα的表达可以明显抑制v-fms对细胞的转化作用，这为SIRPα在肿瘤细胞信号通路中的潜在作用提供了重要的理论依据。就肝癌来讲，SHP-2上游属RTK的癌基因或异常表达的基因就包括c-fms(CSFIR)、c-erb-2(neu)/c-erb-1(EGFR)、c-met(HGFR),异常表达的生长因子包括IGF-Ⅱ、HGF、TGFα等。因此，SIRPα在肝癌的信号转导途径上的作用意义重大，SIRPα在肿瘤的信号转导途径上究竟发生什么变化，起什么作用是一个令人感兴趣的问题。 我们在实验中发现，肝癌组织内该基因表达下调，推测该基因对肿瘤细胞Ras-MAPK信号通路抑制作用减弱，可能是导致肿瘤细胞生长失去控制的原因之一。其中，2.5kb转录子在肿瘤组织内表达下降更为明显，提示在肿瘤的发生发展过程中起更重要的作用。结合肿瘤病理学特点，发现SIRPα的表达与肿瘤大小明显相关，可见在小肝癌向大肝癌演进中，恶性程度逐渐增高过程中，SIRPα表达有减弱趋势。
, 百拇医药
肝癌的侵袭转移是一个复杂的过程，涉及到细胞粘附、基质降解、细胞迁移等多个环节，细胞粘附是其中的重要步骤。最近，有人发现SIRPα作为一种粘附分子在神经细胞的生长发育中起重要的调控作用[3]，因此可以推断，它可能还和肿瘤的侵袭转移有一定关系。本组资料显示，有癌栓形成的肝癌内SIRPα表达下降率明显高于无癌栓的肝癌，这可能是由于SIRPα表达降低，肝癌细胞间及与基质粘附能力下降，在其它因素的协同作用下，导致肿瘤细胞易于向周围组织移动扩散，形成癌栓。
以上研究结果表明，SIRPα的低表达与肝癌的生长、侵袭密切相关，可能为肝癌发生发展过程中一个重要的负调控因子。
本课题为国家自然科学基金重点资助项目(39870758)
参考文献
[1] Chen ZJ,Kharitonenkow A, Sures I, et al. A famiry of proteins that inhibit signalling through tyrosine kinase receptors.Nature,1997,386:181-186.
, 百拇医药
[2] Siebert PD, Chenchik A. Modified acid granidinium thiocynati-phenol-chloroform RNA extraction method which greatly reduces DNA contamination. Nucl Acid Res,1993,21:2019-2021.
[3] Comu A, Weng W, Olinsky S, et al.The murine P84 neural adhesion molecule is SHPS-1, a member of the phosphatase-binding protein family. J Neurosci, 1997,17:8702.
(收稿：1998-04-15 修回：1999-01-16), http://www.100md.com
单位：200438 上海 第二军医大学信号转导研究室，东方肝胆外科医院
关键词：癌，肝细胞；信号转递；基因表达
中华医学杂志/990408 【摘要】 目的 研究信号调节蛋白SIRPα与肝细胞肝癌的发生及侵袭之间的联系。方法 应用Northern杂交及免疫组织化学技术检测了42对肝细胞肝癌和相应癌旁肝组织内SIRPα基因表达的变化，并结合各组织标本的病理学特点进行分析。结果 SIRPα的3.9kb转录子及2.5kb转录子分别在21例、27例肝癌组织内表达水平明显下降。直径>5cm的大肝癌SIRPα的表达下降率显著高于直径≤5cm的小肝癌，有癌栓形成的肝癌SIRPα的表达下降率显著高于无癌栓的肝癌。SIRPα的表达下降与患者年龄、肿瘤分级、包膜完整性、血清AFP水平、是否有乙肝感染无明显相关性。免疫组织化学显示在正常肝细胞、胆管上皮细胞、Ito细胞、再生肝细胞、新生胆管细胞及部分肝细胞肝癌(HCC)细胞均有表达。表达下降的HCC细胞表现为阳性颗粒变淡、变少，部分HCC细胞或区域完全无染色。结论 SIRPα尤其是2.5kb转录子在肝癌内表达下降，与肝癌的生长、侵袭密切相关，可能为肝癌发生发展过程中一个重要的负调控因子。
, 百拇医药
The association between signal-regulatory protein α and hepatocellular carcinoma LI Baoan, WANG Hongyang, CHEN Zhengjun, et al. International Co-operative Laboratory for Signal Transduction, Second Military Medical University, Shanghai 200438
【Abstract】 Objective To study the roles of signal-regulatory protein α (SIRPα) in the development of hepatocellular carcinoma (HCC). Methods 42 pairs of HCC and the surrounding noncancerous hepatic tissues were used . The expression of SIRPα in various tissues was determined by Northern blot analysis and immunohistochemistry assay, by which together with the pathologic characteristics of each sample, the role of SIRPα was investigated. Results The expression of SIRPα significantly decreased in 21 cases of samples (50.0%) to the 3.9kb transcript and 27 cases of samples (64.3%) to the 2.5kb transcript respectively. The SIRPα decreasing rate in large HCC(>5cm in diameter)was higher than in small HCC (≤5cm in diameter) , and in HCC with cancer embolus was higher than that of without cancer embolus . No association was found between the SIRPα expression and the patient's age, tumor grade, tumor capsule, serum AFP level, and HBV infection. Immunohistochemistry showed that all the normal hepatocytes, cholangioepithelial cells, Ito cells, regenerated hepatocytes, new generated cholangioepithelial cells and part of HCC cells were positive. The HCC tissues in which SIRPα was down-regulated showed positive particles becoming weaker and less, and some tumor cells and area were completely negative. Conclusion The expression of SIRPα especially 2.5kb transcript is down-regulated in HCC, which is closely related with the tumor growth and invasiveness. SIRPα may be an important negative regulator of HCC.
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【Key words】 Hepatocellular carcinoma Signal transduction Expression
(Natl Med J China, 1999,79:268-270)
Ras-MAPK信号通路与细胞生长、增殖、癌变过程密切相关，新近分离出的一种抑制性受体信号调节蛋白α(signal-regulatory protein α, SIRPα)则可以与含有SH2(Src homology 2)结构域的酪氨酸磷酸酯酶SHP-2结合，抑制该信号通路的传递[1]。但其与肿瘤间的关系尚未阐明,本研究应用Northern杂交及免疫组织化学技术检测了SIRPα在肿瘤内的表达状态，并探讨其与肝癌临床病理特征间的联系。
材料与方法
一、材料
, http://www.100md.com
1.标本：肝细胞肝癌(HCC)和相应癌旁肝组织来源于1996年11月至1997年5月上海东方肝胆外科医院手术切除标本，共42例，经病理证实；6例正常肝组织取自肝血管瘤患者。石蜡切片来源于同一组标本。
2.主要试剂：含人信号调节蛋白SIRPα1翻译区cDNA的质粒由德国马普生物化学研究所Ullrich教授提供，SIRPα胞内区-GST融合蛋白多克隆抗体由本室人员(王红阳等)制备，Oligo dT Cellulose为GIBCO BRL产品，DNA标记试剂盒、ABC试剂盒以及生物素化羊抗兔IgG为Promega产品。
二、方法
1.Northern杂交分析：探针标记采用随机引物法，以α-32P-dATP标记SIRPα1。提取组织总RNA[2]，过Oligo dT Cellulose柱，回收mRNA并定量。每个样品取2.5 μg上样，然后进行含甲醛的mRNA电泳、吸印、预杂交、杂交、洗膜及放射自显影。最后洗去探针，以β-actin为内参照，对同一标本进行杂交。用SX-100生物影像分析系统对杂交结果进行分析，以癌旁肝杂交信号相对灰度值为1，肝癌的相对灰度值与之比较。
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由于T/N最大不超过1.25，因此，判定T/N<0.75为表达下降，T/N<0.5为表达明显下降。
2.免疫组织化学：采用ABC法，石蜡切片经常规脱蜡，0.3%H2O2甲醇去除内源性过氧化物酶，正常羊血清(1∶20)封闭，一抗用兔抗人SIRPα多抗(1∶400)，二抗用生物素标记羊抗兔IgG(1∶100)，DAB显色。阴性对照为PBS代替一抗，阳性对照为已知SIRPα阳性肝组织。
结果
一、SIRPα在肝癌组织内的表达
SIRPα共有3.9 kb、2.5kb 2个转录子，在42例肝癌组织内分别有27例(64.3%)、32例(76.2%)表达下降(T/N<0.75)；分别有21例(50.0%)、27例(64.3%)表达明显下降(T/N<0.5)。按21例表达明显下降的肿瘤标本进行分析，发现其2.5kb转录子的T/N值(0.21±0.03)显著低于3.9kb转录子的T/N值(0.34±0.07)(t检验，P<0.01)。按27例表达下降的肿瘤标本进行分析，亦有显著差异(图1)。
, 百拇医药
注：N癌旁肝组织；T肿瘤组织；2.5 kb转录子比3.9kb转录子表达下降更为明显
图1 SIRPα在肝癌及癌旁肝组织内的Northern杂交结果
二、肝癌组织中SIRPα表达与病理指标的关系
SIRPα表达与肿瘤直径及癌栓形成有明显相关性。未发现SIRPα表达与肿瘤分化程度、包膜完整性、血清AFP及乙肝感染之间的明确关系(表1)。
表1 SIRPα在肝癌内的表达与肝癌组织病理特征的关系 病理特点
总
例
数
肿瘤内表达
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下降例数
肿瘤内表达
下降百分率
P值
(χ2检验)
3.9kb
转录子
2.5kb
转录子
3.9kb
转录子
2.5kb
转录子
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肿瘤大小
≤5cm
17
5
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41.2
>5cm
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肿瘤分化
Ⅰ～Ⅱ级
10
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40.0
60.0
Ⅲ～Ⅳ级
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53.1
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65.6
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包膜完整
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50.0
>0.05
癌栓形成
有
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18
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75.8
无
13
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乙肝感染
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, 百拇医药 3
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66.7
>0.05
三、免疫组织化学结果
显示，SIRPα在正常肝组织中肝细胞、胆管上皮细胞及Ito细胞内均呈阳性。癌旁肝多为肝硬化，硬化结节中的肝细胞、再生胆管呈阳性。肝癌细胞亦可见阳性表达，表达下降的肝癌组织内可见棕色颗粒变少变淡，部分癌细胞或部分肿瘤区域完全无染色。阳性细胞染色大部分位于细胞膜，部分在胞浆内散在分布(图2，3)。
图2 SIRPα在肝癌(右视野)及癌旁肝(左视野)
, 百拇医药
组织内免疫组织化学结果，肝癌组织阳性颗粒变淡变少 ×100
图3 部分肝癌细胞及区域完全阴性，癌旁肝组织阳性，主要位于细胞膜，少量胞浆内散在分布 ×400
讨论
已知许多生长因子的效应是通过高亲和性受体酪氨酸蛋白激酶(RTK)所介导，直到最近人们才对这一信号传递系统有了更进一步的认识。较为公认的信号途径是：生长因子受体(具有RTK活性)→SHP2→Grb2-SOS→Ras→MAPKKK(Raf)→MAPKK→MAPK(ERK)→生物学效应，SIRPα则通过与SHP-2的结合而可能抑制这一信号传递[1]。众所周知，肿瘤的基因变化涉及到上述信号通路的许多环节，从某种意义上讲，肿瘤的形成是由于信号转导系统失去控制，才导致细胞无限生长，并产生恶性表型。Chen和Kharitonenkow等[1]的体外实验已证明，在共转染v-fms(CSF-1受体突变)及SIRPα的NIH3T3细胞内，观察到SIRPα的表达可以明显抑制v-fms对细胞的转化作用，这为SIRPα在肿瘤细胞信号通路中的潜在作用提供了重要的理论依据。就肝癌来讲，SHP-2上游属RTK的癌基因或异常表达的基因就包括c-fms(CSFIR)、c-erb-2(neu)/c-erb-1(EGFR)、c-met(HGFR),异常表达的生长因子包括IGF-Ⅱ、HGF、TGFα等。因此，SIRPα在肝癌的信号转导途径上的作用意义重大，SIRPα在肿瘤的信号转导途径上究竟发生什么变化，起什么作用是一个令人感兴趣的问题。 我们在实验中发现，肝癌组织内该基因表达下调，推测该基因对肿瘤细胞Ras-MAPK信号通路抑制作用减弱，可能是导致肿瘤细胞生长失去控制的原因之一。其中，2.5kb转录子在肿瘤组织内表达下降更为明显，提示在肿瘤的发生发展过程中起更重要的作用。结合肿瘤病理学特点，发现SIRPα的表达与肿瘤大小明显相关，可见在小肝癌向大肝癌演进中，恶性程度逐渐增高过程中，SIRPα表达有减弱趋势。
, 百拇医药
肝癌的侵袭转移是一个复杂的过程，涉及到细胞粘附、基质降解、细胞迁移等多个环节，细胞粘附是其中的重要步骤。最近，有人发现SIRPα作为一种粘附分子在神经细胞的生长发育中起重要的调控作用[3]，因此可以推断，它可能还和肿瘤的侵袭转移有一定关系。本组资料显示，有癌栓形成的肝癌内SIRPα表达下降率明显高于无癌栓的肝癌，这可能是由于SIRPα表达降低，肝癌细胞间及与基质粘附能力下降，在其它因素的协同作用下，导致肿瘤细胞易于向周围组织移动扩散，形成癌栓。
以上研究结果表明，SIRPα的低表达与肝癌的生长、侵袭密切相关，可能为肝癌发生发展过程中一个重要的负调控因子。
本课题为国家自然科学基金重点资助项目(39870758)
参考文献
[1] Chen ZJ,Kharitonenkow A, Sures I, et al. A famiry of proteins that inhibit signalling through tyrosine kinase receptors.Nature,1997,386:181-186.
, 百拇医药
[2] Siebert PD, Chenchik A. Modified acid granidinium thiocynati-phenol-chloroform RNA extraction method which greatly reduces DNA contamination. Nucl Acid Res,1993,21:2019-2021.
[3] Comu A, Weng W, Olinsky S, et al.The murine P84 neural adhesion molecule is SHPS-1, a member of the phosphatase-binding protein family. J Neurosci, 1997,17:8702.
(收稿：1998-04-15 修回：1999-01-16), http://www.100md.com