人膀胱癌多药耐药细胞株多药蛋白表达的研究
作者：陈忠 章咏裳 李家贵 杨业金 陈刚
单位：430030 武汉，同济医科大学附属同济医院泌尿外科(陈忠、章咏裳、李家贵)，同济医科大学实验医学研究中心分子生物学研究室(杨业金、陈钢)
关键词：
多药耐药性 多药耐药性(multidrug resistance，MDR)是膀胱肿瘤化疗失败的重要原因之一。多药耐药相关蛋白(multidrug-associated resistance protein，MRP)和P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)表达在膀胱肿瘤细胞耐药性中起重要作用。作者采用阿霉素(ADM)和足叶乙甙(VP-16)体外诱导人膀胱癌细胞株BIU-87，获得耐药细胞株BIU-87/A、BIU-87/V，并对其耐药特性、MRP和P-gp表达进行了相应研究。
一、材料与方法
, http://www.100md.com
1.主要试剂、耐药细胞培养及药物耐药性分析见文献[1]。
2.免疫组织化学染色：实验用MRP单克隆抗体QCRL-1由加拿大Susan Cole惠赠[2]，P-gp单克隆抗体C219购自武汉博士得公司。采用博士得公司提供即用型SABC试剂盒进行免疫组织化学染色。采用北京航空大学与中国人民解放军空军总医院联合研制CMIAS真彩色医学图像分析系统检测阳性结果吸光度A值。
3.斑点杂交：含MRP cDNA片段(1 kb)质粒pGEM-3Zf(+)亦由Susan Cole惠赠[3]，含P-gp cDNA片段(1 383 bp)质粒pGEM4由同济医科大学分子生物教研室提供。采用异硫氰酸胍法提取细胞总RNA。按地高辛标记及检测试剂盒步骤中所述方法标记探针并与滤膜上的RNA进行斑点杂交。用MPIAS-500多媒体彩色病理图文分析系统，以0.785 um像素点长，在1.752×105u2测量窗下，测得的积分吸光度值。
, 百拇医药
二、结果
经药物耐药性测定，BIU-87/A、BIU-87/V在培养10个月表现出对ADM、VP-16、VCR和阿糖胞苷等药物的耐药性，对丝裂霉素C、顺铂等药物仍保持一定敏感性。耐药细胞株对9种药物的耐药倍数见表1。
表1 9种药物对BIU-87/A、BIU-87/V细胞对9种
药物的耐药倍数
药物
BIU-87/A
BIU-87/V
足叶乙甙
59.4
5.44
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阿霉素
57.42
6.45
阿糖胞苷
5.25
1.86
长春新碱
5.18
12.41
氮芥
2.88
1.81
丝裂霉素
, 百拇医药
1.67
0.18
顺铂
0.99
0.92
羟基喜树碱
0.89
1.22
噻替派
0.63
1.66
免疫组织化学染色，BIU-87细胞MRP和P-gp蛋白表达均阴性，而BIU-87/A和BIU-87/V两种蛋白表达均阳性，阳性染色位于细胞膜上或细胞浆内，各细胞表达量从弱阳性至强阳性不等。BIU-87/A的MRP和P-gp蛋白表达量均多于BIU-87/V细胞(图1)，其中Y轴代表阳性颗粒颜色深浅度的相对参数，即吸光度A值。
, 百拇医药
图1 MRP和P-gp在BIU-87/A和BIU-87/V细胞中表达
斑点杂交分析，BIU-87、BIU-87/A和BIU-87/V均有MRP和P-gp mRNA表达，但耐药株表达量明显增高，尤以MRP为甚。3组细胞MRP和P-gp mRNA表达斑点杂交图各点吸光度值见图2。
图2 MRP和P-gp mRNA在BIU-87/A和BIU-87/V细胞中表达
三、讨论
MRP和P-gp同属具有ATP结合域的跨膜转运蛋白超家族成员，这个家族成员能量依赖性的转运各种分子通过细胞膜[3]。MRP和P-gp氨基酸序列的同源性为14%，在细胞内及胞膜上均有表达，生理功能尚不清楚，可能与代谢产物或有毒物质转运有关。表达两种蛋白的细胞有相似的耐药谱，如对ADM、表阿霉素、柔红霉素、鬼臼噻吩甙、长春新碱、长春花碱、放线菌素D、秋水仙素等均有耐药，但对烷化剂如丝裂霉素C、氮芥、顺铂、噻替派及喜树碱等则敏感[4]。MRP可以引起细胞内药物外排增加，细胞内药物浓度下降，这种转运作用是可以饱和的，此外还可引起细胞内药物分布发生改变，接触靶位点的药物减少[5]。P-gp主要通过将细胞内化疗药物排出细胞外，导致细胞产生耐药性。
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本实验中，斑点杂交能够检测出BIU-87细胞MRP和P-gp mRNA，但免疫组织化学不能检测出蛋白表达，这可能与MRP、P-gp潜在的生理功能有关。经过ADM、VP-16体外诱导，耐药株BIU-87/A、BIU-87/V细胞的MRP和P-gp及其mRNA水平均明显高于BIU-87细胞，尤以BIU-87/A为甚，这说明在合适的外来因子诱导下，MRP、P-gp表达增强。其中，MRP的增高更为明显，相应的BIU-87/A细胞的耐药程度也强于BIU-87/V细胞。耐药株的耐药谱亦与文献报道相似[3，4]，说明MRP和P-gp的表达在两种耐药细胞株的耐药机制中起重要作用。引起膀胱肿瘤产生耐药性的因素和机制是多方面的，有时可能是多种机制共同作用的结果。本实验为研究MRP和P-gp作用机理和耐药逆转机制提供一个良好的模型。
参考文献
[1] 陈忠，章咏裳，李家贵，等.人膀胱癌耐药细胞系BIU-87/A、BIU-87/V的建立及耐药分析.同济医科大学学报，1999，28：68-70.
, http://www.100md.com
[2] Hipfner DR, Gauldie SD, Deeley RG, et al. Detection of the Mr 190,000 multidrug resistance protein, MRP, with monoclonal antibodies. Cancer Res,1994,54:5788-5792.
[3] Cole SPC, Bhardwaj G, Gerlacg JH, et al. Overexpression of a transporter gene in a multidrug-resistance human lung cancer cell line. Science, 1992,258:1650-1655.
[4] Hasegawa S, Abe T, Natio S, et al.Expression of multidurg-associated protein(MRP), MDR1 and DNA topoisomerase in human multidurg-resistant bladder cancer cell lines. Br J Cancer,1995,71:907-913.
[5] Versantoort CHM, Broxteman HJ, Bagrij T, et al. Regulation by glutathione of drug transport in multidrug-resistant human lung tumor cell lines overexpressing multidrug resistance-associated. Br J Cancer,1995,72:82-89.
(收稿：1998-04-24 修回：1998-12-16), http://www.100md.com
单位：430030 武汉，同济医科大学附属同济医院泌尿外科(陈忠、章咏裳、李家贵)，同济医科大学实验医学研究中心分子生物学研究室(杨业金、陈钢)
关键词：
多药耐药性 多药耐药性(multidrug resistance，MDR)是膀胱肿瘤化疗失败的重要原因之一。多药耐药相关蛋白(multidrug-associated resistance protein，MRP)和P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)表达在膀胱肿瘤细胞耐药性中起重要作用。作者采用阿霉素(ADM)和足叶乙甙(VP-16)体外诱导人膀胱癌细胞株BIU-87，获得耐药细胞株BIU-87/A、BIU-87/V，并对其耐药特性、MRP和P-gp表达进行了相应研究。
一、材料与方法
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1.主要试剂、耐药细胞培养及药物耐药性分析见文献[1]。
2.免疫组织化学染色：实验用MRP单克隆抗体QCRL-1由加拿大Susan Cole惠赠[2]，P-gp单克隆抗体C219购自武汉博士得公司。采用博士得公司提供即用型SABC试剂盒进行免疫组织化学染色。采用北京航空大学与中国人民解放军空军总医院联合研制CMIAS真彩色医学图像分析系统检测阳性结果吸光度A值。
3.斑点杂交：含MRP cDNA片段(1 kb)质粒pGEM-3Zf(+)亦由Susan Cole惠赠[3]，含P-gp cDNA片段(1 383 bp)质粒pGEM4由同济医科大学分子生物教研室提供。采用异硫氰酸胍法提取细胞总RNA。按地高辛标记及检测试剂盒步骤中所述方法标记探针并与滤膜上的RNA进行斑点杂交。用MPIAS-500多媒体彩色病理图文分析系统，以0.785 um像素点长，在1.752×105u2测量窗下，测得的积分吸光度值。
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二、结果
经药物耐药性测定，BIU-87/A、BIU-87/V在培养10个月表现出对ADM、VP-16、VCR和阿糖胞苷等药物的耐药性，对丝裂霉素C、顺铂等药物仍保持一定敏感性。耐药细胞株对9种药物的耐药倍数见表1。
表1 9种药物对BIU-87/A、BIU-87/V细胞对9种
药物的耐药倍数
药物
BIU-87/A
BIU-87/V
足叶乙甙
59.4
5.44
, http://www.100md.com
阿霉素
57.42
6.45
阿糖胞苷
5.25
1.86
长春新碱
5.18
12.41
氮芥
2.88
1.81
丝裂霉素
, 百拇医药
1.67
0.18
顺铂
0.99
0.92
羟基喜树碱
0.89
1.22
噻替派
0.63
1.66
免疫组织化学染色，BIU-87细胞MRP和P-gp蛋白表达均阴性，而BIU-87/A和BIU-87/V两种蛋白表达均阳性，阳性染色位于细胞膜上或细胞浆内，各细胞表达量从弱阳性至强阳性不等。BIU-87/A的MRP和P-gp蛋白表达量均多于BIU-87/V细胞(图1)，其中Y轴代表阳性颗粒颜色深浅度的相对参数，即吸光度A值。
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图1 MRP和P-gp在BIU-87/A和BIU-87/V细胞中表达
斑点杂交分析，BIU-87、BIU-87/A和BIU-87/V均有MRP和P-gp mRNA表达，但耐药株表达量明显增高，尤以MRP为甚。3组细胞MRP和P-gp mRNA表达斑点杂交图各点吸光度值见图2。
图2 MRP和P-gp mRNA在BIU-87/A和BIU-87/V细胞中表达
三、讨论
MRP和P-gp同属具有ATP结合域的跨膜转运蛋白超家族成员，这个家族成员能量依赖性的转运各种分子通过细胞膜[3]。MRP和P-gp氨基酸序列的同源性为14%，在细胞内及胞膜上均有表达，生理功能尚不清楚，可能与代谢产物或有毒物质转运有关。表达两种蛋白的细胞有相似的耐药谱，如对ADM、表阿霉素、柔红霉素、鬼臼噻吩甙、长春新碱、长春花碱、放线菌素D、秋水仙素等均有耐药，但对烷化剂如丝裂霉素C、氮芥、顺铂、噻替派及喜树碱等则敏感[4]。MRP可以引起细胞内药物外排增加，细胞内药物浓度下降，这种转运作用是可以饱和的，此外还可引起细胞内药物分布发生改变，接触靶位点的药物减少[5]。P-gp主要通过将细胞内化疗药物排出细胞外，导致细胞产生耐药性。
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本实验中，斑点杂交能够检测出BIU-87细胞MRP和P-gp mRNA，但免疫组织化学不能检测出蛋白表达，这可能与MRP、P-gp潜在的生理功能有关。经过ADM、VP-16体外诱导，耐药株BIU-87/A、BIU-87/V细胞的MRP和P-gp及其mRNA水平均明显高于BIU-87细胞，尤以BIU-87/A为甚，这说明在合适的外来因子诱导下，MRP、P-gp表达增强。其中，MRP的增高更为明显，相应的BIU-87/A细胞的耐药程度也强于BIU-87/V细胞。耐药株的耐药谱亦与文献报道相似[3，4]，说明MRP和P-gp的表达在两种耐药细胞株的耐药机制中起重要作用。引起膀胱肿瘤产生耐药性的因素和机制是多方面的，有时可能是多种机制共同作用的结果。本实验为研究MRP和P-gp作用机理和耐药逆转机制提供一个良好的模型。
参考文献
[1] 陈忠，章咏裳，李家贵，等.人膀胱癌耐药细胞系BIU-87/A、BIU-87/V的建立及耐药分析.同济医科大学学报，1999，28：68-70.
, http://www.100md.com
[2] Hipfner DR, Gauldie SD, Deeley RG, et al. Detection of the Mr 190,000 multidrug resistance protein, MRP, with monoclonal antibodies. Cancer Res,1994,54:5788-5792.
[3] Cole SPC, Bhardwaj G, Gerlacg JH, et al. Overexpression of a transporter gene in a multidrug-resistance human lung cancer cell line. Science, 1992,258:1650-1655.
[4] Hasegawa S, Abe T, Natio S, et al.Expression of multidurg-associated protein(MRP), MDR1 and DNA topoisomerase in human multidurg-resistant bladder cancer cell lines. Br J Cancer,1995,71:907-913.
[5] Versantoort CHM, Broxteman HJ, Bagrij T, et al. Regulation by glutathione of drug transport in multidrug-resistant human lung tumor cell lines overexpressing multidrug resistance-associated. Br J Cancer,1995,72:82-89.
(收稿：1998-04-24 修回：1998-12-16), http://www.100md.com